專利名稱：用作疫苗的肺炎球菌膽堿結(jié)合蛋白衍生物的制作方法
本申請要求對1998年5月15日申請的美國臨時專利申請序號60/085,743以及1998年4月7日申請的美國臨時專利申請序號60/080,878的權(quán)益。
本發(fā)明一般涉及細(xì)菌抗原以及其應(yīng)用的領(lǐng)域，例如在人和動物體內(nèi)用作免疫原劑以刺激免疫反應(yīng)。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明涉及用多肽接種哺乳動物物種，以作為刺激保護疫苗接受者免受致病細(xì)菌物種感染的抗體產(chǎn)生的機制，其中所述多肽包含由膽堿結(jié)合多肽獲得的形成α-螺旋的多肽。此外，關(guān)于診斷和治療這樣的肺炎球菌感染，本發(fā)明涉及在診斷和被動免疫治療中使用的針對這樣的多肽的抗體和拮抗劑。
在一個具體的方面，本發(fā)明涉及預(yù)防和治療由肺炎球菌細(xì)菌引起的肺炎球菌感染，如中耳感染、鼻咽感染、肺和支氣管區(qū)域的感染、血液感染、CSF感染等等。在這一方面，某些肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)類型特別有意義。
肺炎鏈球菌是格蘭氏陽性細(xì)菌，是動物和人體內(nèi)侵襲性感染(如膿毒、腦膜炎、中耳炎和大葉性肺炎)的主要病原體(Tuomanen等人，NEJM 322:1280-1284(1995))。作為感染過程的一部分，肺炎球菌通過以凝集素樣的方式結(jié)合真核生物的多糖而容易地結(jié)合到上呼吸道和下呼吸道的非炎癥人體上皮細(xì)胞上(Cundell等人，Micro.Path.17:361-374(1994))。結(jié)合的細(xì)菌轉(zhuǎn)化為侵襲性肺炎球菌感染可能涉及炎癥因子的局部產(chǎn)生，其中所述炎癥因子可激活上皮細(xì)胞以改變在它們表面受體數(shù)目和類型(Cundell等人，Nature,377:435-438(1995))。顯然，肺炎球菌細(xì)菌結(jié)合一種這樣的受體，即血小板活化因子(PAF)，并在PAF出現(xiàn)后非常短的時間內(nèi)(幾分鐘)，肺炎球菌顯示急劇增強的粘附并侵襲組織。已經(jīng)顯示某些可溶性受體類似物阻止肺炎球菌感染的進程(Idanpaan-Heikkila等人，J.Inf.Dis.,176:704-712(1997))。
在肺炎球菌的表面存在非共價結(jié)合磷酸膽堿的膽堿結(jié)合蛋白(CBP)家族，并且該家族的膽堿結(jié)合蛋白非共價地結(jié)合磷壁酸或脂磷壁酸質(zhì)。該家族的一個例子是膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)，即一種分子量約75kD類型的CBP，該蛋白包括一個單一N端結(jié)構(gòu)域、一個脯氨酸豐富區(qū)以及一個包含負(fù)責(zé)結(jié)合膽堿的多20氨基酸重復(fù)的C端結(jié)構(gòu)域。CbpA蛋白類的N端部分的一個區(qū)段形成作為該蛋白三維結(jié)構(gòu)一部分的α-螺旋。
因此，本發(fā)明目的是提供對肺炎球菌感染有廣泛保護的多肽。
定義為便于理解下面的描述以及隨后的實施例，將描述某些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)粒”用前面和/或后面帶有大寫字母和/或數(shù)字的小寫字母p表示。本文的起始質(zhì)粒或者是商業(yè)上可得到的、或者是在無限制的基礎(chǔ)上可作為公共物品得到、或者是根據(jù)已公開的方法可以由可得到的質(zhì)粒構(gòu)建。此外，與所述這些質(zhì)粒同等的質(zhì)粒是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，并且對于一般熟練技術(shù)人員是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用僅作用于DNA上某些序列的限制酶來酶促切割所述DNA。本文所用的各種限制酶是商業(yè)上可得到的，并且它們的反應(yīng)條件、輔因子和其它要求按照一般熟練技術(shù)人員所知道的使用。為分析目的，通常在約20μl緩沖液中將1μg質(zhì)?；駾NA片段與約2單位酶使用。為分離DNA片段以構(gòu)建質(zhì)粒的目的，通常在更大的體積中用20到250單位酶消化5到50μg DNA。對于具體限制酶的合適緩沖液和底物量由生產(chǎn)廠家指定。通常使用在37℃中約1小時的溫育時間，但可以根據(jù)供應(yīng)商的說明而有所變化。消化之后，直接將反應(yīng)產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離所需片段。
如Goeddel,D.等人，Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)所述，使用8％聚丙烯酰胺凝膠進行切割片段的大小分離。
“寡核苷酸”是指可以是化學(xué)合成的或者單鏈多脫氧核苷酸，或者兩條互補的多脫氧核苷酸鏈。這樣的合成寡核苷酸沒有5’磷酸，因此在沒有用ATP在激酶存在下加入磷酸時，不能連接到另一個寡核苷酸上。合成的寡核苷酸將連接到?jīng)]有去磷酸化的片段上。
“連接”指在兩個雙鏈核酸片段間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis,T.等人，同上，第146頁)。除非特別指出，否則使用已知的緩沖液和條件，以及10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)每0.5μg約等摩爾量的要連接的DNA片段完成連接。
如本文所用，“HPS部分”指如SEQ ID NO:2所陳述的肺炎球菌的膽堿結(jié)合蛋白(“CBP”)中的氨基酸序列，該序列可能位于就這樣的CBP的總體氨基酸序列的富含脯氨酸部分的氨基端。
本申請中所用的術(shù)語“同一性”、“％同一性”或“百分同一性”指兩個連續(xù)序列間的差異計算結(jié)果，所述兩個序列已經(jīng)根據(jù)“最適合”進行序列對比(以提供匹配的相同對應(yīng)序列元件的最大數(shù)目，其中元件或者是核苷酸，或者是氨基酸)，并且所有個體差異都被認(rèn)為是關(guān)于同一性的個體差異。在這一方面，在計算兩序列間的總差異數(shù)目時，在參考序列長度上的所有個體元件缺口(由起始序列(“參考序列”)的插入或缺失引起)以及不同元件的個別取代(就參考序列的個別元件而言)都被認(rèn)為是個體差異。當(dāng)已經(jīng)改變起始序列(參考序列)以獲得變異序列(比較序列)，或當(dāng)僅將新序列(比較序列)與這樣的參考序列進行序列匹配和比較時，可以比較兩序列間的個體差異。當(dāng)比較兩個匹配的序列時，為同一性的目的，在兩個序列上由在參考序列的長度上進行“最適合”匹配引起的所有個別缺口都被認(rèn)為是個體差異。假如存在滿足所陳述的最小同一性的匹配，那么該序列就與參考序列具有所陳述的最小同一性。例如，下面是兩個各具有100個元件的序列就最適合進行匹配的假設(shè)比較，其中一個序列被當(dāng)作“參考序列”，而另一個作為比較序列。在參考序列的長度上計數(shù)兩個序列上所有個別匹配缺口，并將這個數(shù)目加到比較序列上個別元件取代變化(不同的匹配元件)的數(shù)目上，得出元件差異的總數(shù)。差異總數(shù)(例如7個缺口和3個取代)除以參考序列長度上元件的總數(shù)(100個元件)，得到“差異百分比”(10/100)。將得到的差異百分比(10％)從100％同一性中減去，得到“％同一性”為90％同一性。為計算同一性，在兩個進行最適合序列比較的序列的不連續(xù)比較長度上(參考序列的長度)研究兩個序列上的所有個別差異以確定同一性。因此，這樣的同一性計算不需要算法。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“分離的”就多肽和/或多核苷酸而言是指所述材料從它的原始環(huán)境(如，假如它是天然存在的話，就是指自然環(huán)境)中取出。例如，存在于活的生物體內(nèi)的天然出現(xiàn)的多核苷酸或多肽不是分離的，但與天然系統(tǒng)中部分或所有共存在的材料分開的同樣的多核苷酸或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，并且由于這樣的載體或組合物不是其天然環(huán)境中的一部分，這樣的多核苷酸或多肽仍然是分離的。本發(fā)明的多肽和多核苷酸最好以分離的形式提供，并且最好純化到同質(zhì)性。
發(fā)明概述在一個方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防肺炎球菌細(xì)菌感染的疫苗，該疫苗利用肺炎球菌表面結(jié)合蛋白、類似物或變異體的至少一種多肽截短物作為免疫原，其中所述多肽截短物具有就不同肺炎球菌細(xì)菌類型而言高度保守的免疫原性α-螺旋部分(一般相當(dāng)于SEQID NO:1中所示的“共有”氨基酸序列)，并且所述多肽并不包含膽堿結(jié)合部分。這樣的多肽最好缺失C端膽堿結(jié)合部分。更優(yōu)選的是這樣的多肽在所述多肽中還缺失HPS氨基酸序列。甚至更優(yōu)選的是這樣的多肽在所述多肽中一般對應(yīng)于SEQ ID NO:1中陳述的“共有”氨基酸序列的高度保守免疫原性α-螺旋部分還一般相當(dāng)于SEQ IDNO:19中陳述的氨基酸序列(SEQ ID NO:19的氨基酸1到103與SEQID NO:1的氨基酸1到103相同)。此外，優(yōu)選作為疫苗的是缺失HPS部分以及膽堿結(jié)合部分的重組產(chǎn)生的分離的多肽。
更優(yōu)選作為疫苗的是肺炎球菌表面結(jié)合蛋白、類似物或變異體的一種或多種多肽截短物，其中所述多肽截短物包括單個就不同肺炎球菌細(xì)菌類型而言高度保守的α-螺旋免疫原性部分，并且所述多肽并不包含C端膽堿結(jié)合部分。更加優(yōu)選的是具有這樣結(jié)構(gòu)的分離的重組產(chǎn)生的多肽。另外優(yōu)選的是這樣的多肽該多肽不包括C端膽堿結(jié)合部分或者不包括HPS部分。
本發(fā)明還提供了包括多肽的疫苗，所述多肽包含能夠形成α-螺旋的免疫原性部分，其中所述多肽包括與SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少85％同一性、最好至少87％同一性的序列，其中所述分離的多肽不包含C端膽堿結(jié)合部分。還優(yōu)選的是這樣的多肽該多肽包含與依照SEQ ID NO:19的氨基酸序列有至少85％同一性、最好至少87％同一性的多肽序列。所述分離多肽的序列最好既不包含HPS部分(SEQ ID NO:2)，也不包含C端膽堿結(jié)合部分。另外優(yōu)選的是具有這樣結(jié)構(gòu)的分離的重組產(chǎn)生的多肽。尤其設(shè)想了對應(yīng)于不同肺炎鏈球菌類型的α-螺旋結(jié)構(gòu)的這樣的多肽。尤其優(yōu)選的是這樣的肺炎鏈球菌細(xì)菌的血清型1-5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F。這樣的細(xì)菌血清型的例子可以容易地從標(biāo)準(zhǔn)ATCC目錄得到。
