一種融合蛋白分子量分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種蛋白分子量分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞因子重組融合蛋白是一類利用基因工程的方法將編碼細胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列連接并表達相應(yīng)蛋白質(zhì)融合產(chǎn)物。其結(jié)構(gòu)特點為將細胞因子功能活性域與其他分子的活性域融合，各組分可發(fā)揮協(xié)同作用，使融合蛋白的生物學活性較各單體大大增強。融合蛋白糖基化修飾與其生物活性、結(jié)構(gòu)和藥代動力學均緊密相關(guān)，也會直接或間接影響其對蛋白酶的抗性、與Fe受體的結(jié)合、與補體Clq組份的相互作用、體內(nèi)半衰期、相關(guān)生物學功能效應(yīng)等。特定的糖基化修飾參與到重要的免疫細胞毒性效應(yīng)因子功能中，也能通過與新生Fe伽馬受體的結(jié)合來影響血清半衰期(RajuTSj Scallon BJ.Glycosylat1n in the Fe domain of IgG increases resistance toproteolytic cleavage by papain.B1chemical B1physical Research Communicat1ns2006, 341:797-803) (Wright A，Sato Y，Okada T，Chang K，Endo Tj Morrison S.1n vivotrafficking and catabolism of IgGl antibodies with Fe associated carbohydratesof differing structure.Glycob1logy 2000， 10:1347-1355)。
[0003]糖基化修飾對融合蛋白生物學功能是十分重要的，但復(fù)雜的糖基化修飾往往給蛋白結(jié)構(gòu)表征分析帶來相對于一般IgGl抗體更大的挑戰(zhàn)。如依那西普每個單體Fe部分有I個N-糖位點，F(xiàn)ab部分有2個N-糖位點，另外據(jù)文獻報道還含有13個O-糖位點(HouelS，Hilliard Mj Yu Y, McLoughlin N, Martin SM，Rudd PM，et al.N_and O-Glycosylat1nAnalysis of Etanercept Using Liquid Chromatography and QuadrupoIeTime—of—Flight Mass Spectrometry Equipped with Electron-Transfer Dissociat1nFunct1nality.Analytical Chemistry 2013 ;86:576-584)。rhCTLA4_Ig 每個單體 Fe 部分也有I個N-糖位點，F(xiàn)ab部分有2個N-糖位點(Bongers Jj Devincentis Jj Fu Jj HuangP，Kirkley DHjLeister K，et al.Characterizat1n of glycosylat1n sites for arecombinant IgGl monoclonal antibody and a CTLA4_Ig fus1n protein by liquidchromatographymass spectrometry peptide mapping.Journal of Chromatography A2011 ；1218:8140-9)，另外有2個0-糖位點。分子量分析可以在宏觀水平上對蛋白進行表征，可以在分子量水平確認蛋白表達是否正確，同時也可以確認蛋白的不同異構(gòu)體修飾形態(tài)及比例，為進一步確認蛋白在肽段水平上變化提供直觀的線索和依據(jù)。由于唾液酸以及Fab段上的N-糖對融合蛋白完整蛋白離子化效率抑制十分明顯，一般文獻報道均采用特異性酶如Ides和木瓜蛋白酶Papain將Fe段部分從完整單體上切下來分離后再進行分子量分析(Tan Qj Guo Qj Fang C，Wang C，Li B，Wang H，et al.Characterizat1n andcomparison of commercially available TNF receptor 2_Fc fus1n protein products.MAbs 2012;4:761-74) ； (Lynaugh H，Li H and Gong B.Rapid Fe glycosylat1n analysisof Fe fus1ns with IdeS and liquid chromatography mass spectrometry.MAbs 2013 ；5:761-74)。
