使用受體Na/K-ATPase/Src復(fù)合物進(jìn)行的測(cè)定法和基于細(xì)胞的測(cè)試及其用圖
【專(zhuān)利說(shuō)明】使用受體Na/K-ATPase/Src復(fù)合物進(jìn)行的測(cè)定法和基于細(xì) 胞的測(cè)試及其用途
[0001] 發(fā)明人：謝子建，Joseph I. Shapiro,賴(lài)芳芳
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/664, 232 (提交于2012年5月8日）的權(quán)益， 其全部公開(kāi)明確地通過(guò)引用并入本文。
[0004] 關(guān)于聯(lián)邦資助研宄的聲明
[0005] 本發(fā)明在美國(guó)政府支持下進(jìn)行，基金編號(hào)為HL-109015,由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研宄院基 金編號(hào)頒布。美國(guó)政府擁有本發(fā)明的特定權(quán)利。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域及工業(yè)應(yīng)用
[0007] 本發(fā)明涉及操作方法，其篩選受體Na/K-ATPase/Src的激動(dòng)劑和拮抗劑，并涉及 鑒定不飽和脂肪酸、二硫化谷胱甘肽（GSSG)和有機(jī)硫化合物衍生物鑒定為部分激動(dòng)劑，鑒 定MB-5、姜黃素、姜黃素衍生物、丹參素、丹參酮、丹參酮衍生物、黃芪甲苷IV和阿魏酸為受 體拮抗劑。
[0008] 發(fā)明背景
[0009] 癌癥是全球死亡發(fā)生的主要致因。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO)統(tǒng)計(jì)，2008年癌癥在 世界范圍引起的死亡為760萬(wàn)例，占總死亡的約13%，預(yù)期這一數(shù)字到2030年為止會(huì)增加 到1200萬(wàn)例。充血性心臟衰竭（Congestive Heart Failure，CHF)的發(fā)生率也呈上升趨 勢(shì)，在美國(guó)有500萬(wàn)人受其影響。1000名70歲以上人群中有大約8人被診斷為患有CHF。
[0010] 因?yàn)槭荏wNa/K-ATPase/Src復(fù)合物的激動(dòng)劑造成的生理刺激對(duì)正常的腎、心和肺 功能的維持十分重要，且其能保護(hù)器官，所以對(duì)受體Na/K-ATPase/Src復(fù)合物的激動(dòng)劑的 開(kāi)發(fā)是有益的。因?yàn)槌掷m(xù)的刺激會(huì)導(dǎo)致異常生長(zhǎng)（腫瘤）和器官纖維化，所以拮抗劑的開(kāi) 發(fā)可用于癌癥和慢性器官退行疾病的治療劑。
[0011] Na/K-ATPase在維持細(xì)胞、器官和整個(gè)身體中電解質(zhì)和液體平衡中起作用。哺乳動(dòng) 物細(xì)胞的Na/K-ATPase與多種膜及細(xì)胞溶膠蛋白質(zhì)相互作用，由此起到信號(hào)傳導(dǎo)受體的作 用。Src是一種非受體酪氨酸激酶，能與Na/K-ATPase形成受體復(fù)合物并調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分 化、凋亡和纖維化，見(jiàn)圖1的示意圖。
[0012] 生理濃度的強(qiáng)心類(lèi)固醇對(duì)Src受體復(fù)合物的激活在腎臟、心血管功能調(diào)節(jié)上有重 要作用。此外，Src受體復(fù)合物的持續(xù)激活導(dǎo)致ROS應(yīng)激反應(yīng)，其促進(jìn)多種疾病的發(fā)生，包 括癌癥、高血壓、先兆子癇，終末期腎病，充血性心臟衰竭和糖尿病。