另一方面，本發(fā)明還提供了對抗肺炎鏈球菌的疫苗，該疫苗包括具有多種α-螺旋部分的合成或重組的多肽，其中每一個α-螺旋部分都得自不同的天然出現(xiàn)的肺炎鏈球菌膽堿結(jié)合多肽，其中這樣的α-螺旋部分與SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少85％的同一性，并且其中所述分離的多肽不包含膽堿結(jié)合部分。更優(yōu)選的是那些其中α-螺旋區(qū)域的氨基酸序列與SEQ ID NO:19的氨基酸序列至少85％相同的多肽。這樣的合成多肽最好既不包含HPS部分，也不包含C端膽堿結(jié)合部分。本發(fā)明也考慮和利用了這樣的鏈結(jié)構(gòu)多肽的類似物和變異體，其中這樣的α-螺旋部分可以是合成的變異體氨基酸序列(或者可以是天然出現(xiàn)的序列和變異體序列的混合物)。在一個優(yōu)選的方面，提供了具有至少十種不同的對應(yīng)于肺炎鏈球菌血清型1-5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F的α-螺旋結(jié)構(gòu)的鏈疫苗多肽(chain vaccinepolypeptides)。更優(yōu)選的是包括至少十五種這樣的α-螺旋結(jié)構(gòu)的多肽，更優(yōu)選包括至少20種這樣的α-螺旋結(jié)構(gòu)的多肽，更優(yōu)選的是包括至少一種對應(yīng)于肺炎鏈球菌血清型1-5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F中每一種的α-螺旋結(jié)構(gòu)的多肽。另一個優(yōu)選的多肽包括得自對應(yīng)于SEQ ID NO:1的SEQ ID NOS:3-18的氨基酸序列的每一種α-螺旋結(jié)構(gòu)。
在另一方面，本發(fā)明涉及由抗多肽的抗體配制的被動免疫疫苗，所述多肽包括就不同肺炎球菌細(xì)菌類型而言高度保守的免疫原性部分，所述部分能夠形成與SEQ ID NO:1的氨基酸序列有前面所述同一性的α-螺旋，所述多肽不包含C端膽堿結(jié)合部分，其中所述抗體將結(jié)合至少一種肺炎鏈球菌物種。如果這樣的多肽是天然肺炎球菌表面結(jié)合蛋白的截短物，那么這樣的多肽最好缺失它的HPS部分(如果可應(yīng)用)以及它的膽堿結(jié)合部分?？梢岳眠@樣的被動免疫疫苗在無免疫應(yīng)答的患者、具有不成熟免疫系統(tǒng)的患者(如年輕的兒童)或正感染的患者中預(yù)防和/或治療肺炎球菌感染。如此，依照本發(fā)明的另一方面，可以由合成或重組的多肽產(chǎn)生疫苗，其中所述多肽包括兩種或更多種不同的肺炎鏈球菌膽堿結(jié)合多肽的保守α-螺旋部分。
本發(fā)明還一般涉及使用分離的多肽在非人類哺乳動物物種內(nèi)產(chǎn)生抗體以用于，例如，診斷試劑和疫苗，所述多肽具有就不同肺炎球菌細(xì)菌類型而言高度保守、能夠形成α-螺旋(一般對應(yīng)于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:19)的免疫原性部分，其中所述分離的多肽不包括膽堿結(jié)合部分。
在又一個方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生多肽的方法，所述多肽具有就不同肺炎球菌細(xì)菌類型而言高度保守的能夠形成α-螺旋的免疫原性部分，該部分的序列一般對應(yīng)于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，其中所述分離的多肽不包括膽堿結(jié)合部分。這樣的重組產(chǎn)生最好具有截短的天然肺炎球菌表面結(jié)合多肽，其中所述多肽同時缺失HPS部分(如果可應(yīng)用)以及膽堿結(jié)合部分。
在再一方面，本發(fā)明提供了分離的膽堿結(jié)合多肽，其中這樣的多肽的非膽堿結(jié)合區(qū)與天然出現(xiàn)的肺炎球菌膽堿結(jié)合蛋白的對應(yīng)氨基酸序列部分有至少90％的同一性，其中所述天然出現(xiàn)的肺炎球菌膽堿結(jié)合蛋白的對應(yīng)氨基酸序列部分是由SEQ ID NOS:3-18選出的一員。本發(fā)明涉及這樣的多肽的片段，所述片段至少包括一般對應(yīng)于SEQ ID NO:1的保守α-螺旋部分，并與其有至少85％的同一性，其中所述分離的多肽最好缺失膽堿結(jié)合區(qū)。
在另一方面，本發(fā)明提供了分離的多肽，所述多肽包含與由SEQID NOS:3-18選出的其中一種氨基酸序列有至少90％同一性的氨基酸序列。這樣的分離多肽最好包含與由SEQ ID NOS:3-18選出的其中一種氨基酸序列有至少95％同一性、更優(yōu)選有至少97％同一性的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及這樣的多肽的片段。
在又一方面，本發(fā)明提供了由多核苷酸編碼的肺炎鏈球菌CBP多肽，其中所述多核苷酸能夠在高嚴(yán)格條件下與編碼具有由SEQ IDNOS:1和3-18選出的氨基酸的多肽的多核苷酸的互補物雜交。尤其優(yōu)選的是這樣的多肽所述多肽包含與SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列區(qū)段。更優(yōu)選的是這樣的多肽所述多肽包含就SEQ ID NO:1的氨基酸序列而言有至少95％同一性的連續(xù)氨基酸序列。甚至更優(yōu)選的是這樣的多肽所述多肽包含就SEQ IDNO:1的氨基酸序列而言有至少97％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本發(fā)明提供了編碼上面描述的本發(fā)明的多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成的DNA。所述DNA可以是雙鏈或單鏈的，如果是單鏈的話可以是編碼鏈或非編碼鏈(反義鏈)。所述編碼包括SEQ ID NOS:3-18中至少一種氨基酸序列的多肽(或與這樣的多肽的氨基酸序列有至少90％同一性的多肽)的多核苷酸可以是SEQID NOS:20-35所示編碼序列的其中一種，或者由于遺傳密碼的豐余性和簡并性，是編碼序列與SEQ ID NOS:20-35的DNA編碼同樣多肽的不同編碼序列。
編碼SEQ ID NOS:3-18的多肽的多核苷酸可以包括僅是所述多肽的編碼序列；所述多肽的編碼序列(可選地可以是添加的編碼序列)以及非編碼序列，如內(nèi)含子或所述多肽的編碼序列的5’和/或3’的非編碼序列。所編碼的多肽可以僅包括單個α-螺旋部分或包括多個α-螺旋部分，并且可以單獨或共同包括這樣的α-螺旋區(qū)域5’的N端序列和/或?qū)?yīng)于“X”結(jié)構(gòu)或脯氨酸豐富區(qū)域的序列(例如，如

圖1所陳述)。
本發(fā)明還涉及這樣的多核苷酸所述多核苷酸包含與編碼包含SEQ ID NOS:3-18的多肽中的一種的多核苷酸有至少95％的同一性，最好有至少97％的同一性多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及這樣的多核苷酸的片段所述片段至少包括編碼對應(yīng)于SEQ ID NO:1的多肽序列的多核苷酸部分。
因此，術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”包含僅包括所述多肽的編碼序列的多核苷酸，以及包括額外的編碼序列和/或非編碼序列的多核苷酸。所述多肽尤其可以包括圖1中圖解陳述的任何一種結(jié)構(gòu)類型或所有結(jié)構(gòu)類型。
本發(fā)明還涉及上面所述多核苷酸的變異體，其中所述多核苷酸編碼包括SEQ ID NOS:3-18的氨基酸序列的多肽的片段、類似物和衍生物。所述多核苷酸的變異體可以是所述多核苷酸天然出現(xiàn)的等位變異體或所述多核苷酸的非天然出現(xiàn)的變異體?？梢岳眠@樣的編碼多核苷酸的互補物分離編碼同樣或相似多肽的多核苷酸。這樣的方法尤其用于獲得來自不同肺炎球菌血清型的α-螺旋編碼區(qū)段，其中所述編碼區(qū)段在產(chǎn)生包含多種α-螺旋區(qū)段的“鏈”多肽疫苗中特別有用。
因此，本發(fā)明包括編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包括如序列表中SEQ ID NOS:3-18所示的同樣多肽，本發(fā)明還包括這樣的多核苷酸的變異體，其中所述變異體編碼SEQ ID NOS:3-18的多肽的片段、衍生物或類似物。這樣的核苷酸變異體包括缺失變異體、取代變異體以及添加或插入變異體。
如上文所指出的，所述多核苷酸可以包含編碼序列，其中所述編碼序列是序列表中SEQ ID NOS:20-35所示的編碼序列的天然出現(xiàn)的等位變異體。如本領(lǐng)域內(nèi)已知的，等位變異體是多核苷酸序列的另一種形式，所述形式可能具有一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加，并且基本不改變所編碼多肽的功能。
本發(fā)明的多核苷酸還可以具有符合讀框地融合到標(biāo)記序列的編碼序列，其中所述標(biāo)記序列使得能夠純化本發(fā)明的多肽。所述標(biāo)記序列可以是，例如由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記，以提供在使用細(xì)菌宿主的情況下純化融合到所述標(biāo)記的成熟多肽，或者，例如當(dāng)使用哺乳動物宿主(如COS-7細(xì)胞)時，所述標(biāo)記序列可以是血凝素(HA)標(biāo)記。所述血凝素標(biāo)記對應(yīng)于得自流感血凝素蛋白的表位(Wilson,I.等人，Cell,37:767(1984))。
本發(fā)明還涉及與上文所述序列的互補物雜交的多核苷酸(雜交靶序列)，假如在靶序列和與靶序列雜交的序列的互補物之間有至少70％、優(yōu)選至少80％、最好至少85％同一性。更優(yōu)選的是這樣的序列在靶序列和與靶序列雜交的多核苷酸的互補物序列之間有至少90％、優(yōu)選至少95％、最好至少97％同一性。本發(fā)明還涉及這兩種靶序列的互補物以及編碼選自SEQ ID NOS:3到18的氨基酸序列的多核苷酸序列的互補物。本發(fā)明尤其涉及在高嚴(yán)格條件下與上文所述多核苷酸的互補物以及那些互補物。本文所用術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指只有在靶序列和它要雜交的多核苷酸的互補物的序列間有至少95％、最好97％的同一性時，雜交才隨著多核苷酸以及對應(yīng)序列的互補而發(fā)生。在一個優(yōu)選的實施方案中，與上文所述多核苷酸的互補物雜交的多核苷酸編碼保留了與抗體交叉反應(yīng)的免疫原性部分的多肽，其中所述抗體針對具有依照SEQ ID NOS:3-18的序列的多肽的至少其中一種，或針對所包括的氨基酸序列與SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少85％同一性的多肽。
