一種從中藥材中提取常用中藥并用maldi-tof-ms鑒定的方法
【專利摘要】一種從中藥材中提取常用中藥并用MALDI-TOF-MS鑒定的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明對(duì)中藥材進(jìn)行高速粉碎并提取了中藥材總蛋白和多肽，透析除鹽后用MALDI-TOF-MS檢測(cè)得到了中藥材蛋白質(zhì)圖譜。本發(fā)明應(yīng)用簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)提取技術(shù)結(jié)合Malditof鑒定了常用中藥材黃芪、人參、甘草的蛋白質(zhì)圖譜，本發(fā)明方法具有簡(jiǎn)易、可靠的特點(diǎn)，為鑒定常用的中藥材提供了選擇和參考。
【專利說明】—種從中藥材中提取常用中藥并用MALD1-TOF-MS鑒定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從中藥材中提取常用中藥并用MALD1-T0F-MS鑒定的方法，具體涉及一種應(yīng)用Malditof鑒定常用中藥材黃芪、人參、甘草的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]中藥材是中藥飲片、中藥提取物和中成藥的原料，它的前端是藥用植物、藥用動(dòng)物、藥用礦物及其特定的藥用部位，或者 稱為中藥材的基原。中藥材的準(zhǔn)確鑒定是中醫(yī)藥事業(yè)運(yùn)行和發(fā)展的基本環(huán)節(jié)，一直備受關(guān)注。國家相關(guān)藥材標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)分類學(xué)研究將來源物種確認(rèn)，限定了藥用部位，基本澄清了混亂。然而，藥材市場(chǎng)處于動(dòng)態(tài)變化中，一些重要藥物資源存在假冒偽劣現(xiàn)象，同時(shí)基原變化和新的藥材類型不斷出現(xiàn)，不同產(chǎn)地的中藥材存在差異，鑒定研究工作仍不能松懈。
[0003]隨著中藥研究的深入以及科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前已有幾類用于鑒定中藥材的新技術(shù)。第一類為化學(xué)鑒定技術(shù)。中藥化學(xué)鑒定的物質(zhì)基礎(chǔ)是其所含的化學(xué)成分組。中藥材所含成分復(fù)雜多樣，化學(xué)鑒定通常選擇少數(shù)具特征的化學(xué)成分，或者以化學(xué)成分的整體構(gòu)成特點(diǎn)作為鑒定依據(jù)。隨著色譜分離、分析技術(shù)的發(fā)展，HPLC，GC，HPCE等方法及與光譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，可更精細(xì)和準(zhǔn)確地反映中藥材化學(xué)組分?jǐn)?shù)和量等特征，成為中藥材鑒定和質(zhì)量控制的有效方法。第二類為分子鑒定技術(shù)。主要是針對(duì)DNA分子和蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定?；谛蛄蟹治龅腄NA條形碼技術(shù)是目前影響較大、應(yīng)用較廣泛的DNA鑒定技術(shù)。與其他分子鑒定方法相比，DNA條形碼鑒定具有三大優(yōu)勢(shì):鑒定結(jié)果可重復(fù)性良好；方法通用性強(qiáng)；可構(gòu)建統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫和鑒定平臺(tái)，易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化。
[0004]針對(duì)蛋白的鑒定技術(shù)主要有蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、ELISA檢測(cè)技術(shù)、蛋白飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定技術(shù)。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorptionionization-time of flight massspectrometry, MALD1-TOF-MS)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種軟電離新型有機(jī)質(zhì)譜，通過引入基質(zhì)分子，使待測(cè)分子不產(chǎn)生碎片，解決了非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性生物大分子解吸離子化的問題。MALD1-T0F-MS具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、分辨率高、圖譜簡(jiǎn)明、質(zhì)量范圍廣及速度快等特點(diǎn)，在測(cè)定多肽、蛋白質(zhì)和合成高聚物應(yīng)用方面有特殊的優(yōu)越性。
[0005]目前MALD1-T0F-MS在微生物鑒定方面已經(jīng)取得較為成功的應(yīng)用，然而在中藥材鑒定方面的應(yīng)用還相對(duì)較少。中藥材也有較多的蛋白質(zhì)組分，相同品種的中藥材在蛋白組成上既有一些保守性的成分也有受到產(chǎn)地等因素影響的不同成分。因此應(yīng)用MALD1-T0F-MS收集不同中藥材、相同品種不同產(chǎn)地的中藥材的質(zhì)譜圖既可以對(duì)中藥材進(jìn)行評(píng)價(jià)又可以用于鑒定。本發(fā)明應(yīng)用蛋白質(zhì)提取技術(shù)結(jié)合樣品處理方法應(yīng)用MALD1-T0F-MS收集了常見中藥材黃芪、甘草、人參的質(zhì)譜圖，為其鑒定提供了選擇和參考。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是建立一種鑒定常用中藥材黃芪、人參、甘草的方法，為鑒定常用的中藥材提供了選擇和參考。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明對(duì)中藥材進(jìn)行高速粉碎并提取了中藥材總蛋白和多肽，透析除鹽后用MALD1-T0F-MS檢測(cè)得到了中藥材蛋白質(zhì)圖譜。
