長效干擾素-α及其改造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體涉及融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉 及由具有人干擾素 Ct活性的融合蛋白及其編碼基因的改造優(yōu)化，以及該融合蛋白的表達 方法和在制備治療病毒性肝炎以及其它抗病毒藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 干擾素 -a (IFN-α )是一種具有多種功能的免疫活性糖蛋白，具有良好的抗病 毒、抗腫瘤等作用。重組人干擾素長期用于病毒性肝炎和腫瘤的治療，在乙肝和丙肝治 療中具有不易抗藥、效果持久等特點，是目前各國抗病毒治療指南中的一線藥物。傳統(tǒng)重組 人干擾素 α由于分子量較?。↖SkDa)，容易被腎小球過濾以及血清蛋白酶降解，從而造成 在人體中的半衰期較短，導(dǎo)致頻繁注射給藥和副作用較大等缺點。為了克服這個缺點，先靈 複雅（Schering-Plough,現(xiàn)被默克公司收購）和羅氏公司（Roche)先后開發(fā)了聚乙二醇 (PEG)化的長效干擾素（商品名分別為：配樂能、派羅欣），成功將其半衰期延長了 10倍以 上。
[0003] 除了 PEG化以外，HAS或Fc融合蛋白可以通過與FcRn的相互作用以及增大 蛋白質(zhì)分子量等方式來延長重組蛋白的半衰期。臨床研究證實，HAS融合的長效干擾 素 -a Albufero(Human Genome Sciences)雖然半衰期比派羅欣有所延長，但是其活性太 低，用量太大，造成安全隱患。這個現(xiàn)象提示，如能開發(fā)出生物活性與派羅欣相當、半衰期 又適當延長的新型長效干擾素-α，那么將具有較強的市場競爭力和廣闊的前景。目前已 經(jīng)有數(shù)個Fc融合蛋白長效藥物上市，如全球暢銷藥Enbrel (TNFR-Fc)。最近百健艾迪公司 (Biogen Idec)開發(fā)的重組VID因子和K因子與抗體Fc段的融合蛋白均成功獲得FDA批準上 市，極大的鼓舞了 Fc融合技術(shù)用于開發(fā)長效融合蛋白藥物的信心。
[0004] 本課題組研究人員經(jīng)過長期的研究積累，利用IgGl的Fc片段與IFNa -2b連接 構(gòu)成融合蛋白IFN-α/Fe,以提高IFN-α的體內(nèi)半衰期。此前已經(jīng)初步完成了長效干擾素 IFN-a /Fe的理化性質(zhì)的鑒定，抗病毒活性的研究和大鼠體內(nèi)半衰期研究，并已經(jīng)獲得相關(guān) 發(fā)明專利（肖衛(wèi)華、王磊，授權(quán)公告號：CN 1944463 B)。但是Fc片段結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有二硫鍵 和糖基化修飾，往往需要采用哺乳動物細胞進行表達，產(chǎn)業(yè)化成本昂貴。為了解決生產(chǎn)成本 的問題，我們利用畢赤酵母表達系統(tǒng)來生產(chǎn)的IFN- a /Fe融合蛋白。但是抗體分子的Fc段 存在N-糖基化位點，不過這個位點并不影響其與FcRn的結(jié)合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 在本發(fā)明中，為了避免酵母甘露糖型的糖基化修飾潛在的抗原性，本發(fā)明進一步 對Fc片段的297位糖基化位點（N)進行了基因定點突變（N突變成Q)，并在IFN- a與Fc 連接處引入了一段免疫惰性的柔性肽，構(gòu)建出糖基化位點突變并含有柔性連接肽的新長效 干擾素 a (IFN-a/Fc-MD)。最近有研究指出（Tianlei Ying, et al·，Soluble Monomeric IgGlFc, J. Biol. Chem. 2012, 287:19399-19408)，F(xiàn)e 片段與 FcRn 的結(jié)合并不依賴于其雙 鏈結(jié)構(gòu)，且考慮到干擾素分子本來就是以單體形式發(fā)揮生物學(xué)作用，故本研究又構(gòu)建了 單鏈Fc片段與IFNa-2b的融合蛋白（IFN-a/Fc-SC)。