進一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生如上文所陳述的具有組氨酸標(biāo)記(或其它合適標(biāo)記)的多肽和疫苗，其中所述組氨酸標(biāo)記使得以上所討論的全長蛋白、截短物、類似物或變異體能夠由于它們的標(biāo)記而得到分離。
在另一方面，本發(fā)明涉及預(yù)防和/或治療由帶有表面結(jié)合CBP蛋白的肺炎球菌細(xì)菌介導(dǎo)的疾病的方法。本發(fā)明尤其涉及預(yù)防和/或治療由肺炎鏈球菌介導(dǎo)的感染性疾病的方法，其中所述肺炎鏈球菌具有形成α-螺旋的CBP表面結(jié)合蛋白(包括與SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少85％同一性的序列)。在又一優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及在人類中預(yù)防和/或治療這樣的感染的方法。
在再一方面，本發(fā)明涉及使用一種或多種針對如上文所述本發(fā)明的多肽的抗體(單克隆抗體、多克隆抗體或血清抗體)來預(yù)防或治療由具有CBP表面結(jié)合蛋白的肺炎球菌細(xì)菌介導(dǎo)的疾病的方法。本發(fā)明尤其涉及預(yù)防和/或治療由肺炎鏈球菌CBP蛋白介導(dǎo)的感染性疾病的方法，其中所述CBP蛋白包含與SEQ ID NO:1的共有序列具有上文所述同一性的α-螺旋部分。在又一更優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及在人類中利用針對如上文所述包含α-螺旋的免疫原性本發(fā)明多肽的抗體預(yù)防和/或治療中耳炎、鼻咽感染、支氣管感染等的方法。
附圖簡述圖1是分別從N端到C端顯示的肺炎球菌CBP蛋白的示意圖，(a)N端序列，(b)其中一個可能的形成α-螺旋區(qū)域的保守區(qū)段(R1)，該區(qū)段可能在一些CBP多肽中不存在，(c)橋接兩個保守的α-螺旋區(qū)段的可選的小橋接氨基酸序列(X),(d)與第一個共有序列(對應(yīng)于SEQID NO:1)相關(guān)的第二個可能的形成α-螺旋區(qū)域的共有序列(R2),(e)脯氨酸豐富區(qū)域序列，(f)膽堿結(jié)合重復(fù)區(qū)域，以及(e)C端尾序列。在相關(guān)時，可選的HPS序列可以天然存在脯氨酸豐富序列的5’以及R1、X和/或R2區(qū)域的3’。
圖2報道了抗1600 cfu毒性肺炎鏈球菌6B血清型SP317(在小鼠中)的被動免疫保護的結(jié)果，其中所述被動免疫保護由在31天給予針對肺炎球菌CBP截短多肽NR1XR2(截短物缺失脯氨酸區(qū)域和膽堿結(jié)合區(qū)域，但包括兩個保守的α-螺旋區(qū)域R1和R2)的兔抗血清而提供。百分之八十在攻擊前用截短物抗血清免疫的小鼠在14天觀察期存活下來。與此相比，所有用對照血清(免疫前的兔血清)免疫的小鼠在第7天死去。
圖3報道了抗3450 cfu毒性肺炎鏈球菌6B血清型SP317(在小鼠中)的被動免疫保護的結(jié)果，其中所述被動免疫保護由在52天給予針對肺炎球菌CBP截短多肽NR1XR2(截短物缺失脯氨酸區(qū)域和膽堿結(jié)合區(qū)域，但包括兩個保守的α-螺旋區(qū)域R1和R2)的兔抗血清而提供。百分之百在攻擊前用截短物抗血清免疫的小鼠在10天觀察期存活下來。與此相比，百分之九十用對照血清(免疫前的兔血清)免疫的小鼠在第10天死去。
圖4報道了抗580 cfu毒性肺炎鏈球菌6B血清型SPSJ2(在小鼠中)的被動免疫保護的結(jié)果，其中所述被動免疫保護由在31天給予針對肺炎球菌CBP截短多肽NR1XR2(截短物缺失脯氨酸區(qū)域和膽堿結(jié)合區(qū)域，但包括兩個保守的α-螺旋區(qū)域R1和R2)的兔抗血清而提供。百分之五十在攻擊前用截短物抗血清免疫的小鼠在10天觀察期存活下來。與此相比，所有用對照血清(免疫前的兔血清)免疫的小鼠在第8天死去。
圖5報道了抗560 cfu毒性肺炎鏈球菌6B血清型SPSJ2(在小鼠中)的主動免疫保護的結(jié)果，其中所述主動免疫保護由給予肺炎球菌CBP截短多肽NR1X(截短物缺失第二個保守α-螺旋區(qū)域R2以及脯氨酸區(qū)域和膽堿結(jié)合區(qū)域)免疫接種而提供。百分之八十在攻擊前用NR1X CBP截短物主動免疫的小鼠在14天觀察期存活下來。與此相比，所有用PBS和佐劑的對照(假給予小鼠(sham mice))免疫的小鼠在第8天死去。
圖6報道了抗680 cfu毒性肺炎鏈球菌6B血清型SPSJ2(在小鼠中)的主動免疫保護的結(jié)果，其中所述主動免疫保護由免疫接種肺炎球菌CBP截短多肽NR1XR2(截短物缺失脯氨酸區(qū)域和膽堿結(jié)合區(qū)域，但包括兩個保守的α-螺旋區(qū)域R1和R2)而提供。百分之五十在攻擊前用NR1XR2 CBP截短物主動免疫的小鼠在14天觀察期存活下來。與此相比，所有用對照(SP90)蛋白和佐劑免疫的小鼠在第9天死去。
圖7是來自不同肺炎球菌類型的CBP多肽的氨基端的序列比較報道，在比較的每一陣列(整套行)頂部報道了共有序列。比較用的共有序列列為“主要”序列(SEQ ID NO:36)。使用一個字母編碼代表與“最合適”比較匹配的序列，其中序列中的虛線代表連續(xù)序列中的間隔缺口。
圖8顯示了圖7描述的氨基酸序列的序列對距離(sequence pairdistance)并陳述于其中。使用了用同一性殘基比重表的Clustal方法。報道了對圖7中陳述的氨基酸序列進行這樣的比較的相似性百分比。
圖9是來自不同肺炎球菌類型的CBP多肽的氨基酸序列中第一個螺旋區(qū)的序列比較報道，在比較的每一陣列(整套行)頂部報道了共有序列。比較的共有序列列出為“主要”序列(SEQ ID NO:38)。使用一個字母編碼代表與“最合適”比較匹配的序列，其中序列中的虛線代表連續(xù)序列中的間隔缺口。
圖10顯示了圖9描述的氨基酸序列的序列對距離并闡明于其中。使用了用同一性殘基比重表的Clustal方法。報道了對圖9中陳述的氨基酸序列的這樣的比較的相似性百分比。
圖11是來自不同肺炎球菌類型的CBP多肽的氨基酸序列中X區(qū)的序列比較報道，在比較的每一陣列(整套行)頂部報道了序列。比較用共有序列列為“主要”序列(SEQ ID NO:37)。使用一個字母編碼代表與“最合適”比較匹配的序列，其中序列中的虛線代表連續(xù)序列中的間隔缺口。
圖12顯示了圖11描述的氨基酸序列的序列對距離并闡明于其中。使用了用同一性殘基比重表的Clustal方法。報道了對圖11中陳述的氨基酸序列的這樣的比較的相似性百分比。
圖13是來自不同肺炎球菌類型的CBP多肽的氨基酸序列中第二個螺旋區(qū)A的序列比較報道，在比較的每一陣列(整套行)頂部報道了共有序列。比較的共有序列列為“主要”序列(SEQ ID NO:1)。使用一個字母編碼代表與“最合適”比較匹配的序列，其中序列中的虛線代表連續(xù)序列中的間隔缺口。
圖14顯示了圖13描述氨基酸序列的序列對距離并闡明于其中。使用了帶同一性殘基比重表的Clustal方法。報道了對圖13中陳述的氨基酸序列的這樣的比較的相似性百分比。
圖15是來自不同肺炎球菌類型的CBP多肽的氨基酸序列中第二個螺旋區(qū)B的序列比較報道，在比較的每一陣列(整套行)頂部報道了共有序列。比較的共有序列列出為“主要”序列(SEQ ID NO:19)。使用一個字母編碼代表與“最合適”比較匹配的序列，其中序列中的虛線代表連續(xù)序列中的間隔缺口。
圖16顯示了圖15描述的氨基酸序列的序列對距離并闡明于其中。使用了帶同一性殘基比重表的Clustal方法。報道了對圖15中陳述的氨基酸序列的這樣的比較的相似性百分比。
發(fā)明詳述按照本發(fā)明的一個方面，提供了對肺炎鏈球菌感染產(chǎn)生保護反應(yīng)的疫苗，所述疫苗使用包括由以下選出的其中之一的多肽(a)產(chǎn)生α-螺旋結(jié)構(gòu)、與SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少85％相同并且缺失膽堿結(jié)合區(qū)的氨基酸序列，以及(b)天然出現(xiàn)的肺炎鏈球菌多肽的分離的截短物，所述截短物包括與SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少85％同一性的α-螺旋部分并且缺失膽堿結(jié)合區(qū)，(c)天然出現(xiàn)的肺炎鏈球菌多肽的分離的截短物，所述截短物包括與SEQ ID NO:19的氨基酸序列有至少90％同一性的α-螺旋部分并且缺失膽堿結(jié)合區(qū)。在一個優(yōu)選的方面，這樣的分離的截短物多肽是由SEQ ID NOS:3-18選出的其中之一，并且所述分離多肽缺失膽堿結(jié)合區(qū)以及(如果有關(guān)的話)HPS區(qū)；或者是所述多肽的至少包括對應(yīng)于SEQ ID NO:1的共有序列的α-螺旋區(qū)段的片段。尤其優(yōu)選的是利用具有至少這樣的α-螺旋區(qū)域的截短物多肽的疫苗或利用包含至少兩種這樣的α-螺旋區(qū)段的重組免疫原多肽的疫苗。這樣的多肽可以是包含來自一個或多個截短物的多個α-螺旋區(qū)域的重組多肽。更優(yōu)選的是包括至少兩種α-螺旋區(qū)域的重組免疫原多肽，其中所述α-螺旋區(qū)域?qū)?yīng)于來自不同肺炎球菌細(xì)菌類型的兩種或多種截短物的α-螺旋區(qū)域。這樣的多肽可以是包含來自一種或多種不同肺炎球菌細(xì)菌類型的多種α-螺旋區(qū)域的重組多肽。
按照本發(fā)明，提供了包含截短的來自肺炎鏈球菌的表面結(jié)合多肽的分離的多肽，所述分離的多肽包含氨基酸序列一般對應(yīng)于SEQ IDNO:1的α-螺旋區(qū)域，但缺失了膽堿結(jié)合區(qū)域。所述分離的多肽最好還缺失任何天然出現(xiàn)的α-螺旋形成區(qū)域的重復(fù)并且缺失可能存在的任何HPS氨基酸序列。
本發(fā)明的一個目的是利用包含免疫原性多肽的免疫原性組合物作疫苗(或用于產(chǎn)生用于診斷或被動疫苗的抗體)，其中所述免疫原性多肽包含帶有α-螺旋部分并且缺失膽堿結(jié)合區(qū)的肺炎球菌表面結(jié)合蛋白。在一個實施方案中，設(shè)想了來自肺炎鏈球菌細(xì)菌的這樣的截短的蛋白(天然出現(xiàn)或重組產(chǎn)生，或者是功能類似物)。甚至更進一步的是，設(shè)想了缺失出現(xiàn)的任何HPS區(qū)域以及天然蛋白的膽堿結(jié)合區(qū)域、具有單個α-螺旋部分的肺炎鏈球菌多肽。