[0013] Na/K-ATPase酶廣泛表達(dá)于大多數(shù)真核細(xì)胞中并對(duì)維持跨膜離子梯度至關(guān)重要， 其通過(guò)將Na +泵出細(xì)胞并將K+泵入細(xì)胞。在結(jié)構(gòu)上，該酶由兩個(gè)非共價(jià)連接的a和0亞 基構(gòu)成。Na/K-ATPase的a亞基具有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其N(xiāo)-和C-末端都位于細(xì)胞質(zhì)中。 a亞基由數(shù)個(gè)得到良好表征的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：執(zhí)行子（A)結(jié)構(gòu)域由N-末端和第二個(gè)連接于 跨膜螺旋M2和M3的細(xì)胞溶膠結(jié)構(gòu)域（CD2)構(gòu)成；高度保守的不連續(xù)磷酸化（P)結(jié)構(gòu)域靠 近質(zhì)膜；以及一個(gè)相對(duì)分離的核苷酸結(jié)合（N)結(jié)構(gòu)域。在離子泵循環(huán)中，這些結(jié)構(gòu)還顯示有 A和N結(jié)構(gòu)域的顯著運(yùn)動(dòng)。在傳輸循環(huán)中，A結(jié)構(gòu)域旋轉(zhuǎn)，而N結(jié)構(gòu)域閉合，這開(kāi)啟了（El) 并關(guān)閉了（E2)A、N和P結(jié)構(gòu)域。
[0014] 先前，本發(fā)明人和其他人員已經(jīng)證明強(qiáng)心類(lèi)固醇（Cardiotonic Steroid，CTS)如 烏本苷與Na/K-ATPase的結(jié)合刺激多個(gè)蛋白質(zhì)激酶的級(jí)聯(lián)效應(yīng)。此外，Src的敲除消除了 這些激活效應(yīng)中的大部分。Src作為Src家族非受體激酶家族的成員之一，在很多細(xì)胞外刺 激即細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和應(yīng)激反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要作用，而且是特定癌癥和骨 病中進(jìn)行治療干預(yù)的良好革巴標(biāo)。
[0015] Na/K-ATPase與Src通過(guò)至少兩個(gè)結(jié)合基序直接相互作用：一個(gè)基序在a 1亞基 的⑶2和Src SH2之間；另一個(gè)涉及到第三細(xì)胞溶膠結(jié)構(gòu)域（⑶3)和Src激酶結(jié)構(gòu)域。所 形成的該Na/K-ATPase和Src的復(fù)合物起受體作用，由此引發(fā)蛋白質(zhì)激酶的級(jí)聯(lián)效應(yīng)。
[0016] 例如，烏本苷與Na/K-ATPase的結(jié)合會(huì)破壞后者的相互作用然后導(dǎo)致不同通路的 組裝和激活，包括ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)、PLC/PKC通路及線(xiàn)粒體中ROS產(chǎn)生。此外，這種相互作用使 Src保持失活狀態(tài)。因此，Na/K-ATPase起到內(nèi)源Src負(fù)調(diào)節(jié)子的作用。見(jiàn)例如共同發(fā)明人 的待審申請(qǐng)：美國(guó)出版號(hào)2011/0245167(出版于2011年10月6日）、PCT/US07/023,011(提 交于2007年10月17日（出版號(hào)為W02808/054792, 2008年5月8日），其要求美國(guó)序列號(hào) 60/855,482(提交于2006年10月16日）的優(yōu)先權(quán)，這些申請(qǐng)明確地通過(guò)引用并入本文。