本發(fā)明完成了上述兩種新型的 IFN-a /Fe融合蛋白的設(shè)計、構(gòu)建、表達和純化，并將其與此前構(gòu)建的IFN-a /Fe融合蛋白 IFNa 2b_Fc γ I (IFN-a /Fc-WT)以及市場上的派羅欣（PEG-IFN-a )進行藥效學(xué)和藥代動 力學(xué)的比較，以確定最優(yōu)的蛋白設(shè)計形式（三種IFN-a /Fe融合蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1 所示）。
[0006] 具體地，本發(fā)明涉及以下各項：
[0007] 1. -種長效干擾素 -a融合蛋白，其由干擾素 -a分子與IgGl抗體分子Fe段突 變體連接而成，其中，所述突變?yōu)镮gGl第297位天冬酰胺突變成谷氨酰胺。
[0008] 2.根據(jù)第1項所述的長效干擾素-a融合蛋白，其中所述IgGl抗體分子Fe段的 鉸鏈區(qū)氨基酸被柔性多肽替代。
[0009] 3.根據(jù)第2項所述的長效干擾素-a融合蛋白，其中
[0010] I)Fe段的鉸鏈區(qū)N-末端8個氨基酸EPKSCDKT(SEQ ID NO: 1)被替換為 GGGGSGGG(SEQ ID N0:2);或
[0011] 2)Fc段的鉸鏈區(qū)N-末端15個氨基酸EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID N0:3)被替換成 免疫惰性軟肽 GGGGSGGGGS(SEQ ID N0:4)。
[0012] 4.根據(jù)第3項所述的長效干擾素-a融合蛋白，其中
[0013] 在1)的情況下，所述IgGl抗體分子Fe段是人IgGl第231 (Ala)至447 (Lys)位 的氨基酸序列；
[0014] 在2)的情況下，所述IgGl抗體分子Fe段是人IgGl第224至447位的氨基酸序 列。
[0015] 5.根據(jù)第1項所述的長效干擾素-α融合蛋白，所述干擾素-α是人干擾 素 -a 2b。6.根據(jù)第3項所述的長效干擾素-α融合蛋白，其氨基酸序列為以下各項之一：
[0016] 1)SEQ ID NO ：5 ；
[0017] 2)SEQIDN0:6。
[0018] 7.編碼第1-6項中任一項所述的長效干擾素-α融合蛋白的基因。
[0019] 8.根據(jù)第7項所述的基因，其核酸序列為SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :8。
[0020] 9.包含第7項所述的基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和重組菌，所述細胞系 優(yōu)選為畢赤酵母系。
[0021] 10.第1-6項任一項所述的長效干擾素-α融合蛋白用于制備藥物的用途，所述藥 物用于提高機體免疫力，抗病毒或抗腫瘤。
[0022] 本發(fā)明的IFN- a /Fc-MD的抗病毒活性略高于IFN- a /Fc-WT，略低于商品化長 效干擾素派羅欣PEG-IFN- α (相當于PEG-IFN- α的66 %~85 %活性），但是大鼠體內(nèi) 循環(huán)半衰期顯著長于派羅欣PEG-IFN-α，并可推測在人體內(nèi)將更加顯著的長于派羅欣 PEG-IFN-a ;同時，本發(fā)明的IFN-a /Fc-SC的抗病毒活性高于商品化長效干擾素派羅欣 PEG-IFN- a (相當于PEG-IFN- α的158 %~186 %活性）和IFN- a /Fc-WT，盡管在大鼠體 內(nèi)循環(huán)半衰期略低于派羅欣PEG-IFN-a，但是可以推測在人體內(nèi)的循環(huán)半衰期將長于派羅 欣 PEG-IFN-α。
【附圖說明】