這樣的免疫原性組合物的尤其優(yōu)選的實施方案是用作疫苗(或用作產(chǎn)生用于診斷或疫苗的抗體的免疫原)，其中所述免疫原性組合物的活性成分是包含選自以下其中至少一種的分離的多肽(a)選自SEQ ID NOS:3-19的氨基酸序列，(b)與(a)有至少90％同一性、優(yōu)選至少95％同一性、更優(yōu)選至少97％同一性的多肽，或(c)(a)或(b)的片段，其中這樣的片段包括至少一種對應(yīng)于共有序列(即SEQ ID NO:1)的α-螺旋部分，并且所述片段不包含膽堿結(jié)合區(qū)。這樣的疫苗最好利用這樣的多肽所述多肽既不包含在天然蛋白中作為氨基酸序列的一部分出現(xiàn)的膽堿結(jié)合區(qū)，也不包含在天然蛋白中作為氨基酸序列的一部分出現(xiàn)的HPS區(qū)。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，提供包括至少一種分離的多肽的疫苗，所述多肽包括與SEQ ID NO:1有至少85％同一性(優(yōu)選87％同一性、更優(yōu)選至少90％同一性)的氨基酸序列，所述分離的多肽不具有膽堿結(jié)合部分，并且在可應(yīng)用時，最好也不包括HPS部分。優(yōu)選的多肽還可以包括一個或多個位于多肽的α-螺旋區(qū)域5’的N端序列，其中所述多肽具有由SEQ ID NOS:3-18等選出的氨基酸序列。所述多肽截短物還可以包括一個或多個脯氨酸區(qū)(圖1中的“P”區(qū))和/或跨越區(qū)(圖1中的“X”區(qū))。
在本發(fā)明的另一方面，可以利用這樣的免疫原性組合物來產(chǎn)生診斷肺炎球菌感染的抗體，或產(chǎn)生預(yù)防和/或治療這樣的肺炎球菌感染的疫苗、以及維持抗所述免疫原性組合物的免疫原的高滴度抗體的強化疫苗。
雖然已經(jīng)設(shè)想了產(chǎn)生用于診斷和用于預(yù)防和/或治療肺炎球菌感染的抗體的其它抗原，但需要改良或更有效的疫苗。這樣的疫苗應(yīng)該對預(yù)防由帶有表面結(jié)合多肽的肺炎球菌介導(dǎo)的細(xì)菌感染有改善或增強的效應(yīng)。此外，為避免不必要的支出并提供對一定范圍肺炎球菌血清型的廣泛保護，有對包含免疫原性氨基酸序列的多肽的需要，其中所述免疫原性多肽對應(yīng)于肺炎球菌表面結(jié)合多肽在不同肺炎球菌類型中高度保守的部分。這樣的多肽最好避免包括對應(yīng)于天然多肽的其它部分的氨基酸序列，如膽堿結(jié)合區(qū)和/或HPS區(qū)的氨基酸序列。
有對包含多肽的高度保守部分的改良抗原性組合物的需要，其中所述多肽的高度保守部分結(jié)合肺炎球菌細(xì)菌的表面、刺激高滴度特異性抗血清的產(chǎn)生以提供對致病性肺炎球菌細(xì)菌感染的保護并可用作診斷試劑。
在這樣的方面，本發(fā)明的截短的多肽、功能性變異體類似物以及重組產(chǎn)生的截短多肽可用作制備疫苗組合物的免疫原，其中所述疫苗組合物刺激能賦予對致病細(xì)菌物種的免疫性的抗體的產(chǎn)生。此外，制備包含純化的蛋白作為抗原性成分的疫苗也是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。
一般來說，將疫苗以水溶液或懸浮物的形式制備成可注射劑。油基(oil base)疫苗也眾所周知用于例如吸入。也可以配制在使用前溶解或懸浮的固體形式。通常加入與活性成分相容并且藥學(xué)使用接受的藥用載體。這樣的載體的例子包括但不限于水、鹽溶液、葡萄糖或甘油。也可以使用載體的組合。
疫苗組合物可以另外加入用于改善疫苗有效性的添加物質(zhì)以穩(wěn)定pH，或作為佐劑、潤濕劑或乳化劑起作用。
通常為腸胃外給予配制疫苗并或者皮下注射、或者肌內(nèi)注射。也可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，作為栓劑或為口服給予配制這樣的疫苗。
通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟知的方法，確定足以賦予對致病細(xì)菌的免疫性的疫苗的量。這個量將根據(jù)疫苗接受者的特性和所需免疫水平而確定。通常要給予的疫苗的量將根據(jù)熟練醫(yī)師的判斷而確定。當(dāng)通過皮下注射或肌內(nèi)注射給予疫苗時，可以給予50到500μg范圍內(nèi)的純化蛋白。
術(shù)語“需要它的患者”指感染或可能感染、將感染產(chǎn)生CbpA的致病肺炎球菌細(xì)菌等等、最好是肺炎鏈球菌細(xì)菌感染的人(然而，在某些情況下可以使用小鼠模型模擬這樣的患者)。
除用作疫苗外，本發(fā)明的多肽可用作刺激抗體產(chǎn)生的免疫原，其中所述抗體用于被動免疫療法、用作診斷試劑以及用作在其它方法如親和層析中的試劑。
編碼上述免疫原多肽的多核苷酸也可以具有符合讀框地融合到標(biāo)記序列的編碼序列，其中所述標(biāo)記序列使得能夠純化本發(fā)明的多肽。所述標(biāo)記序列可以是，例如，由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記，以提供在使用細(xì)菌宿主的情況下純化融合到所述標(biāo)記的成熟多肽，或者，例如當(dāng)使用哺乳動物宿主(如COS-7細(xì)胞)時，所述標(biāo)記序列可以是血凝素(HA)標(biāo)記。所述血凝素標(biāo)記對應(yīng)于得自流感血凝素蛋白的表位(Wilson,I.等人，Cell,37:767(1984))。
可以根據(jù)脯氨酸豐富區(qū)相互之間的定位鑒定依照本發(fā)明的肺炎鏈球菌多肽中α-螺旋氨基酸區(qū)段的多螺旋結(jié)構(gòu)。此外，可選地位于兩個或多個α-螺旋結(jié)構(gòu)間的“X”區(qū)域可能在螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)螺旋的形成中起作用?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)三維蛋白建模確定這樣的結(jié)構(gòu)的相對形狀。Berger等人在Proc.Natl.Acad.of Sci.(USA),92:8259-8263(1995年8月)中描述了用于這樣的三維蛋白建模的計算機程序的一個例子，即Paircoil Scoring Form Program(“PairCoil程序”)。據(jù)描述，PairCoil程序是利用數(shù)學(xué)算法預(yù)測氨基酸序列中卷曲螺旋區(qū)的位置的計算機程序。Wolf等人，Protein Science 6:1179-1189(1997年6月)描述了這樣的計算機程序的另一個例子，該程序稱為Multicoil Scoring FormProgram(“Multicoil程序”)。MultiCoil程序基于PairCoil算法，用于定位二聚和三聚的卷曲螺旋。
在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了在除肺炎鏈球菌物種宿主外的宿主細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)重組產(chǎn)生這樣的多肽，以避免包含具有膽堿結(jié)合區(qū)的天然表面結(jié)合多肽。優(yōu)選的宿主是這樣的細(xì)菌物種所述細(xì)菌能夠在本發(fā)明的多肽分泌出細(xì)胞的條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明還涉及包括編碼本發(fā)明的一種或多種多肽的多核苷酸的載體、用本發(fā)明的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞以及通過重組技術(shù)以分離的和確實具有免疫原性的純凈形式產(chǎn)生這樣的免疫原性多肽，其中所述多肽包括高度保守的α-螺旋氨基酸序列并缺失編碼膽堿結(jié)合氨基酸序列的區(qū)域。
用本發(fā)明的載體遺傳工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)宿主細(xì)胞，所述載體可以是，例如克隆載體或表達載體，其中所述載體包含編碼包括本發(fā)明的高度保守的α-螺旋區(qū)但不具有膽堿結(jié)合區(qū)等的多肽的多核苷酸。所述載體可以是，例如質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式?？梢栽诟鶕?jù)適于激活啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴增編碼所述多肽的多核苷酸而改良的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述工程化的宿主細(xì)胞。培養(yǎng)條件，如溫度、pH等等是以前為表達而選擇宿主細(xì)胞所用的條件，所述條件將對于一般熟練技術(shù)人員是顯而易見的。
載體包括染色體DNA序列、非染色體DNA序列以及合成的DNA序列，如SV40的衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；由質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合衍生的載體、病毒DNA如牛痘、腺病毒、禽痘病毒以及假狂犬病。然而，可以使用任何其它載體，只要所述載體在所述宿主中可復(fù)制并且有活力。
可以通過多種程序?qū)⒑线m的DNA序列插入所述載體。一般來說，通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的程序?qū)⑺鯠NA序列插入合適的限制酶位點。相信這樣的程序以及其它程序處于那些本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員的范圍內(nèi)。
所述表達載體中的DNA序列操作性地連接到指導(dǎo)mRNA合成的合適表達控制序列(啟動子)。作為這樣的啟動子的有代表性的例子，可以提到LTR或SV40啟動子、大腸桿菌lac或trp、噬菌體λPL啟動子以及其它已知在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或它們的病毒中控制基因表達的啟動子。所述表達載體也包含為翻譯起始的核糖體結(jié)合位點以及轉(zhuǎn)錄終止子。所述載體也可以包括為擴增表達的合適序列。
此外，所述表達載體最好包含一個或多個可選擇的標(biāo)記基因來為轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇提供表型性狀，所述表型性狀例如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或在大腸桿菌中的如四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性。
