一種人重組乙型干擾素融合蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種人重組乙型干擾素融合蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型干擾素（又稱為β干擾素，Interferon-β , IFN-β )是由體內(nèi)纖維細(xì)胞和巨 噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，是一種糖蛋白，含166個(gè)氨基酸，分子量約為20, 500道爾頓，具有 抗炎癥功能，抗病毒、抗增殖以及免疫調(diào)節(jié)活性，其作為藥物可廣泛用于抗感染、抗腫瘤和 拮抗自身免疫性疾病。然而，乙型干擾素血漿半衰期短，只有頻繁給藥才能獲得令人滿意的 療效。但如此頻繁給藥在加上較長(zhǎng)的治療周期，使得病人難以承受，迫切需要研制作用時(shí)間 長(zhǎng)的乙型干擾素。
[0003] 人血清白蛋白（HSA)是人體血液中天然的物質(zhì)輸送載體，血清中含量最高，其相對(duì) 分子量約為65kDa，由585個(gè)氨基酸組成的單鏈球型蛋白質(zhì)，無(wú)酶學(xué)及免疫學(xué)活性，體內(nèi)半 衰期長(zhǎng)達(dá)19天。
[0004] 胳騎和S魚類動(dòng)物體內(nèi)存在著天然缺失輕鏈的重鏈抗體（heavy-chain antibody，HCAb)，這種抗體只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)（variable domain of heavy chain of HCAb，VHH)和兩個(gè)常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，單獨(dú)克隆并表達(dá)出來(lái)的VHH區(qū)，稱為重鏈單域抗體， 具有很好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與抗原結(jié)合活性，分子量只有15kDa，可溶性極高，不易聚集，能耐高 溫等致變性條件。
[0005] 噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)是一種應(yīng)用最廣泛的抗體庫(kù)技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)構(gòu)建抗體文 庫(kù)，然后將抗體基因表達(dá)于噬菌體表面，用固相化抗原對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的載體進(jìn)行淘篩，能夠獲 得高度特異性的抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種重組乙型干擾素融合蛋白，該融合蛋白具有較長(zhǎng)的半 衰期。
[0007] 本發(fā)明所述的一種人重組乙型干擾素融合蛋白，為人乙型干擾素與抗人血清白蛋 白重鏈單域抗體的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明述的融合蛋白的進(jìn)一步特征，所述抗人血清白蛋白重鏈單域抗體的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本發(fā)明采用羊駝作為免疫動(dòng)物，運(yùn)用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，從免疫羊駝外周血收 集淋巴細(xì)胞，構(gòu)建了庫(kù)容量為5X IO7的抗人血清白蛋白（HSA)重鏈抗體文庫(kù)。通過(guò)HSA篩 選，獲得1株抗HSA的重鏈抗體?？寺≡摽贵w的VHH獲得重鏈單域抗體，然后構(gòu)建重鏈單域 抗體與乙型干擾素融合表達(dá)克隆，導(dǎo)入到宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，獲得具有較長(zhǎng)作用時(shí)間的重 鏈單域抗體-乙型干擾素融合蛋白。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為在酵母細(xì)胞重組表達(dá)重鏈單域抗體-人乙型干擾素融合蛋白流程圖。
[0011] 圖2為pPicZ a -6His-Zipperl-CTHS-VHH-IFN轉(zhuǎn)化酵母菌后，挑取4單菌落的誘 導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。
[0012] 圖3為重鏈單域抗體-人乙型干擾素融合蛋白細(xì)胞病變抑制結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，目的在于解釋本發(fā)明的內(nèi)容而非 限制發(fā)明的保護(hù)范圍。下面實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件， 如 Sambrook 等人著，分子克隆：試驗(yàn)指南（New York，Cold Spring Habour Laboratory Press)中所述條件，或按照制造廠商建議條件進(jìn)行。
[0014] 1.抗HSA重鏈單域抗體（VHH)的篩選
[0015] (1)羊駝的免疫
[0016] 用人血清白蛋白（HSA)免疫兩只羊駝，免疫方案如下：
[0017] 免疫羊馬它抗原用量：0· 5mg，0· 5mg，1.0 mg，1.0 mg，2. Omg，2. Omg，4. Omg，4. Omg。
[0018] 免疫間隔時(shí)間：2周。
[0019] 免疫方法：
[0020] 第一次免疫：抗原加弗式完全佐劑研磨混勻，皮下多點(diǎn)注射。
[0021] 后續(xù)免疫：抗原加弗式不完全佐劑,皮下多點(diǎn)注射,0. 5ml/點(diǎn)，4點(diǎn)/次。每次免疫 前取少量血,用ELISA方法檢測(cè)羊駝血中抗HSA抗體的滴度。
