一種補(bǔ)充人體必需氨基酸的口服重組營養(yǎng)多肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及必需氨基酸構(gòu)成多肽及其重組芽孢表面展示的制備方法及產(chǎn)品，具體 涉及一種補(bǔ)充人體必需氨基酸的口服重組營養(yǎng)多肽的制備方法，屬于重組融合蛋白藥物技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基酸（Aminoacid)是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，賦予蛋白質(zhì)特定的分子結(jié)構(gòu) 形態(tài)，參與蛋白質(zhì)的催化、運輸、運動、防御與保護(hù)信息的傳遞等生理生化過程。自然界中 組成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是20種，其中人體不能合成或合成速度較慢滿足不了人體新 陳代謝需要的氨基酸稱為必需氨基酸。必需氨基酸通常有8種，即異亮氨酸、亮氨酸、賴 氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸，一般由食物蛋白質(zhì)供給。如果人體缺 乏任何一種必需氨基酸，就可導(dǎo)致生理功能異常，影響抗體代謝的正常進(jìn)行，從而使機(jī)體 的免疫功能下降而導(dǎo)致疾病。必需氨基酸攝入不足也會引起胰島素合成的減少，這樣就 容易引起血糖的升高導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生發(fā)展（MiyakeT,AbeM,FurukawaS,etal. Long-termbranched-chainaminoacidsupplementationimprovesglucosetolerance inpatientswithnonalcoholicsteatohepatitis-relatedcirrhosis.InternMed, 2012，51(16): 2151-2155.)。人體隨著年齡的變化其蛋白質(zhì)的合成和降解也在發(fā)生變化， 一般認(rèn)為老年人體內(nèi)的蛋白質(zhì)分解較多而合成較慢，所以老年人對于青壯年來說需要合成 蛋白質(zhì)的原料更多，特別是對甲硫氨酸和賴氨酸的需求（TatpatiLL,IrvingBA,TomA, etal.Theeffectofbranchedchainaminoacidsonskeletalmusclemitochondrial functioninyoungandelderlyadults.JClinEndorcrinolMetab, 2010， 95(2): 894-902)。近年研究報告，老年人與中青年人給予相同營養(yǎng)條件，但老年人其血漿氨基酸 (纈、亮、酪、賴、蛋、絲、丙氨酸）含量減低，特別支鏈氨基酸BCAA(纈、亮、異亮氨酸）顯示不 足。1998年美國"發(fā)現(xiàn)"號航天飛機(jī)在太空的人體試驗證明了必需氨基酸的攝入能夠提高 機(jī)體的抵抗力和延緩衰老，后續(xù)的臨床試驗也說明了必需氨基酸的補(bǔ)充對于老年人來說相 當(dāng)必要。運動營養(yǎng)學(xué)研究也表明BCAA的補(bǔ)充能夠減慢能源物質(zhì)的消耗，延緩疲勞的發(fā)生， 促進(jìn)疲勞的恢復(fù)（KimDH,KimSH,JeongWS,etal·EffectofBCAAintakeduring enduranceexercisesonfatiguesubstances,muscledamagesubstance,andenergy metabolismsubstances.JExercNutritionBiochem, 2013, 17(4): 169-180·)。目前 市場上有許多相關(guān)的復(fù)合氨基酸口服液，但是這類產(chǎn)品價格昂貴，且支鏈氨基酸BCAA所含 比例不高，容易受到胃腸道極端環(huán)境對氨基酸結(jié)構(gòu)的影響和破壞，降低吸收效率。目前已有 通過基因工程的方法用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)重組各種營養(yǎng)多肽，但要實現(xiàn)口服來消化多肽來 補(bǔ)充必需氨基酸，提高人體運動效率和減少疲勞仍有許多的缺點和不足，因為大腸桿菌含 有許多內(nèi)毒素，這樣對產(chǎn)品純度的要求極高，任何微量的雜蛋白都可能造成嚴(yán)重的免疫反 應(yīng)。這使得發(fā)酵法生產(chǎn)重組營養(yǎng)多肽的分離純化方法和步驟復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高。
[0003] 枯草芽孢桿菌為環(huán)境友好型細(xì)菌，對弧菌、大腸桿菌和桿狀病毒等有害細(xì)菌有很 強(qiáng)的抑制作用，營養(yǎng)缺乏時能形成處于代謝休眠狀態(tài)的芽孢，在適宜條件下芽孢又能萌發(fā) 成具有繁殖能力的營養(yǎng)細(xì)胞，產(chǎn)生大量多種維生素、有機(jī)酸、氨基酸、蛋白酶、糖化酶等促進(jìn) 消化吸收的物質(zhì)。芽孢容易培養(yǎng)，比重大易分離、不需要復(fù)雜的分離純化操作。芽孢是生物 界中抗逆性最強(qiáng)的生命體，其穩(wěn)定性好，能耐氧化，耐高溫，能長期耐60°C高溫，在120Γ~ 140°C還能生存幾小時，并且在抗化學(xué)藥物和抗輻射等方面也十分突出，可在惡劣環(huán)境中存 活幾年至幾十年。