[0004]因此，如何有效的對融合蛋白進行完整蛋白分子量分析仍是目前急需的解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種融合蛋白完整分子量分析方法，該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中N-糖和唾液酸對融合蛋白完整蛋白分子量分析時離子化效率的抑制，能準確測定去除N-糖和唾液酸后含O-糖核心的融合蛋白的分子量。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，包括如下步驟:1、融合蛋白N-糖(N-Glycosylat1ns)去除；2、融合蛋白唾液酸(Sialic Acid)去除；3、ES1-Q-TOF MS分析，去卷積計算。其中，步驟I與2先后順序可以互換。
[0006]更具體地，本發(fā)明公開了:
[0007]—種融合蛋白分子量分析方法，所述方法包括步驟:(I)融合蛋白N-糖去除和/或唾液酸去除；(2)對去除N-糖和/或唾液酸的融合蛋白進行分子量分析。
[0008]進一步地，發(fā)明公開了一種融合蛋白分子量分析方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:(I)融合蛋白N-糖去除，⑵融合蛋白唾液酸去除，(3)對去除N-糖和唾液酸的融合蛋白進行分子量分析；其中，上述步驟(I)和(2)順序可以互換。
[0009]優(yōu)選地，融合蛋白N-糖去除時溶液pH值為7.0?8.0 ;唾液酸去除時溶液pH值為4.0?7.0。更優(yōu)選地，所述pH值是通過酸性或堿性可揮發(fā)性溶液調(diào)節(jié)。
[0010]在一些具體實施例中，所述融合蛋白N-糖去除通過以下方法實現(xiàn):取融合蛋白樣品，加入緩沖液(例如=NH4HCO3或I % NH3.H2O)調(diào)節(jié)pH值至7.0?8.0，加入肽N-糖苷酶F，混勻后，37°C孵育24小時。
[0011]在一些具體實施例中，所述融合蛋白唾液酸去除通過以下方法實現(xiàn):取融合蛋白樣品，加入緩沖液(例如=NH4HCO3或I % FA (FA:甲酸))調(diào)節(jié)pH值至4.0?7.0，加入唾液酸酶，37°C孵育24小時。
[0012]優(yōu)選地，所述融合蛋白的分子量是通過ES1-Q-TOF MS方法進行分析。
[0013]在一些具體實施例中，所述ES1-Q-TOF MS分析采用以下方法實現(xiàn):將融合蛋白用50mM NH4HCO3 (pH8.0)溶液稀釋至 lmg/mL ;然后脫鹽柱(優(yōu)選MassPREPTM Micro DesaltingColumn, 20 μ m, 2.1 X 5mm, Waters公司)脫鹽；最后進行質(zhì)譜分析。
[0014]在一些實施例1?7中,所述融合蛋白是Etanercept,實施例8中所述融合蛋白是rhCTLA4-1g。
[0015]實驗結(jié)果表明，通過利用特異性脫糖酶去除融合蛋白N-糖和/或唾液酸后再對融合蛋白進行分析，可獲得含O-糖核心融合蛋白準確分子量。另外，實驗結(jié)果還表明，如待分析融合蛋白只進行N-糖去除而沒有進行唾液酸去除或者只進行唾液酸去除而沒有進行N-糖去除，融合蛋白在ESI源碎裂時離子化效率將受到較高的抑制，最后只能獲得少數(shù)幾個含O-糖核心融合蛋白準確分子量；如利用特異性脫糖酶既去除N-糖，也去除唾液酸，融合蛋白在ESI源碎裂時離子化效率抑制大大降低，最終可獲得絕大多數(shù)含O-糖核心融合蛋白準確分子量。另外，實驗結(jié)果表明，融合蛋白N-糖去除后再進行唾液酸去除時不調(diào)節(jié)緩沖液PH值，以及唾液酸去除后再進行N-糖去除時不調(diào)節(jié)緩沖液pH值，融合蛋白在ESI源碎裂時離子化效率也受到了一定的抑制，能獲得主要幾個含O-糖核心融合蛋白準確分子量，但效果不如調(diào)節(jié)緩沖液PH值的方式，如融合蛋白N-糖去除后再進行唾液酸去除時調(diào)節(jié)緩沖液pH值4.0?7.0，以及唾液酸去除后再進行N-糖去除時調(diào)節(jié)緩沖液pH值7.0?8.0，融合蛋白在ESI源碎裂時離子化效率抑制將大大降低，能獲得絕大多數(shù)含O-糖核心融合蛋白準確分子量。