可以使用包含如上文所述的合適DNA序列以及合適的啟動子或控制序列的載體來轉(zhuǎn)化合適的宿主以允許所述宿主表達所述蛋白。
作為合適宿主的有代表性的例子，可以提到細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌(E.coli)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞，如果蠅屬S2(Drosophila S2)和Spodoptera Sf9；動物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等。相信根據(jù)本文的指導(dǎo)，對合適細(xì)胞的選擇處于本領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員的范圍內(nèi)。
更具體地說，本發(fā)明還包括重組構(gòu)建物，所述重組構(gòu)建物包含一種或多種如上文廣義描述的序列。所述構(gòu)建物包括已經(jīng)將本發(fā)明的序列以正向或反向取向插入其中的載體，如質(zhì)?；虿《据d體。在該實施方案的一個優(yōu)選方面，所述構(gòu)建物還包含可操作地連接到所述序列的調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列包括，例如啟動子。大量合適的載體和啟動子是本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的，并可以在商業(yè)上得到。為了舉例而提供以下載體。細(xì)菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen,Inc.)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核細(xì)胞pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。然而，可以使用任何其它質(zhì)?；蜉d體，只要它們在所述宿主中可復(fù)制并且有活力。
可以使用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它帶有選擇標(biāo)記的載體從任何所需基因選出啟動子區(qū)。兩個合適的載體是pKK232-8和pCM7。具體有名的啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和TRP。真核生物的啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、來自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR以及小鼠金屬硫蛋白Ⅰ啟動子。合適載體和啟動子的選擇處于本領(lǐng)域內(nèi)一般技術(shù)人員的水平內(nèi)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含上述構(gòu)建物的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者所述宿主細(xì)胞也可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。可以通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔實現(xiàn)將所述構(gòu)建物引入所述宿主細(xì)胞(Davis,L.,Dibner,M.,Battery,Ⅰ.,Basic Methods in Molecular Biology,(1986))。
可以以常規(guī)方法使用宿主細(xì)胞中的構(gòu)建物以產(chǎn)生由所述重組序列編碼的基因產(chǎn)物?；蛘?，可以通過常規(guī)肽合成儀合成產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。
可以在合適啟動子的控制下，在哺乳動物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達成熟蛋白。也可以使用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，用由本發(fā)明的DNA構(gòu)建物得到的RNA產(chǎn)生這樣的蛋白。用于原核宿主和真核宿主的合適克隆和表達載體由Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)中描述，特此將該文獻所公開的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
通過在所述載體中插入增強子序列，增加高等真核細(xì)胞對編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常約從10到300bp，作用于啟動子以增強它的轉(zhuǎn)錄。例子包括位于復(fù)制起點后側(cè)(late side)第100到270bp的SV40增強子、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強子、位于復(fù)制起點后側(cè)的多形瘤增強子以及腺病毒增強子。
一般來說，重組表達載體將包括復(fù)制起點和允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可選擇標(biāo)記、以及得自高表達基因的用于指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的啟動子，其中所述選擇標(biāo)記如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因以及啤酒酵母(S.cerevisiae)TRPl基因。這樣的啟動子可以得自編碼糖酵解酶的操縱子，其中所述糖酵解酶尤其是如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶或熱激蛋白。將異源結(jié)構(gòu)序列以合適的相與翻譯起始和終止序列裝配。所述異源序列可以可選地編碼包括賦予所需特性的N端鑒定肽的融合蛋白，其中所述所需特性如所表達的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定化或簡化純化。
通過將編碼所需蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列以及合適的轉(zhuǎn)錄起始和終止信號以可操作的可讀相插入有功能的啟動子，構(gòu)建有用的應(yīng)用于細(xì)菌的表達載體。所述載體將包括一個或多個表型可選擇標(biāo)記以及復(fù)制起點，以保證所述載體的維持并在需要時在宿主內(nèi)提供擴增。雖然可以可選地使用其它物種，但用于轉(zhuǎn)化的合適原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌以及假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬以及葡萄球菌屬(Staphylococcus)等屬內(nèi)的不同物種。
作為有代表性但非限制性的例子，應(yīng)用于細(xì)菌的有用的表達載體可以包括可選擇的標(biāo)記以及由商業(yè)上可得到的質(zhì)粒得到的細(xì)菌復(fù)制起點，其中包括眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳元件。這樣的商業(yè)化載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia FineChemicals,Uppsala,Sweden)和GEM1(Progema Biotec,Madison,WI,USA)。將這些pBR322“主鏈”部分與合適啟動子以及要表達的結(jié)構(gòu)序列組合。
在轉(zhuǎn)化合適的宿主株并將所述宿主株培養(yǎng)到合適細(xì)胞濃度后，通過合適方法誘導(dǎo)所選啟動子的表達(如變溫或化學(xué)誘導(dǎo))并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞一段時間。
通常通過離心收獲細(xì)胞，用物理或化學(xué)方法破碎，并留存得到的粗提物以進一步純化。
可以通過任何適當(dāng)方法破碎在表達蛋白中使用的微生物細(xì)胞，所述方法包括冷凍-融化循環(huán)、超聲處理、弗氏壓碎器(french press)、機械破碎、或使用細(xì)胞裂解劑，這樣的方法對于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員是熟知的。然而，優(yōu)選的是分泌本發(fā)明的多肽并允許從培養(yǎng)基中回收所述多肽的宿主細(xì)胞。
也可以使用各種哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達重組蛋白。哺乳動物表達系統(tǒng)的例子包括猴腎成纖維細(xì)胞的COS-7系(如Gluzman,Cell,23:175(1981)所述)以及其它能夠表達相容質(zhì)粒的細(xì)胞系，例如，C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動物表達載體將包括復(fù)制起點、合適的啟動子和增強子，并且還包括任何需要的核糖體結(jié)合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉(zhuǎn)錄終止序列以及5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列?？梢允褂玫米許V40剪接物的DNA序列以及聚腺苷酸化位點以提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。
可以通過眾所周知的蛋白回收和純化方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和/或純化所述多肽。這樣的方法可以包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取法、陰離子交換層析或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析法、親和層析、羥基磷灰石層析以及凝集素層析。如果需要可以在完成成熟蛋白的構(gòu)型中使用蛋白重折疊步驟。在這一方面，在這樣的重折疊程序中可以使用陪伴分子。最后，可以使用高效液相層析(HPLC)進行最后的純化步驟。