[0017] 有對(duì)革巴向新發(fā)現(xiàn)的Na/K-ATPase/Src受體復(fù)合物，以開(kāi)發(fā)新型受體激動(dòng)劑或詰抗 劑的需要，使Na/K-ATPase/Src復(fù)合物的受體功能可以得到刺激（用于處理如心肌缺血/ 再灌注損傷等疾?。┗虻玫揭种疲ㄓ糜谔幚斫M織纖維化、充血性心臟衰竭和癌癥等疾病）。 [0018]因?yàn)橛兄髯宰陨砟康墓δ芙Y(jié)構(gòu)域形式的相關(guān)蛋白質(zhì)的整個(gè)家族都能得到鑒別， 所以這種通用方法將具有極大的適用性。對(duì)這些相關(guān)蛋白質(zhì)的了解將極大地幫助我們理解 多種生理學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)或死亡、惡變、腎臟/心血管功能及免疫反應(yīng)。
[0019] 這種方法還有助于不斷發(fā)展更加有效的治療性、診斷性或預(yù)防性試劑，其具有 更少的副作用。這一點(diǎn)的重要性不斷增加，因?yàn)槟壳叭藗兿嘈艂鹘y(tǒng)中醫(yī)（TCM)用于處理 患者的用途是溫和療法，同時(shí)也具有高度的商業(yè)性。植物及其提取物一度是治療者用于 處理患者的最重要的物群。世界范圍的人群中有很多仍然嚴(yán)重依賴(lài)于草藥藥物（herbal medicine)作為其主要的治療來(lái)源。而且，目前處方藥物中很多活性組分都是首次在植物中 鑒定出的，而且現(xiàn)今最受歡迎的藥物中有很多來(lái)源于植物材料。
[0020] 另外，這種備選的醫(yī)療手段得到越來(lái)越廣泛的接受，在美國(guó)也得到使用，用于處理 廣泛的病況及健康的維持。據(jù)估計(jì)，兩個(gè)美國(guó)人中就有一個(gè)正不時(shí)使用替代療法。具體而 言，患者處理其癌癥的最受歡迎的補(bǔ)充手段或完全的替代手段是使用植物性試劑/草藥。
[0021] 盡管對(duì)人類(lèi)患者施用植物或其提取物的這種方法已經(jīng)進(jìn)行了數(shù)個(gè)世紀(jì)，但仍不能 夠確定何種精確的量能提供有效性。即，由于植物的本質(zhì)是活體形式，所以由于其中有效成 分的量可能不同，使得每個(gè)植物都是獨(dú)特的。另外，不同的變化情況會(huì)導(dǎo)致含有不同量的有 效成分；例如，有人已經(jīng)注意到如果植物來(lái)源于氣候更熱帶的地區(qū)，則果實(shí)會(huì)更辛辣。
[0022] 具體而言，傳統(tǒng)中醫(yī)（TCM)經(jīng)常是患者選擇其他和/或替代手段處理其障礙時(shí)的 一種處理模式選項(xiàng)。例如，患者既使用TCM作為抗癌試劑，也用其減輕標(biāo)準(zhǔn)化療的副作用。 然而，TCM缺少西醫(yī)所要求的科學(xué)健全的方法論，且使用TCM經(jīng)常有效或無(wú)效。
[0023] 仍然有發(fā)現(xiàn)特異性草藥提取物（herbal extracts)及其組合的需要，其具有特異 的實(shí)用性并且有科學(xué)證據(jù)證明其能在所述用途中起作用的機(jī)制。
[0024] 本發(fā)明提供的正是這樣的新型組合物和方法。
[0025] 發(fā)明概述
[0026] Na/K-ATPase a 1亞基和Src能形成受體復(fù)合物。如圖1中所示，內(nèi)源的強(qiáng)心類(lèi)固 醇（CTS)和洋地黃類(lèi)藥物如烏本苷起激動(dòng)劑的作用并調(diào)動(dòng)所述受體復(fù)合物。隨后，引起下 游蛋白質(zhì)激酶的級(jí)聯(lián)效應(yīng)。通過(guò)這些受體Na/K-ATPase/Src復(fù)合物激活的這些通路在調(diào)控 細(xì)胞生長(zhǎng)、腎鹽處理和器官重塑方面起重要作用。
[0027] 本文描述的是一種鑒定改變Src活性的化合物的方法，其中所述方法包含：
[0028] i)純化a I Na/K-ATPase 以獲得 Na/K-ATPase，其顯示了高于 800 y mol Pi/mg蛋 白質(zhì)A的特異活性；
[0029] ii)將步驟（i)中純化的Na/K-ATPase與Src混合，以形成Src活性受抑制的受體 Na/K-ATPase/Src復(fù)合物；
[0030] iii)將步驟（ii)中的受體Na/K-ATPase/Src復(fù)合物暴露于化合物，其中該化合物 的結(jié)合將受抑制的Src從受體Na/K-ATPase/Src復(fù)合物中釋放，導(dǎo)致Src活性的增加；以及
