重組抗her2/ps雙特異性抗體、其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗體領域，更具體地，本發(fā)明公開了一種重組雙特異性抗體、其制備方 法和其在抗實體瘤上的作用。
【背景技術】
[0002] 細胞凋亡是機體中的一個受嚴格調控的程序，高效清除凋亡細胞是免疫耐受的基 礎。在凋亡過程中，處于正常細胞的細胞膜內表層的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine， PS)翻轉至細胞膜外表層。M2型巨噬細胞利用細胞表面PS受體識別此信號從而吞噬 凋亡小體，同時，釋放腫瘤生長因子（tumor growth factor，TGF)-0,白細胞介素-10 (interlukinlO, IL-10)等炎癥抑制因子介導一系列免疫抑制程序[Gabrilovich D等， Nature Review Immunology. 2009, 9:162-174]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤血管上皮細胞、腫 瘤來源的外來體以及處于腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細胞也存在PS的外翻，并且這種外翻在接 受化療或放療后更加明顯。這些PS外翻的腫瘤細胞同樣通過增強腫瘤微環(huán)境中的巨噬細 胞向具有免疫抑制功能的M2型巨噬細胞分化，抑制具有強大細胞殺傷能力的Ml型巨噬細 胞生成從而促進腫瘤生長[Ran S 等，Clinical Cancer Research.2005, 11:1551-1562]。 研究表明，特異性針對人PS的單克隆抗體Bavituximab (美國Peregrine公開開發(fā)，CAS NO. 648904-28-3)通過多種不同的機制抑制了腫瘤的生長：1)利用抗體依賴的細胞介導 的毒性作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC)直接殺傷表達 PS的腫瘤來源細胞，尤其是腫瘤血管上皮細胞；2)阻斷M2型巨噬細胞對PS的識別，抑制 腫瘤微環(huán)境中免疫抑制策略的發(fā)展從而促進Ml型腫瘤殺傷巨噬細胞的活化，清除腫瘤 細胞[Huang X 等，Cancer Research. 2005, 65:4408-4416]。Bavituximab 在與多西他賽 (Docetaxel)聯(lián)合用藥的非小細胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma, NSCLC)二期臨 床中顯示了極好的療效，相比于多西他賽，中位總生存期提高了 4. 3個月，基于此數(shù)據(jù)，美 國FDA將其納入快速通道。同時，在乳腺癌的二線治療中Bavituximab與多西他賽的聯(lián)用 將患者中位總生存期從多西他賽單藥的11. 4個月提高到21. 7個月。
[0003] 約20%~25%的乳腺癌患者存在人類表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor，HER2)基因擴增或蛋白過量表達[Jahanzeb M 等，Clinical Breast Cancer. 2008,8:324-333]?？?HER2 單克隆抗體 Trastuzumab (商品名：Herceptin) 從1998年上市至今，一直高居單抗藥物銷量前五。通過直接殺傷HER2高表達的 乳腺癌細胞，Trastuzumab顯著改善腫瘤患者的預后[White C等，Annual Review Medicine. 2001，52:125-145]。但是在此過程中，不可避免地由于死細胞和凋亡細胞呈現(xiàn)大 量的細胞表面PS，腫瘤耐受型免疫應答被誘導。因此，構建一個可以同時特異性結合HER2 與PS兩個靶點的雙特異性抗體，實現(xiàn)在直接殺傷細胞表面HER2或PS陽性的腫瘤細胞的同 時，還抑制隨后腫瘤免疫耐受的發(fā)生，阻斷腫瘤免疫逃逸通路，一直是本領域的技術人員急 待解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明人進行了大量試驗，得到了一個可以同時阻斷 HER2與PS兩個靶點的雙特異性抗體，即本發(fā)明所述的"重組抗HER2/PS雙特異性抗體"，從 而完成了本發(fā)明。
[0005] 本發(fā)明公開了 ：
[0006] 1. 一種重組抗HER2/PS雙特異性抗體，其特征在于所述抗體既能與HER2結合，還 能與PS結合。
[0007] 2.上述重組抗HER2/PS雙特異性抗體，其特征在于，所述重組抗HER2/PS雙特異性 抗體可變區(qū)氨基酸序列包含抗HER2單克隆抗體的可變區(qū)和抗PS單克隆抗體可變區(qū)氨基酸 序列。
[0008] 3.上述重組抗HER2/PS雙特異性抗體，所述雙特異性抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列 如SEQ ID NO:6所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0009] 4.本發(fā)明所提供的重組抗HER2/PS雙特異性抗體，其特征在于，所述雙特異性抗 體重鏈氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示,輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0010] 5. -種分離的核酸分子，其編碼上述1-4任一所述抗HER2/PS雙特異性抗體。優(yōu) 選地，所述核酸分子重鏈核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，輕鏈核苷酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