在本發(fā)明中用作免疫原的多肽可以是天然純化的產(chǎn)品、或化學(xué)合成程序的產(chǎn)品、或通過重組技術(shù)由原核或真核宿主(例如由培養(yǎng)中的細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲以及哺乳動物細(xì)胞)產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)程序中使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或未糖基化的。尤其優(yōu)選的免疫原是包含單個高度保守的α-螺旋區(qū)域、但不包含膽堿結(jié)合區(qū)或HPS區(qū)的截短的肺炎球菌多肽。因此，抗這樣的多肽的抗體應(yīng)該結(jié)合其它肺炎球菌細(xì)菌物種(除產(chǎn)生這樣的多肽的肺炎鏈球菌物種之外)，并且抗這樣的肺炎鏈球菌的疫苗應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生對其它肺炎球菌細(xì)菌感染的保護。
分離所述包含各自表達的α-螺旋的多肽的程序可以是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的重組表達/分離方法。這樣分離的典型的例子利用針對所述蛋白保守區(qū)的抗體，或利用針對作為所述蛋白結(jié)構(gòu)的一部分表達的His標(biāo)記或可切割前導(dǎo)物或尾的抗體。
可以使用所述多肽、它們的片段或其它衍生物、或其類似物、或表達它們的細(xì)胞作為產(chǎn)生其抗體的免疫原。這些抗體可以是，例如多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合抗體、單鏈抗體和人源化抗體以及Fab片段，或Fab表達庫的產(chǎn)物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的各種方法產(chǎn)生這樣的抗體和片段。
可以通過將對應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽直接注射入動物或?qū)⑺龆嚯慕o予動物(最好不是人類)，獲得由針對所述多肽而產(chǎn)生的抗體。這樣獲得的抗體隨后將結(jié)合所述多肽本身。照這樣，甚至可以用僅編碼所述多肽一個片段的序列來產(chǎn)生結(jié)合整個天然多肽的抗體。
為制備單克隆抗體，可以使用任何提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生的抗體的技術(shù)。例子包括雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein,1975,Nature256:495-497)、三形瘤(trioma)技術(shù)、人類B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，1983,Immunology Today 4:72)以及產(chǎn)生人類單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人，1985，載于Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,Inc.，第77-96頁)。
可以采用描述用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)以產(chǎn)生針對本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)品的單鏈抗體。同樣，也可以使用表達針對本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)品的人源化抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。
為便利理解上面的描述以及下面的實施例，以及同此包括的圖，下面的表1給出SEQ ID NOS:3-18的多肽以及編碼它們的多核苷酸(分別是SEQ ID NOS:20-35)的細(xì)菌來源。詳細(xì)說明了細(xì)菌的名稱和/或類型并指出了供方(credit)或來源。由于利用如本文所述的探針和/或引物，僅使用本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)技術(shù)就可以容易地獲得相似類型的其它序列，因此來自這樣細(xì)菌類型的序列僅為說明性的目的。
表1
本發(fā)明將參考下面的實施例進一步進行描述；然而，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限于這樣的實施例。除非另外指出，否則所有部分或量都按重量計算。
實施例1CbpA截短物蛋白的載體的產(chǎn)生A．全長CbpA(NR1XR2PC)的載體使用毒性肺炎球菌4血清型菌株Norway 4(得自Ⅰ.Aaberge,National Instute of Public Health,Oslo,Norway)作為擴增編碼全長CbpA的多核苷酸的基因組DNA模板來源。用下面描述的PCR引物SJ533和SJ537擴增全長的CbpA。
簡并正向引物SJ533根據(jù)由H.R.Masure提供的CbpA的N端序列XENEG(St.Jude Children’s Research Hospital,Memphis,TN)設(shè)計。所述SJ533引物=5’GGC GGA TCC ATG GA(A,G)AA(C,T)GA(A,G)GG 3’。它加入了BamHⅠ和NcoⅠ限制位點以及ATG起始密碼子。
3’反向引物SJ537=5’GCC GTC GAC TTA GTT TAC CCA TTCACC ATT GGC 3’。
該引物為克隆目的加入了SalⅠ限制位點,并加入了來自CbpA的天然終止密碼子，并且是基于內(nèi)部產(chǎn)生的4型和R6X型序列。
用BamHⅠ和SalⅠ消化由具有SJ533和SJ537的基因組DNA模板產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，并將其克隆進用BamHⅠ、XbaⅠ和SmaⅠ消化的pQE30表達載體(Qiagen,Inc.)。R6X型模板產(chǎn)生全長的PMI581載體，而4型模板DNA產(chǎn)生全長的載體PMI580。
B.CbpA截短蛋白(NR1XR2)的載體利用位于第二個氨基酸重復(fù)末端的天然出現(xiàn)的PvuⅡ位點(4型序列的第1228核酸)以產(chǎn)生CbpA的截短形式，所述截短形式僅包含所述基因的氨基末端。為產(chǎn)生所述截短物的克隆，用PvuⅡ和XbaⅠ消化全長的克隆PMI580(4型)或PMI581(R6X)，并根據(jù)大小在瓊脂糖凝膠上分離所述氨基端以及所述表達載體的一部分。用XbaⅠ和SmaⅠ消化pQE30，并也在瓊脂糖凝膠上根據(jù)大小選出對應(yīng)于所述載體另外一半的帶。連接這兩個半邊，通過限制性消化鑒定克隆，然后表達所述克隆。在這種情況下，所利用的終止密碼子位于所述表達載體內(nèi)，因此由于在克隆位點5’末端和3’末端的額外氨基酸，所表達的蛋白比預(yù)計的大小要大。
C.CbpA截短蛋白(NR1X)的載體使用相似策略表達僅CbpA的第一個氨基酸重復(fù)。在此利用了位于兩個氨基酸重復(fù)之間的天然出現(xiàn)的XmnⅠ位點(4型序列的第856核酸)。用XmnⅠ和AatⅡ消化CbpA全長克隆PMI580。用AatⅡ和SmaⅠ消化表達載體pQE30。再一次連接兩個根據(jù)大小分離的片段，通過限制性消化篩選克隆并表達所述克隆。
實施例2從表達載體表達CbpA截短的蛋白在Qia expressionist系統(tǒng)(Qiagen)中，用大腸桿菌表達載體pQE30從實施例1A-1C所述的載體中表達所有的蛋白，并使用抗組氨酸抗體以及基因特異性抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測氨基末端His6標(biāo)記的蛋白。
如下純化所表達的CBP截短物。
從包含所述重組質(zhì)粒的在平板上生長的細(xì)菌挑取單菌落，并在6.0ml含50ug/ml卡那霉素以及100ug/ml氨芐青霉素的LB緩沖液中37℃培養(yǎng)過夜。將該6.0ml培養(yǎng)物加入含有上述濃度抗生素的1L LB中。將所述培養(yǎng)物在37℃振蕩培養(yǎng)直到A600=約0.400。在所述1L培養(yǎng)物中加入1M IPTG以達到1mM的終濃度。然后將所述培養(yǎng)物在37℃振蕩培養(yǎng)3-4小時。將所述1L培養(yǎng)物裝在250ml圓錐管內(nèi)，在J-6B型離心機中4000rpm離心15分鐘。棄去上清，將沉淀保存在-20℃?zhèn)溆谩?br> 將所述1L的沉淀重懸浮于25ml 50mM NaH2PO4,10mM Tris,6MGuCl,300mM NaCl,pH8.0(緩沖液A)中。然后將該混合物在室溫下攪拌30分鐘。然后使用微端(microtip)超聲處理(VibraCell Sonicator,Sonics and Materials,Inc.,Danbury,CT)所述混合物兩次，每次30秒鐘，其中使用50％Duty Cycle并且輸出設(shè)定是7。將所述混合物在JA20轉(zhuǎn)子中10K下離心5分鐘，取出上清并棄去沉淀。將上清液加載到依附于GradiFrac系統(tǒng)(Pharmacia Biotech,Upsala,Sweden)的10mlTalon(Clonetech,Palo Alto,CA)樹脂柱。用100ml緩沖液A平衡柱子并用200ml該緩中液洗柱。以用100％50mM NaH2PO4,8M尿素，20mMMES,pH6.0(緩沖液B)作為最終靶緩沖液的基于體積的pH梯度液洗脫，總體積為100ml。蛋白在約30％緩沖液B時洗脫。收集洗脫峰并匯集它們。
為進行重折疊，在室溫用2L體積PBS進行透析約3小時，其中使用截止分子量為14,000的透析管。然后將樣品在2L PBS中4℃下透析過夜。在使用Centriprep-30離心柱濃縮所述蛋白的過程中，在離心殘留物中加入PBS并再次離心，實現(xiàn)額外緩沖液的置換。使用BCA蛋白分析確定蛋白濃度，并使用考馬斯亮藍染色的4-20％SDS-PAGE凝膠使純度可見。
實施例3用抗CbpA截短物NR1XR2抗血清的被動保護A．兔免疫血清的產(chǎn)生在Covance(Denver,PA)產(chǎn)生抗CbpA截短物的兔免疫血清。收集免疫前血清之后，用在完全弗氏佐劑中的250μg CbpA截短物NR1XR2(包含由483:58制備的α-螺旋Ⅰ和α-螺旋Ⅱ氨基酸N末端重復(fù))免疫New Zealand白兔(#ME101)。在第21天給予白兔不完全弗氏佐劑中的125μg CbpA截短物的強化，并在第31天和第52天從白兔取血。
B．小鼠中的被動免疫保護用100μl無菌PBS中的兔血清(免疫前血清或第31天的免疫血清)的1∶2稀釋物腹膜內(nèi)被動免疫C3H/HeJ小鼠(5小鼠/組)。給予血清一小時后，用1600cfu毒性肺炎球菌6B血清型SP317株(得自H.R.Masure)攻擊小鼠。監(jiān)測小鼠14天以確定存活率。