[0023] 圖1.三種不同結(jié)構(gòu)形式的IFN-a /Fe融合蛋白示意圖；
[0024] 圖2. IFN- a /Fc-WT融合蛋白表達克隆篩選；
[0025] (A)DB, Dot blot,點雜交；（B)WB :Western blot，免疫印記（抗人 Fe 抗體）；
[0026] 圖3. IFN- a /Fc-WT融合蛋白發(fā)酵表達；
[0027] ㈧發(fā)酵過程中菌體生長曲線；
[0028] (B)目的蛋白累積時間點檢測；
[0029] 圖4. IFN- a /Fe融合蛋白純化與理化鑒定；
[0030] (A) IFN- a /Fe 融合蛋白純度 SDS-PAGE 檢測；
[0031] (B) IFN- a /Fe 融合蛋白 IFN- α 片段和 Fe 片段 Western blot 檢測；
[0032] (C) IFN- a /Fe融合蛋白糖基化修飾PAS染色檢測；
[0033] 圖5. IFN- a /Fe融合蛋白抗病毒活性檢測：
[0034] (A) WISH-VSV系統(tǒng)測定IFN- a /Fe融合蛋白抗病毒活性；
[0035] ⑶MDBK-VSV系統(tǒng)測定IFN- a /Fe融合蛋白抗病毒活性；
[0036] 圖6. IFN- a /Fe融合蛋白刺激PBMC轉(zhuǎn)錄OASl活力比較；
[0037] 圖7. IFN- a /Fe融合蛋白抗腫瘤細胞增殖活性檢測；
[0038] 圖8. IFN-a /Fe融合蛋白大鼠體內(nèi)循環(huán)半衰期檢測。
【具體實施方式】
[0039] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0040] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從標注的商業(yè)途徑得到。
[0041] 下述實施例中的所有引物合成和測序工作均由上海生工完成；畢赤酵母相關(guān)載體 和菌株均來源于 Invitrogen (Life technologies);培養(yǎng)基配方參見 Pichia Expression Kit，A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris，Invitrogen) 〇
[0042] 實施例1、新型長效干擾素 IFN- a /Fe的融合蛋白表達載體構(gòu)建
[0043] 一、IFN- a /Fe融合基因的擴增
[0044] 以本實驗室之前構(gòu)建并保存的質(zhì)粒pPIC9K-Kex-IFNa 2b_Fc γ 1 (詳情參見王磊 等，Chin J Biotech 2008, January 25 ;24(1) :53-62)為模板，使用引物 a-Fw和Fc-Rv(所 有引物序列見表1)，擴增目的基因。擴增產(chǎn)物同樣采用核酸凝膠回收試劑盒（Axygen公司， 以下同）回收。此基因產(chǎn)物兩端帶有BamH I和EcoR I酶切位點，命名為IFN-a /Fc-WT。
[0045] 使用質(zhì)粒pPIC9K-Kex_IFN a 2b_Fc γ 1為模板，使用三對引物a -Fw與SC-Rv、 SC-Fw與M-Rv、M-Fv與Fc-Rv分別擴增目的基因的三個片段。PCR程序設(shè)定為：94°C 2分 鐘，94°C 30秒，55°C 40秒，72°C 60秒，以上程序32個循環(huán)，72°C 10分鐘。擴增產(chǎn)物采用凝 膠回收試劑盒回收，操作步驟參見試劑盒說明。將回收所得三段基因混合作為模板，以引 物對a -Fw與Fc-Rv拼接完整基因。PCR程序設(shè)定為：94°C 5分鐘，94°C 30秒，55°C 40秒， 72°C 120秒，以上程序32個循環(huán)，72°C 10分鐘。擴增產(chǎn)物同樣采用核酸凝膠回收試劑盒回 收。此基因產(chǎn)物兩端帶有BamH I和EcoR I酶切位點，命名為IFN-a/Fc-SC。