羊草幾丁質(zhì)酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羊草幾丁質(zhì)酶LcChi2基因 在提高植物耐冷性方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊草（Leymus chinensis Trin 或 Aneurolepidium chinense Trin)，別名喊草， 禾本科賴(lài)草屬多年生草本植物。羊草葉量多、營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好，各類(lèi)家畜一年四季均喜 食，有"牲口的細(xì)糧"之美稱(chēng)。羊草具有耐鹽堿、耐寒、耐旱、抗真菌、抗細(xì)菌等優(yōu)勢(shì)，在平原、 山坡、沙壤土中均能適應(yīng)生長(zhǎng)。羊草的耐鹽堿性非常強(qiáng)，其體內(nèi)含有許多抗性相關(guān)蛋白，是 克隆抗逆基因的良好材料。
[0003] 幾丁質(zhì)酶（chitinase)主要水解幾丁質(zhì)多聚體中的β-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生N-乙酰 氨基葡萄糖寡聚體。根據(jù)幾丁質(zhì)酶催化區(qū)氨基酸序列的同源性，可以把幾丁質(zhì)酶分為18， 19,20家族。18家族的幾丁質(zhì)酶來(lái)源于細(xì)菌，真菌，病毒及一些植物；19家族的幾丁質(zhì)酶 主要包括植物幾丁質(zhì)酶和部分鏈霉菌屬的幾丁質(zhì)酶；20家族包括鏈霉菌屬和人類(lèi)的幾丁 質(zhì)酶。多種微生物、動(dòng)植物都可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，高等植物本身不含有作為真菌細(xì)胞壁組分 之一的幾丁質(zhì)，但當(dāng)植物受到真菌、細(xì)菌和病毒等感染時(shí)，幾丁質(zhì)酶的活性迅速提高，幾丁 質(zhì)酶在高等植物中有多個(gè)成員，功能差異顯著?，F(xiàn)已證實(shí)幾丁質(zhì)酶是主要的植物病程相 關(guān)蛋白之一。Hong et al的研宄表明，病原誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶表達(dá)過(guò)程中脫落酸（ABA)、NaCl 和干旱等因素也有著重要的作用（HONG J K，HWANG B K。Induction by pathogen，salt and drought of a basic class II chitinase mRNA and its in situ localization in pepper (Capsicum annuum)[J]〇 Physiologia Plantarum，2002,114(4):549-558) 〇 Schneider et al的進(jìn)一步研宄發(fā)現(xiàn)，病原和水楊酸誘導(dǎo)的幾丁質(zhì)酶活性上升與植物體內(nèi) 的 Ca2+密切相關(guān)（SCHNEIDERM S，KUR0SAKI F，NISH IA。Role of salicylic acid and intracellular Ca2 in the induction of chitinase activity in carrot suspension culture[J]。 Physiological and Molecular Plant Pathology，1994,45(2):101-109)〇 1986年Schlumbaum et al首次報(bào)道了提純的菜豆幾丁質(zhì)酶具有抗真菌活性（SCHLUMBAUM A，MAUCH F0 Plant chitinases are potent inhibit ors of fungal growth[J]〇Nature， 1986,324(4376) :365-367)。進(jìn)一步研宄表明，提純的煙草、馬鈴薯、黃瓜等多種植物幾丁質(zhì) 酶對(duì)立枯絲核菌等20多種病原真菌和非病原真菌的菌絲生長(zhǎng)或孢子萌發(fā)具有抑制作用， 除抗真菌外，幾丁質(zhì)酶對(duì)細(xì)菌、昆蟲(chóng)、螨等也表現(xiàn)出一定的抗性。
[0004] 多項(xiàng)研宄表明，植物幾丁質(zhì)酶的表達(dá)具有組織特異性，參與了植物的發(fā)育調(diào) 控。目前，此類(lèi)研宄大多集中在幾丁質(zhì)酶與植物有性生殖過(guò)程的關(guān)系上。Robins on et al的研宄表明，IV類(lèi)幾丁質(zhì)酶和葡萄的成熟密切相關(guān)，并存在表達(dá)的組織或器官特異性 (ROBINSON S P， JACOBS A K， DRYIB。 