[0022] (2)抗HSA免疫噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建
[0023] 收集免疫羊駝外周血，分離淋巴細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用特異性引 物，采用巢氏PCR方法擴(kuò)增重鏈可變區(qū)片段。構(gòu)建庫(kù)容量為5 X IO7的抗HSA免疫噬菌體抗 體庫(kù)，酶切鑒定重組率為90%。
[0024] 第一輪PCR引物：
[0025] 5,引物：5, -GATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGRGGAGG-3, SEQ ID NO. 3
[0026] 5' -GTCCTGGCTCTCTTCTACAAGG-3' SEQ ID NO. 4
[0027] 3' 引物：5' -CGCCATCAAGGTACCAGTTGA-3' SEQ ID NO. 5
[0028] 5' -GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3' SEQ ID NO. 6
[0029] 第二輪PCR引物：
[0030] 5,弓丨物：
[0031] -GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTGTGG-3 , SEQ ID NO. 7
[0032] -GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTRCAGCTGGTGGAGTCTGG-3 , SEQ ID NO. 8
[0033] -GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGG-3 , SEQ ID NO. 9
[0034] -GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3 , SEQ ID NO. 10
[0035] -GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCGTGCAGCTGGTGGATTCTGG-3 , SEQ ID NO. 11
[0036] -GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3 , SEQ ID NO. 12
[0037] 3,弓丨物：
[0038] 5, -GGACTAGTGCGGCCGCGTGAGGAGACGGTGACCTG-3, SEQ ID NO. 13
[0039] 5' -GGACTAGTGCGGCCGCTATGAGGAGACGGTGACCTG-3' SEQ ID NO. 14
[0040] 第一輪PCR反應(yīng)條件：94°C 5分鐘預(yù)變性，94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 50秒，35個(gè) 循環(huán)，72 °C 10分鐘。
[0041] 第二輪PCR反應(yīng)條件：94°C 5分鐘預(yù)變性，94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 50秒，30個(gè) 循環(huán)，72 °C 10分鐘。
[0042] (3)抗HSA免疫噬菌體抗體庫(kù)的富集篩選
[0043] 篩選抗原為HSA，用pH9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋抗原，濃度為5 μ g/ml，取2ml包被 免疫試管，對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行3輪富集篩選后，用噬菌體-ELASA方法篩選陽(yáng)性克隆。
[0044] (4)抗HSA免疫噬菌體抗體庫(kù)的篩選
[0045] 挑選192個(gè)富集篩選后的單菌落，37°C振搖過(guò)夜。然后按I :100轉(zhuǎn)接于新鮮 200ul2YTGA中，37°C振搖2. 5小時(shí)，M13K07超感染。3,500rpm，IOmin收集菌體，然后用 2001112￥了641(重懸細(xì)菌沉淀。301：振搖過(guò)夜，次日11，000印111離心151^11，取上清進(jìn)行鑒定。 用HSA包被ELISA板，加入上述上清，HRP標(biāo)記鼠抗噬菌體M13單抗（GE Healthcare)為二 杭，TMB顯色。M13K07為陰性對(duì)照，免疫羊駝血清為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得1 株陽(yáng)性克隆。然后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得抗HAS的VHH序列，其序列為SEQ ID NO. 2。
[0046] 2.表達(dá)VVH-IFN的酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
[0047] His-Zipper2_CTHS的DNA序列通過(guò)分別通過(guò)EcoRI和XhoI位點(diǎn)插入到 pPicZ α中，再通過(guò)BsaI和Xhol位點(diǎn)插入抗HAS的VHH，最后通過(guò)XhoI和XbaI位點(diǎn) 插入乙型干擾素 IFN，構(gòu)建酵母表達(dá)質(zhì)粒pPicZa -6His-Zipperl-CTHS-VHH-IFN，其中， 6His-Zipperl-CTHS-VHH-IFN 的序列為 SEQ ID NO. 1。
[0048] 其中，CTHS是SUMO的C末端（C-SUMO)的簡(jiǎn)寫。對(duì)應(yīng)的SUMO的N端簡(jiǎn)稱為NTHS (或NT)，Zipper是指亮氨酸拉鏈。