[0011] 6. -種載體，其含有上述5所述的核酸分子，所述載體可以為pDRl，pcDNA3· 1( + )， pDHFF 及 pCHOl. 0 之一，優(yōu)選 pCHOl. 0。
[0012] 7. -種宿主細胞，其含有上述6所述的載體，優(yōu)選地，所述細胞為真核細胞，更優(yōu) 選地，所述細胞為哺乳動物細胞，最優(yōu)選地，所述細胞為中國倉鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary, CHO)細胞。
[0013] 8. -種制備上述抗HER2/PS雙特異性抗體的方法，該方法包括：
[0014] a)在表達條件下，培養(yǎng)上述7所述的宿主細胞，從而表達抗HER2/PS雙特異性抗 體；
[0015] b)分離或純化a)的抗HER2/PS雙特異性抗體。
[0016] 9.上述抗HER2/PS雙特異性抗體制備方法，包括以下步驟：
[0017] a)構建抗HER2/PS雙特異性抗體的重鏈融合基因和輕鏈融合基因；
[0018] b)將上述a)融合基因克隆到載體pCHOl. 0,構建表達載體pCHOl. 0 (anti-HER2/ PS)；
[0019] 〇)將上述13)的？0101.0(&拉丨-冊1?2/^)表達載體轉染010細胞，篩選，進行亞克 隆，將篩選得到的高表達克隆進行擴大培養(yǎng)，表達抗HER2/PS雙特異性抗體；
[0020] d)分離或純化c)所述抗HER2/PS雙特異性抗體。
[0021] 10. -種組合物，含有上述1-4任一所述的抗體和藥學上可接受的載體。
[0022] 11.上述1-4任一所述的抗HER2/PS雙特異性抗體或上述10所述組合物在制備抗 腫瘤藥物中的用途。
[0023] 12.上述11所述用途，還包括和其它的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。
[0024] 本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，可以為pDRl，pcDNA3. 1 ( + )，pDHFF及 pCHOl. 0 (如圖2)之一,表達載體中包括連接有合適的轉錄和翻譯調節(jié)序列的融合DNA序 列。
[0025] 本發(fā)明中，可用的宿主細胞為含有上述載體的細胞，可以是真核細胞，如哺乳動物 或昆蟲宿主細胞培養(yǎng)系統(tǒng)均可用于本發(fā)明的融合蛋白的表達，C0S，CH0，NS0, sf9及sf21 等均可適用于本發(fā)明；也可以為含有上述載體的原核細胞，可以為DH5a，BL21 (DE3)，TGl之 〇
[0026] 本發(fā)明中公開的抗HER2/PS雙特異性抗體的制備方法為在表達條件下，培養(yǎng)上述 的宿主細胞，從而表達抗HER2/PS雙特異性抗體；分離或純化所述的抗HER2/PS雙特異性抗 體。利用上述方法，可以將融合蛋白純化為基本均一的物質，例如在SDS-PAGE電泳上為單 一條帶。
[0027] 可以利用親和層析的方法對本發(fā)明公開的融合蛋白進行分離純化，根據(jù)所利用的 親和柱的特性，可以使用常規(guī)的方法例如高鹽緩沖液、改變PH等方法洗脫結合在親和柱上 的融合蛋白多肽。
[0028] 本發(fā)明公開的上述抗HER2/PS雙特異性抗體是通過以下方法得到的：抗HER2抗體 Trastuzumab(IgGl, κ )的八序列與Vh序列分別通過不同接頭短肽（例如：ASTKGP ;TVAAP) 與抗PS抗體Bavituximab (IgGl, κ )的N端相連接。更具體地，本發(fā)明的申請人通過大量 實驗，首先分別表達了抗HER2抗體的Vh和\片段基因，及抗PS抗體的重鏈和輕鏈全長基 因。在此基礎上利用Overlap PCR將Vh片段通過連接短肽與抗PS抗體的重鏈連接，'片段 通過另一連接短肽與抗PS抗體的輕鏈連接，然后進一步將上述融合后的輕鏈和重鏈基因 克隆到真核表達載體pCHOl.O (購自：Life Technology)中，構建成真核表達載體pCHOl.O (anti-HER2/PS)。將此表達載體通過脂質體法轉染CHO細胞，然后用嘌呤霉素和甲胺蝶呤 篩選陽性細胞克隆。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，用Protein A親 和柱分離或純化抗HER2/PS雙特異性抗體。
[0029] 本發(fā)明的申請人對上述的抗HER2/PS雙特異性抗體進行了體外、體內生物學實 驗。體外生物學實驗結果表明此抗體能很好地與HER2和/或PS同時結合?？笻ER2/PS雙 特異性抗體在小鼠體內的血漿半衰期為6. 3天，表明本發(fā)明的抗HER2/PS雙特異性抗體的 結構高度穩(wěn)定。
[0030] 本發(fā)明的申請人對上述的抗HER2/PS雙特異性抗體進行親和力檢測、HER2或 PS革E標介導的抗體依賴的細胞介導的毒性作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC)、蛋白藥代動力學實驗、體內抑瘤等實驗，實驗結果表明，本發(fā)明公開 的抗HER2/PS雙特異性抗體可以同時結合細胞膜表面HER2和PS，阻斷兩者的信號傳導通 路。一方面，本發(fā)明的抗HER2/PS雙特異性抗體強大的ADCC效應介導了對高表達HER2或 細胞表面PS的腫瘤細胞的直接殺傷；另一方面，該抗HER2/PS雙特異性抗體