[0008]一種從中藥材中提取常用中藥的方法，步驟為:取中藥材樣品經(jīng)過立式高速粉碎機(jī)粉碎，然后取4g粉末樣品按照1:10的質(zhì)量體積比例用含50mM NaCl, pH 8.0 25mMTris-HCl緩沖液溶解，50°C水浴浸提4h ;隨后8000 rpm離心30min，取上清液，用15mL離心超濾管濃縮樣品到體積為lmL，其截?cái)喾肿恿繛?KD，樣品用純水透析2天，即得到中藥材中常用中藥的總蛋白和多肽。
[0009]所述常用中藥為黃芪、人參或甘草。
[0010]所述從中藥材中提取的常用中藥用Malditof鑒定的方法，步驟為:將中藥材中提取常用中藥的總蛋白和多肽按照常規(guī)蛋白的上樣方法上樣，即取I μ L點(diǎn)在Malditof靶上，等其自然干燥后取I μ L TA基質(zhì)液覆蓋在樣品上，自然干燥后上樣檢測(cè)，得到常用中藥的圖
[0011]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供的應(yīng)用Malditof鑒定常用中藥材黃芪、人參、甘草的方法，采用了高速粉碎方法對(duì)中藥材進(jìn)行處理并結(jié)合簡(jiǎn)單的溶液浸提方法提取了中藥材的總蛋白和多肽，透析后即可用Malditof得到樣品的蛋白質(zhì)和多肽的圖譜，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材的鑒定。與其它方法相比具有操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、方法通用性強(qiáng)的特點(diǎn)；與0嫩條形碼技術(shù)類似可構(gòu)建 統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫和鑒定平臺(tái)，易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖l_a內(nèi)蒙的黃芪的Malditof質(zhì)譜圖。
[0013]圖Ι-b蘇州的黃芪的Malditof質(zhì)譜圖。
[0014]圖Ι-c甘肅的黃芪的Malditof質(zhì)譜圖。
[0015]圖2-a內(nèi)蒙的甘草的Malditof質(zhì)譜圖。
[0016]圖2-b甘肅隴西甘草的Malditof質(zhì)譜圖。
[0017]圖2-c新疆的甘草的Malditof質(zhì)譜圖。
[0018]圖3_a東北生曬參的Malditof質(zhì)譜圖。
[0019]圖3-b美國花旗參的Malditof質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0021]實(shí)施例1 儀器:
基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(ultrafle Xtreme MALD1-T0F-MS)，德國布魯
克；
YS-04小型高速粉碎機(jī)，北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司；
70mm (MD77)透析袋，Cutoff 為 3KDa，USA ；
TGL-40B臺(tái)式低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；KFLOff純水機(jī)，凱佛隆公司；
ZD-9556水平搖床，太倉科教器材廠；
可調(diào)試移液器，Thermo Labsystems公司；
渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠。
[0022]二、試劑:Tris base, Sigma-Aldrich ;其他試劑均為分析純?cè)噭?br> [0023]三、步驟，以中藥黃芪為例
1、中藥材樣品處理和蛋白質(zhì)提取
取15g切片后的干燥黃芪，經(jīng)過立式高速粉碎機(jī)粉碎。取4g粉末樣品按照1:10的質(zhì)量體積比例用含50mM NaCl.pH 8.0 25mM Tris-HCl緩沖液溶解，50°C水浴浸提4h。8000 rpm離心30min,取上清,用15mL離心超濾管(mi 11 ipore,截?cái)喾肿恿繛?KDa)濃縮樣品到體積為lmL。樣品用純水透析(截?cái)喾肿恿繛?KD) 透析2天，除去鹽離子，得黃芪的總蛋白和多肽。
[0024]2、Malditof鑒定常用中藥材
將中藥材中提取的常用中藥的總蛋白和多肽按照常規(guī)蛋白的上樣方法上樣，即取I μ L點(diǎn)在Malditof靶上，等其自然干燥后取I μ L TA基質(zhì)液覆蓋在樣品上，自然干燥后上樣檢測(cè)，得到常用中藥的圖譜。
[0025]按照上述步驟提總蛋白和多肽后用Malditof鑒定得到的內(nèi)蒙、蘇州及甘肅的黃芪的Malditof質(zhì)譜圖分別如圖Ι-a、圖l_b及圖l_c所示；內(nèi)蒙、甘肅隴西及新疆的甘草的Malditof質(zhì)譜圖如圖2_a、圖2_b及圖2_c所示；東北及美國的人參的Malditof質(zhì)譜圖如圖3_a及圖3_b所不。
【權(quán)利要求】
1.一種從中藥材中提取常用中藥的方法，其特征在于步驟為:取中藥材樣品經(jīng)過立式高速粉碎機(jī)粉碎，然后取4g粉末樣品按照1:10的質(zhì)量體積比例用含50mM NaCl, pH 8.025mM Tris-HCl緩沖液溶解，50°C水浴浸提4h ;隨后8000 rpm離心30min，取上清液，用15mL離心超濾管濃縮樣品到體積為lmL，其截?cái)喾肿恿繛?KD，樣品用純水透析2天，即得到中藥材中常用中藥的總蛋白和多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述從中藥材中提取常用中藥的方法，其特征在于:所述常用中藥為黃芪、人參或甘草。
3.權(quán)利要求1所述方法從中藥材中提取的常用中藥用Malditof鑒定的方法，其特征在于步驟為:將中藥材中提取常用中藥的總蛋白和多肽按照常規(guī)蛋白的上樣方法上樣，即取I U L點(diǎn)在Malditof祀上,等其自然干燥后取I μ L TA基質(zhì)液覆蓋在樣品上，自然干燥后上樣檢測(cè)，得到常用中藥的圖譜。
【文檔編號(hào)】A61K38/00GK104000857SQ201410260787
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】馬偉, 胥傳來, 王文彬, 匡華, 徐麗廣, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請(qǐng)人:江南大學(xué)