百分之八十用由抗CbpA截短物NR1XR2蛋白產(chǎn)生的兔免疫血清免疫的小鼠在攻擊后存活14天(圖2)。所有用免疫前兔血清免疫的小鼠都在第7天死亡。
C．小鼠中的被動免疫保護(更高攻擊劑量)用100μl無菌PBS中的兔血清(免疫前血清或第52天的免疫血清)的1∶2稀釋物腹膜內(nèi)被動免疫C3H/HeJ小鼠(10小鼠/組)。給予血清一小時后，用3450 cfu毒性肺炎球菌6B血清型SP317株攻擊小鼠。監(jiān)測小鼠10天以確定存活率。
百分之百用由抗CbpA截短物NR1XR2蛋白產(chǎn)生的兔免疫血清免疫的小鼠在攻擊后存活十天(圖3)。90％用免疫前兔血清免疫的小鼠都在第10天死亡。
D．小鼠中的被動免疫保護(對高毒性)用100μl無菌PBS中的兔血清(免疫前血清或第52天的免疫血清)的1∶2稀釋物腹膜內(nèi)被動免疫C3H/HeJ小鼠(10小鼠/組)。給予血清一小時后，用580 cfu毒性肺炎球菌6B血清型SPSJ2株(由P.Flynn,St.Jude Children’s Research Hospital,Memphis,TN提供)攻擊小鼠。監(jiān)測小鼠10天以確定存活率。
百分之五十用抗CbpA截短物NR1XR2蛋白產(chǎn)生的兔免疫血清免疫的小鼠在攻擊后存活10天(圖4)。所有用免疫前血清免疫的小鼠都在第8天死亡。
這些數(shù)據(jù)顯示對CbpA特異性的抗體對系統(tǒng)性肺炎球菌感染有保護作用。由于對缺失膽堿結(jié)合重復(fù)的截短的蛋白NR1XR2特異性的抗體對于保護是足夠的，因此這些數(shù)據(jù)進一步指出膽堿結(jié)合區(qū)對于保護不是必需的。此外，針對基于4血清型序列的重組CbpA蛋白的抗血清仍然對6B血清型的兩種不同株的攻擊有保護作用。
實施例4用抗CbpA截短物NR1X和NR1XR2的主動免疫保護A．用NR1X截短物接種的主動保護用CbpA截短物蛋白(在50μl PBS中有15μg，加50μl完全弗氏佐劑)NR1X腹膜內(nèi)免疫C3H/HeJ小鼠(10小鼠/組)。一組10只假免疫的小鼠接受PBS和佐劑。四周后用不完全弗氏佐劑中的15μg蛋白(假免疫組接受PBS和IFA)腹膜內(nèi)給予第二次免疫。在第3、6和9周取血(眼框后(retro-orbital)取血)以分析免疫應(yīng)答。在第9周得自10只CbpA免疫小鼠的匯集的血清中ELISA終點抗CbpA截短物滴度是4,096,000。在來自假免疫小鼠的血清中沒有檢測到抗體。在第10周用560 CFU肺炎球菌6B血清型SPSJ2株攻擊小鼠。檢測小鼠14天以確定存活率。
百分之八十用CbpA截短物蛋白NR1X免疫的小鼠在攻擊后存活14天(結(jié)果顯示于圖5)。所有假免疫小鼠都在第8天死亡。
B．用NR1XR2截短物接種的主動保護用CbpA截短物蛋白NR1XR2(在50μl PBS中有15μg，加50μl完全弗氏佐劑)腹膜內(nèi)免疫C3H/HeJ小鼠(10小鼠/組)。一組10只對照免疫小鼠接受肺炎球菌重組蛋白SP90和佐劑。四周后用不完全弗氏佐劑中的15μg蛋白腹膜內(nèi)給予第二次免疫。在第3、6和9周取血(眼框后取血)以分析免疫應(yīng)答。在第9周得自10只CbpA免疫小鼠的匯集的血清中ELISA終點抗CbpA截短物滴度是4,096,000。在第10周用680 CFU肺炎球菌6B血清型SPSJ2株攻擊小鼠。監(jiān)測小鼠14天以確定存活率。
百分之五十用CbpA截短物蛋白NR1XR2免疫的小鼠在攻擊后存活14天(結(jié)果顯示于圖6)。所有對照免疫小鼠都在第9天死亡。
這些數(shù)據(jù)證實用重組CbpA截短物蛋白免疫引發(fā)能夠?qū)ο到y(tǒng)性肺炎球菌感染和死亡產(chǎn)生保護的特異性抗體的產(chǎn)生。由于免疫原是截短的蛋白NR1X和NR1XR2，因此這些數(shù)據(jù)進一步指出膽堿結(jié)合區(qū)對于保護不是必需的。此外，結(jié)果指出單個氨基末端重復(fù)對于引發(fā)保護性應(yīng)答是足夠的。由于所述重組肺炎球菌蛋白基于4血清型DNA序列產(chǎn)生，并且用6B血清型分離物攻擊后觀察到保護，因此證實了交叉保護。
按照上面的指導(dǎo)，本發(fā)明的多種修改和變化是可能的，因此，在附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以用除具體描述以外的其它方法實踐本發(fā)明。
序列表<110>Wizemann,Theresa MKoenig,ScottJohnson,Leslie S<120>用作疫苗的膽堿結(jié)合蛋白衍生物<130>469201-364<140><141><150>US 60/085,743<151>1998-05-15<160>38<170>MS-Word(DOS Text)<210>1<211>103<212>PRT<213>人工序列<220><223>描述由得自肺炎鏈球菌的基因組的cDNA衍生出的氨基酸序列<400>1Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys1 5 10 15Ala Glu Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr20 25 30Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys35 40 45Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Ser Arg Asn50 55 60Glu Glu Lys Ile Lys Gln Ala Lys Ala Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala65 70 75 80Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu85 90 95Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala100<210>2<211>141<212>PRT<213>人工序列<220><223>描述由得自肺炎鏈球菌的基因組的cDNA衍生出的氨基酸序列<400>2Glu Ala Lys Arg Lys Ala Glu Glu Ser Glu Lys Lys Ala Ala Glu Ala1 5 10 15Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu Glu Tyr Ala Leu Glu Ala Lys Ile Ala20 25 30Glu Leu Glu Tyr Glu Val Gln Arg Leu Glu Lys Glu Leu Lys Glu Ile35 40 45Asp Glu Ser Asp Ser Glu Asp Tyr Leu Lys Glu Gly Leu Arg Ala Pro50 55 60Leu Gln Ser Lys Leu Asp Thr Lys Lys Ala Lys Leu Ser Lys Leu Glu65 70 75 80Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu Ile Ala Lys Leu85 90 95Glu Val Gln Leu Lys Asp Ala Glu Gly Asn Asn Asn Val Glu Ala Tyr100 105 110Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Thr Ala Glu Lys Lys Ala Glu Leu115 120 125Glu Lys Ala Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asp Glu130 135 140<210>3<211>431<212>PRT<213>人工序列<220><223>描述由得自肺炎鏈球菌的基因組的cDNA衍生出的氨基酸序列<400>3Thr Glu Lys Glu Val Thr Thr Pro Val Ala Thr Ser Ser Asn Lys Ala1 5 10 15Asn Lys ser Gln Thr Glu His Met Lys Ala Ala Glu Gln Val Asp Glu20 25 30Tyr Ile Asn Lys Met Ile Gln Leu Asp Lys Arg Lys His Thr Gln Asn35 40 45Leu Ala Leu Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Lys Tyr Leu Arg50 55 60Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys Lys Glu Glu Leu Thr Ser65 70 75 80Lys Thr Lys Lys Glu Ile Asp Ala Ala Phe Glu Gln Phe Asn Lys Asp85 90 95Thr Leu Lys Pro Gly Glu Lys Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu100 105 110Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gln Lys Glu Glu Asp His Arg Asn115 120 125Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser130 135 140Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala145 150 155 160Lys Gly Ser Arg Asn Glu Glu Lys Ile Lys Lys Ala Lys Ala Glu Val165 170 175Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Lys Leu Glu Glu Ile Lys Thr Glul80 185 190Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Glu Ala Glu Glu195 200 205Glu Val Lys Asn Lys Leu Lys Lys Arg Thr Lys Arg Gly Ala Phe Gly210 215 220Glu Pro Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp225 230 235 240Ser Ser Val Val Lys Lys Ser Ser Lys Pro lle Leu Lys Ser Glu Lys245 