芽孢在酸性胃環(huán)境中能保持活性，可以耐唾液和膽汁的攻擊，順利通過 動物消化道直達(dá)大小腸，可作為極端環(huán)境(如胃腸道）下異源蛋白或生物活性分子的載體 (OggioniMR,CiabattiniA,CupponeAM,andPozziG. 2003.Bacillussporesfor vaccinedelivery.Vaccine. 31: 96-101)?？莶菅挎邨U菌以孢子狀態(tài)進(jìn)入消化道后，迅 速由休眠狀態(tài)復(fù)活，在短期內(nèi)繁殖成高含菌量的優(yōu)勢種群，消耗掉腸道內(nèi)大量氧氣，并能產(chǎn) 生過氧化氫、細(xì)菌素，建立微生態(tài)平衡，促進(jìn)有益厭氧微生物的繁殖，抑制有害細(xì)菌(大腸桿 菌、沙門氏桿菌）的生長，因而能預(yù)防腹瀉、下痢等腸胃道疾病，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力和體質(zhì)水 平。目前市場上已經(jīng)有口服枯草芽孢桿菌活菌膠囊產(chǎn)品，北京紫竹藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字 S20030018 (http://www. 777aaa.com/html/yao/200791823 402711963569029.htm)，表明 枯草芽孢桿菌芽孢可以通過人口服使用而產(chǎn)生藥效性。
[0004] 本發(fā)明的目的在于根據(jù)人體胃腸道的消化特征，以益生菌枯草芽孢桿菌芽孢衣殼 蛋白為載體，通過芽孢展示技術(shù)將帶有腸激酶標(biāo)簽Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的營養(yǎng)多肽展示 在芽孢表面，使多肽獲得快速大量表達(dá)具有良好抗逆性的同時能夠在人體腸道進(jìn)行增殖和 自由消化吸收，適用于快速大量制備具有補(bǔ)充必需氨基酸功效的重組營養(yǎng)多肽的口服保健 品。該產(chǎn)品結(jié)合了枯草芽孢桿菌的抗逆性特征和人體胃腸道的消化特點，增加了腸激酶位 點，開發(fā)出能夠在人體口服進(jìn)行自由消化吸收的營養(yǎng)多肽保健品，同時，能進(jìn)行大規(guī)模的工 業(yè)生產(chǎn)，迄今尚未見類似的報道和發(fā)明專利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了有效獲得補(bǔ)充人體必需氨基酸來提高人體營養(yǎng)和運動效率，本發(fā)明提供了一 種表面展示富含BCAA營養(yǎng)多肽重組芽孢的制備方法和產(chǎn)品。本發(fā)明以枯草芽孢桿菌芽孢 衣殼蛋白CotC為載體，通過芽孢表面展示技術(shù)將帶有腸激酶標(biāo)簽Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的 營養(yǎng)多肽展示在枯草芽孢桿菌的芽孢表面，可用于動物直接口服，成為一種新型提高運動 效率富含BCAA的營養(yǎng)多肽，其在安全性、耐受性、藥效學(xué)以及藥代動力學(xué)等方面與復(fù)合氨 基酸具有類似的功效。相對于其它氨基酸口服液產(chǎn)品，本發(fā)明表面展示營養(yǎng)多肽的制備方 法主要用于機(jī)體為提高運動效率服用，同時具有工業(yè)化生產(chǎn)特點，具有更廣泛的應(yīng)用價值。 這種產(chǎn)品的發(fā)明克服了當(dāng)前BCAA來源于化學(xué)合成的限制，同時也克服了大腸桿菌發(fā)酵生 產(chǎn)的營養(yǎng)多肽分離純化過程復(fù)雜的缺點，在保健品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種口服重組營養(yǎng)多肽的制備方法，利用枯草芽孢 桿菌芽孢衣殼蛋白基因CotC為分子載體，與帶有腸激酶標(biāo)簽的營養(yǎng)多肽基因np重組，構(gòu)建 融合表達(dá)的整合型重組質(zhì)粒PJS700-NP，并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌獲得枯草芽孢桿菌重組菌株 SaciWys 168 /pJS700-NP，誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生重組芽孢，在重組芽孢表面展示 有重組營養(yǎng)多肽，所述重組芽孢可通過口服補(bǔ)充人體必需氨基酸。
[0007] 一種重組芽孢，是由枯草芽孢桿菌重組菌株168 /pJS700-NP 誘導(dǎo)形成的重組芽孢，其表面展示有帶有腸激酶標(biāo)簽的融合蛋白CotC-NP。本發(fā)明的具體操 作是： (1) 設(shè)計一段DNA片段（SEQIDNO. 1)，包含營養(yǎng)多肽基因片段，命名為np，所述營養(yǎng)多 肽基因片段包括人體必需八種氨基酸的(賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異 亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸）基因片段，進(jìn)一步的，所述營養(yǎng)多肽基因np包括BCAA(支鏈氨基 酸）基因片段； (2) 通過PCR的方法從公司合成DNA片段(上海生工）中擴(kuò)增獲得營養(yǎng)多肽基因np， 將獲得的基因插入到載體PMD18-T中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a保存；克隆的重組質(zhì)粒命名為 PMD18-T-NP，重組子菌株命名為DH5a/pMD18-T-NP; (3