A class IV chitinase is highly expressed in grape berries during ripening[J]〇 Plant Physiology, 1997,114(3) :771-778);而在 胡蘿卜中，幾丁質(zhì)酶則參與了控制早期胚胎的發(fā)育（KRAGH K M，JACOBSEN S，MIKKELSEN J Do Induction purification and characterization of barley leaf chitinase[J]〇 Plant Science，1996,157(1) :55-68)。此外，幾丁質(zhì)酶和植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)也有密切的關(guān) 系，導(dǎo)入外源幾丁質(zhì)酶基因的植株生長(zhǎng)更加迅速（PATILVR，WIDHOLM J M。Possible correlation between increased vigour and chitinase activity expression in tobacco [J]。Crop Science，1994, 34 (4) : 1070-1073)。幾丁質(zhì)酶還具有其它多種生理功能， Minic et al的研宄表明，幾丁質(zhì)酶可以降解固氮菌產(chǎn)生的結(jié)瘤因子，從而控制結(jié)瘤因子 水平，使植物與根瘤菌達(dá)到共生平衡，參與共生固氮調(diào)控（MINIC Z，BROWN S，K0UCHK0VSKY Y et al〇 Purification and characterization of a novel chitinase-lysozyme, of another chitinase， both hydrolysing Rhizobium meliloti nod factors, and of a pathogenesis-related protein from Medicago sativa roots[J]〇Biochemical Journa， 1998,332(2):329-335)。Stangarlin et al的研宄表明，幾丁質(zhì)酶廣泛參與了植物光合作 用等過(guò)程（STANGARLIN J R，PASCH0LATI S FtlActivities of ribulose-l，5_bisphosphate carboxylase-oxygenase(rubisco),chlorophyllase,beta-1,3 glucanase and chitinase and chlorophyll content in bean cultivars(Phaseolus vulgaris)infected with Uromyces appendiculatus[J]。Phytopathologica，2000,26 (I):34_42)〇
[0005] 早期的研宄認(rèn)為不同植物幾丁質(zhì)酶基因的氨基酸序列非常類(lèi)似，但在細(xì)菌、植物 真菌和酵母中幾丁質(zhì)酶基因的核苷酸序列差異較大。Levorson et al比較了在GeneBank 中登錄的從29種植物中克隆的86種幾丁質(zhì)酶基因，指出盡管在各類(lèi)幾丁質(zhì)酶基因中存在 一定的同源性，但這種同源性較低，沒(méi)有相對(duì)高度保守的核苷酸序列（LEV0RS0N J，CHLANC A。 Plant chitinase consensus sequences[J]〇 Plant Molecular Biology Reporter， 1997,15(2) :122-133)。這一結(jié)果表明，利用其它植物的幾丁質(zhì)酶基因的核苷酸序列作為探 針和引物進(jìn)行的克隆策略可能存在困難，這可能是導(dǎo)致目前在植物抗病基因工程中可利用 的幾丁質(zhì)酶基因來(lái)源狹窄的原因，也進(jìn)一步說(shuō)明幾丁質(zhì)酶很可能在高等植物中多個(gè)成員間 存在較大的功能差異。表1中給出了部分已經(jīng)克隆的幾丁質(zhì)酶基因（張志忠，吳菁華，呂 柳新，林義章。植物幾丁質(zhì)酶及其應(yīng)用研宄進(jìn)展。福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）2005， 34(4):494-499)。
[0006] 表 1
[0007]
[0008] 近年來(lái)，利用導(dǎo)入外源幾丁質(zhì)酶基因增強(qiáng)植物抗病性的成功案例較多，馬鈴薯 (南相日。菜豆幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯及后代表達(dá)。中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006, 22 (2) : 75-77)、 水稻(Nishizawa Y，Nishio Z，Nakazono K，Ksoma M，Nakajima E, UgakiM, Hibi T0Enhanced resistance to blast(Magnaporthe grisea)in transgenic japonica rice by constitutive expression of rice chitinase。 Theoretical and Applied Genetics， 1999,99:383-390)、黑楊（孟亮，李紅雙，金德敏，崔德才，王斌。轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因黑楊的獲 得。生物技術(shù)通報(bào)，2004⑶：48-51)、油菜（藍(lán)海燕，田穎川，王長(zhǎng)海。表達(dá)β -1，3-葡聚糖酶 及幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)基因?qū)胗筒说难绣吵鯃?bào)。中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2000,22(14) :6-10)、 西瓜（王果萍，王景雪，孫毅等。幾丁質(zhì)酶基因?qū)胛鞴现仓昙捌淇共⌒澡b定研宄。植物遺 傳資源學(xué)報(bào)，2003,4(2) :104-109)等多種植物已獲得了轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因的植株，其中目的 基因主要來(lái)源于植物，如水稻、煙草、菜豆等，也有來(lái)源于昆蟲(chóng)和微生物，轉(zhuǎn)化方法以根癌農(nóng) 桿菌介導(dǎo)法為主，轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的效果各種各樣，一般轉(zhuǎn)植物源幾丁質(zhì)酶基因?qū)δ承┎≡?的抗性均有所增強(qiáng)，且大多數(shù)轉(zhuǎn)化植物增強(qiáng)的抗性與其所表達(dá)的幾丁質(zhì)酶量呈正相關(guān)。盡 管轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因可以增強(qiáng)植物的抗病性，但這與物種、基因來(lái)源、類(lèi)型、導(dǎo)入目標(biāo)植株后 在染色體上的定位及病原菌種類(lèi)等均有關(guān)系。隨著對(duì)幾丁質(zhì)酶作用機(jī)理研宄的深入，通過(guò) 幾丁質(zhì)酶基因工程手段培育出具有抗性轉(zhuǎn)基因植物將成為防治植物真菌病害的有效途徑。
[0009] 關(guān)于幾丁質(zhì)酶在非生物逆境中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。研宄中首次從羊草中鹽堿脅 迫cDNA表達(dá)文庫(kù)中分離出一種新基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為：LcChi2,生物信息學(xué)分析表 明該基因與其他幾丁質(zhì)酶成員顯著不同，屬于幾丁質(zhì)酶家族的遠(yuǎn)源成員；轉(zhuǎn)基因煙草表明 LcChi2具有幾丁質(zhì)酶的特性，顯著提高植物抗真菌性和抗細(xì)菌性；過(guò)表達(dá)該基因的釀酒酵 母InVScl和煙草，研宄發(fā)現(xiàn)該基因能夠提高轉(zhuǎn)基因酵母的耐鹽性和轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽堿 性（李蕊沁，馮樹(shù)丹，于瑩，呂召志，黎莉，徐明華，尹悅佳，郝東云。羊草幾丁質(zhì)酶Class II 基因的克隆、生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)。中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2010年02期）。最新研宄 發(fā)現(xiàn)：過(guò)表達(dá)LcChi2基因除了表現(xiàn)抗真菌、抗細(xì)菌、抗鹽堿的生物特性外，并不具備抗所有 非生物逆境的能力，也不直接參與非生物逆境調(diào)控，具體表現(xiàn)為不抗旱、ABA不敏感等。 [0010]目前，關(guān)于羊草幾丁質(zhì)酶LcChi2基因在提高植物耐冷性發(fā)面的研宄未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為了提高植物耐冷性，本發(fā)明提供一種羊草幾丁質(zhì)酶LcChi2基因在提高植物耐 冷性方面的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明為解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下：
[0013] 本發(fā)明提供一種羊草幾丁質(zhì)酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的應(yīng)用。
[0014] 所述羊草幾丁質(zhì)酶LcChi2基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所示；所 述羊草幾丁質(zhì)酶LcChi2基因的核苷酸序列所編碼的多肽的氨基酸序列如列表中的SEQ ID NO: 2所示。
[0015] 該應(yīng)用過(guò)程包括以下步驟：
[0016] (1)將羊草幾丁質(zhì)酶LcChi2基因可操作地連于載體上的表達(dá)調(diào)