[0049] 實(shí)施例2.酵母表達(dá)和蛋白純化
[0050] 將質(zhì)粒pPicZ a -6His-Zipperl-CTHS-IFN轉(zhuǎn)化到畢赤酵母，挑取單克隆，接種至 含100ml BMGY培養(yǎng)基的IL隔板搖瓶中。在搖床中28-30°C，250-300rpm生長(zhǎng)至0D600=2-6， 以1500-3000g離心5min收集細(xì)胞，去除上清，用1/5-1/10原培養(yǎng)基體積的BMMY重懸細(xì)胞 (約10-20ml )，在接種于100mL隔板搖瓶中，用2層滅菌紗布或干酪包布蓋住瓶口，放入搖床 繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24小時(shí)，加入甲醇至終濃度為0. 5%以誘導(dǎo)。
[0051] 誘導(dǎo)結(jié)束后，以12, OOOrpm離心30min,取上清,用孔徑為0. 45 μ m濾膜過(guò)濾,然后 進(jìn)行Ni-NTA親和層析，采用連續(xù)梯度洗脫方式(平衡液：50mM Tris (pH8.0)，50mM NaCl, 2.5%Glycerol;洗脫液：50mM Tris (pH8.0)，50mM NaCl，2.5%Glycerol，500mM Imidazol)， 按峰收集，每個(gè)收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。
[0052] 將含有目的蛋白的收集樣品合并，加入6His-NTHS-Zipper2蛋白混勻， 6His-Zipperl-CTHS和6His-NTHS-Zipper2能夠重建SUMO蛋白分子（該方法見專利 ZL200810036879. X)。然后將混合物進(jìn)行SUMO酶切，切除重組成為完整的SUMO分子酶切的 反應(yīng)條件是按照Genecopoeoia公司CoolcutTM protease產(chǎn)品說(shuō)明書建議進(jìn)行。
[0053] 然后，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行Ni-NTA親和層析(平衡液：50mM Tris(pH8. 0)，50mM NaCl， 2.5%Glycerol，洗脫液：50mM Tris (pH8.0)，50mM NaCl，2.5%Glycerol，500mM Imidazol)， 收集穿透液，隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，獲得了 VHH-IFN蛋白。
[0054] 實(shí)施例3.乙型干擾素細(xì)胞病變抑制法（cytopathic effect inhibition, CPEI)
[0055] 將不同稀釋度的乙型干擾素樣品加入96孔平底培養(yǎng)板中，100 μ 1/孔；將不同稀 釋度的標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔平底培養(yǎng)板中，100 μ 1/孔；每孔加4X106/ml Wish細(xì)胞，100 μ 1/ 孔；除Wish細(xì)胞對(duì)照孔外，每孔加 VSV病毒，50 μ 1/孔；置5%C02, 37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48-52小 時(shí)；鏡下觀察病毒對(duì)照孔出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，棄上清，加入結(jié)晶紫染液染色5分鐘；用流水沖 洗培養(yǎng)板，直到?jīng)_洗液無(wú)色為止，晾干培養(yǎng)板；每孔加入70%乙醇150 μ 1/孔。使結(jié)晶紫充 分溶解；酶標(biāo)儀上比色，讀取600nm波長(zhǎng)的數(shù)值。
[0056] 米用Avonex (美國(guó)BIOGEN公司生產(chǎn)的乙型干擾素）作為對(duì)照，該藥于1995年通 過(guò)美國(guó)FDA批準(zhǔn)使用的用于多發(fā)性硬化病的治療藥，結(jié)果顯示，本發(fā)明所述的人重組乙型 干擾素融合蛋白（VHH-IFN蛋白）具有與對(duì)照相似的活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人重組乙型干擾素融合蛋白，為人乙型干擾素與抗人血清白蛋白重鏈單域抗體 的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述抗人血清白蛋白重鏈單域抗體 的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人重組乙型干擾素融合蛋白。所述人重組乙型干擾素融合蛋白為人乙型干擾素與抗人血清白蛋白重鏈單域抗體的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述抗人血清白蛋白重鏈單域抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建抗人血清白蛋白的重鏈單域抗體與乙型干擾素融合表達(dá)克隆，導(dǎo)入到宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，獲得具有較長(zhǎng)作用時(shí)間的重鏈單域抗體-乙型干擾素融合蛋白。
【IPC分類】C07K19/00
【公開號(hào)】CN104974263
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410140796
【發(fā)明人】李華平, 張金闊, 錢柳青, 范名俊, 朱苗苗
【申請(qǐng)人】廣州復(fù)能基因有限公司
【公開日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2014年4月9日