250 255Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val260 265 270Ala Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg275 280 285Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu290 295 300Ser Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu305 310 315 320Ala Lys Glu Pro Gln Asn Glu Glu Lys Ile Lys Gln Ala Lys Ala Lys325 330 335Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr340 345 350Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Ala Lys Arg Lys Val Ala Glu Glu Asp355 360 365Lys Val Lye Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro370 375 380Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Lys385 390 395 400Ala Glu Lys Pro Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg405 410 415Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Pro Leu Asp Leu Thr Ala Pro Ala Lys420 425 430<210>4<211>251<212>PRT<213>人工序列<220><223>描述由得自肺炎鏈球菌的基因組的cDNA衍生出的氨基酸序列<400>4Thr Glu Asn Glu Gly Ser Thr Gln Ala Ala Thr Ser Ser Asn Met Ala1 5 10 15Lys Thr Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gln Val Val Asp Glu Tyr Ile20 25 30Glu Lys Met Leu Arg Glu Ile Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gln35 40 45Asn Val Ala Leu Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Lys Tyr Leu50 55 60Arg Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys Asp Glu Leu pro Ser65 70 75 80Glu Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Lys Phe Lys Lys Asp85 90 95Thr Leu 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Gly Val Pro Gly Glu Leu A la Thr Pro Asp Lys Lys G1u20 25 30Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro35 40 45Ser Pro Ser Leu Lys Pro Glu50 55<210>38<211>103<212>PRT<213>人工序列<220><223>描述由得自肺炎鏈球菌基因組的cDNA共有序列衍生出的氨基酸序列<400>38Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys1 5 10 15Ala Lys Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr20 25 30Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys35 40 45Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Ser Arg Asp50 55 60Glu Gly Lys Ile Lys Gln Ala Lys Ala Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala65 70 75 80Glu Ala Thr Arg Leu Lys Lys Ile Lys Thr Asp Arg Glu Lys Ala Glu85 90 95Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala100
權(quán)利要求
1．抗細(xì)菌感染的疫苗，所述疫苗包括肺炎球菌表面結(jié)合蛋白、類似物或變異體的多肽截短物作為免疫原，其中所述多肽截短物具有就不同肺炎球菌細(xì)菌類型而言高度保守的免疫原性α-螺旋部分，并且所述多肽并不包含膽堿結(jié)合部分。
2．依照權(quán)利要求1的疫苗，其中所述α-螺旋部分的氨基酸序列相對于SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少75％同一性。
3．依照權(quán)利要求1的疫苗，其中所述α-螺旋部分的氨基酸序列相對于SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少85％同一性。
4．依照權(quán)利要求1的疫苗，其中所述α-螺旋部分的氨基酸序列相對于由以下選出的一種氨基酸序列有至少90％同一性(a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列，和(b)SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
5．依照權(quán)利要求1的疫苗，其中所述α-螺旋部分的氨基酸序列相對于由以下選出的一種氨基酸序列有至少95％同一性(a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列，和(b)SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
6．依照權(quán)利要求1的疫苗，其中所述疫苗用于預(yù)防或治療中耳炎、膿毒病、腦膜炎以及大葉性肺炎感染。
7．依照權(quán)利要求6的疫苗，其中所述疫苗針對侵襲性感染。
8．依照權(quán)利要求6的疫苗，其中所述疫苗針對由肺炎鏈球菌引起的中耳炎感染。
9．依照權(quán)利要求1的疫苗，其中所述多肽截短物包括與由SEQ IDNO:3到18的每一種的氨基酸序列選出的一種有至少90％同一性的氨基酸序列。
10．依照權(quán)利要求1的疫苗，其中所述多肽截短物包括與由SEQID NO:3到18的每一種的氨基酸序列選出的一種有至少95％同一性的氨基酸序列。
11．針對免疫原產(chǎn)生的抗體，所述免疫原是肺炎球菌表面結(jié)合蛋白、類似物或變異體的多肽截短物，其中所述多肽截短物具有就不同肺炎球菌細(xì)菌類型而言高度保守的免疫原性α-螺旋部分，并且所述多肽并不包含膽堿結(jié)合部分。
12．依照權(quán)利要求11的抗體，其中述α螺旋部分的氨基酸序列相對于SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少85％同一性。
13．依照權(quán)利要求11的疫苗，其中所述α-螺旋部分的氨基酸序列相對于由以下選出的一種的氨基酸序列有至少90％同一性(a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列，和(b)SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
14．依照權(quán)利要求11的抗體，其中所述α-螺旋部分的氨基酸序列相對于由以下選出的一種的氨基酸序列有至少95％同一性(a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列，和(b)SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
15．依照權(quán)利要求11的抗體，其中所述多肽截短物包括與由SEQID NO:3到18的每一種的氨基酸序列選出的一種有至少95％同一性的氨基酸序列。
16．依照權(quán)利要求11的抗體，其中所述抗體是可以檢測肺炎鏈球菌感染的抗體。
17．依照權(quán)利要求15的抗體，其中所述抗體對預(yù)防和/或治療肺炎鏈球菌感染有效。
18．依照權(quán)利要求15的抗體，其中所述抗體對預(yù)防和/或治療由肺炎球菌細(xì)菌1-5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F型引起的肺炎球菌感染有效。
19．預(yù)防和/或治療宿主中肺炎球菌感染的方法，該方法包括用由以下選出的一種免疫所述宿主(a)依照權(quán)利要求2的疫苗，以及(b)針對免疫原產(chǎn)生的至少一種抗體，所述抗原是肺炎球菌表面結(jié)合蛋白、類似物或變異體的多肽截短物，所述多肽截短物包括與由SEQ ID NO:3到18選出的一種的氨基酸序列有至少90％的同一性的氨基酸序列，其中所述多肽不包括膽堿結(jié)合部分。
20．一種多肽，該多肽包括相對于由SEQ ID NO:3到18的每一種的氨基酸序列選出的一種有至少90％同一性的氨基酸序列。
21．一種分離的多核苷酸，該多核苷酸包括與由以下選出的一種有至少90％同一性的多核苷酸序列(a)編碼多肽的多核苷酸編碼序列，所述多肽包括由SEQ ID NO:3到18的每一種的氨基酸序列選出的一種，以及(b)(a)的互補物。
全文摘要
本發(fā)明提供用于給予人類和人類以外動物以刺激免疫應(yīng)答的細(xì)菌性免疫原劑。本發(fā)明特別涉及用肺炎球菌來源的多肽免疫接種哺乳動物物種,所述免疫接種的作用機制是刺激產(chǎn)生保護所述疫苗接種接受者免遭各種致病菌感染的抗體,其中所述多肽含有α螺旋但是不含膽堿結(jié)合區(qū)。另一方面,本發(fā)明提供針對這樣的蛋白和蛋白復(fù)合物的抗體,該抗體可用作各種致病菌的診斷試劑和/或保護/治療劑。
文檔編號C07K16/12GK1315870SQ99807022
公開日2001年10月3日 申請日期1999年4月6日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月7日
發(fā)明者T·M·維澤曼, S·科尼格, L·S·約翰遜 申請人:免疫醫(yī)療公司