[0016]總之，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:本發(fā)明能直接準確測定融合蛋白含O-糖核心異構(gòu)體分子量。
【附圖說明】
[0017]圖1，為本發(fā)明實施例1融合蛋白典型多電荷TIC圖；
[0018]圖2，為本發(fā)明實施例1融合蛋白去卷積化完整蛋白分子量分析結(jié)果圖；
[0019]圖3，為本發(fā)明實施例2融合蛋白典型多電荷TIC圖；
[0020]圖4，為本發(fā)明實施例2融合蛋白去卷積化完整蛋白分子量分析結(jié)果圖；
[0021]圖5，為本發(fā)明實施例3中pH4.0和pH5.0條件下脫唾液酸去卷積化完整蛋白分子量對比分析結(jié)果圖；
[0022]圖6，為本發(fā)明實施例3中pH5.0和pH6.0條件下脫唾液酸去卷積化完整蛋白分子量對比分析結(jié)果圖；
[0023]圖7，為本發(fā)明實施例3中pH6.0和pH7.0條件下脫唾液酸去卷積化完整蛋白分子量對比分析結(jié)果圖；
[0024]圖8，為本發(fā)明實施例4融合蛋白去卷積化完整蛋白分子量分析結(jié)果圖；
[0025]圖9，為本發(fā)明實施例5融合蛋白去卷積化完整蛋白分子量分析結(jié)果圖；
[0026]圖10，為本發(fā)明實施例6融合蛋白典型多電荷TIC圖；
[0027]圖11，為本發(fā)明實施例6融合蛋白去卷積化完整蛋白分子量分析結(jié)果圖；
[0028]圖12，為本發(fā)明實施例7融合蛋白典型多電荷TIC圖；
[0029]圖13，為本發(fā)明實施例7融合蛋白去卷積化完整蛋白分子量分析結(jié)果圖；
[0030]圖14，為本發(fā)明實施例8融合蛋白(rhCTLA4_Ig)典型多電荷TIC圖。
[0031]圖15，為本發(fā)明實施例8融合蛋白(rhCTLA4_Ig)去卷積化完整蛋白分子量分析結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0032]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進一步闡述，不應(yīng)理解為是對本發(fā)明的限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，均是按照常規(guī)條件或制造廠商所建議的條件進行實驗。實施例1?7中所述融合蛋白是Etanercept。
[0033]實施例1:融合蛋白完整分子量分析(先N-糖去除，然后唾液酸去除)
[0034]融合蛋白完整分子量分析步驟:
[0035](I) N-糖(Ν-Glycosylat1ns)去除
[0036]取50yg Etanercept融合蛋白樣品(輝瑞制藥有限公司，以下同)，加入50mMNH4HCO3 (ρΗ8.0)溶液至體積20 μ L，加入I μ L 4倍稀釋的肽N-糖苷酶PNGase F (NEB,500000u/mL)，混勻后，37°C孵育24小時。
[0037](2)唾液酸(Sialic Acid)去除
[0038]將⑴中孵育好的樣品，用I % FA調(diào)節(jié)pH值至5?6，加入唾液酸酶Neuraminidase (Roche, 1U/100 μ L) 0.5 μ L, 37°C僻育 24 小時。
[0039](3) ES1-Q-TOF MS 分析
[0040]脫唾液酸脫N-糖的融合蛋白采用50mM NH4HCO3 (pH8.0)溶液稀釋至lmg/mL ;然后MassPREPTM Micro Desalting Column 2.1 X5mm脫鹽柱(Waters 公司，以下同)脫鹽后，質(zhì)譜分析。
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