[0031] iv)測(cè)量Src活性的增加，其中增加的Src活性指示該化合物改變了 Src的活性。
[0032] 在特定實(shí)施方式中，所述方法包括確定相比于Src活性的對(duì)照水平，是否有Src活 性的增強(qiáng)水平，其中Src活性水平的增強(qiáng)指示該化合物為激動(dòng)劑，而其中相對(duì)于對(duì)照水平， Src活性水平的降低指示該化合物為拮抗劑。
[0033] 在特定實(shí)施方式中，受體Na/K-ATPase/Src復(fù)合物的激動(dòng)劑包含強(qiáng)心類(lèi)固醇。
[0034] 在特定實(shí)施方式中，受體Na/K-ATPase/Src復(fù)合物的激動(dòng)劑包含烏本苷、地高辛、 海蟾蜍毒素（MBG)、油酸、二十二碳六烯酸（DHA)、谷胱甘肽二硫化物（GSSG)和異硫氰酸烯 丙酯中的至少一種或多種。
[0035] 在特定實(shí)施方式中，受體Na/K-ATPase/Src復(fù)合物的拮抗劑包含3, 4, 5-三羥基咕 噸酮（MB5)、3,4,5,6-四羥基咕噸酮（MB7)、姜黃素、雙脫甲氧基姜黃素、丹參酮I、丹參素 鈉、黃芪甲苷IV、阿魏酸和丹參酮IIA中的兩種或多種。
[0036]在特定實(shí)施方式中，受體Na/K-ATPase/Src復(fù)合物的拮抗劑包括丹參酮I、丹參素 鈉、黃芪甲苷IV和阿魏酸的組合。
[0037] 在特定實(shí)施方式中，受體Na/K-ATPase/Src復(fù)合物的激動(dòng)劑可見(jiàn)于黨參、血參根、 丹參（radixsalviamiltiorrhizae)、當(dāng)歸、西當(dāng)歸(angelicasinensis)、黃苗和黃耆 (astragalus)中的一種或多種。
[0038] 在特定實(shí)施方式中，所述化合物用于處理與心臟肥大、組織纖維化、充血性心臟衰 竭、癌癥、傷口或皮膚損傷中一種或多種相關(guān)的障礙。
[0039] 在特定實(shí)施方式中，所述化合物被鑒定用于處理某種障礙，所述方法進(jìn)一步包括： 用該化合物進(jìn)行測(cè)定法，以：i)如果化合物為激動(dòng)劑，使Src從受體Na/K-ATPase復(fù)合物中 釋放；或ii)如果化合物為詰抗劑，阻止Src從受體Na/K-ATPase復(fù)合物中釋放；并確定化 合物是否為Src激活劑或非ATP-競(jìng)爭(zhēng)性的Src抑制劑，其中顯著抑制所述障礙的化合物為 適于處理所述障礙的化合物。
[0040] 在特定實(shí)施方式中，所述方法包括診斷受試者是否患有某種障礙，通過(guò)：提供來(lái) 自受試者的樣品；將樣品與受體Na/K-ATPase復(fù)合物相接觸；確定樣品中Src活性的水平 并與參照物相比較，其中與參照物比較Src活性的水平有差異則指示該受試者患有此種障 礙。
[0041] 在特定實(shí)施方式中，所述方法評(píng)估用于障礙的處理，通過(guò)：提供來(lái)自受試者的樣 品；將樣品與受體NaA-ATPase復(fù)合物相接觸；施用一種或多種劑量的處理；確定樣品中 Src活性的水平，與參照物相比較，其中與參照物比較Src活性的水平有差異則指示所述處 理有效。
[0042] 在特定實(shí)施方式中，所述方法包括確定受試者患上某種障礙的并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，通 過(guò)：提供來(lái)自受試者的樣品；將樣品與受體Na/K-ATPase復(fù)合物相接觸；確定樣品中Src活 性的水平，與參照物相比較，其中與參照物比較Src活性的水平有差異則指示受試者有患 上該并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0043] 在特定實(shí)施方式中，所述方法包括確定何時(shí)可以終止施用于受試者以處理某種障 礙的處理模式，通過(guò)：提供來(lái)自受試者的樣品；將樣品與受體Na/K-ATPase復(fù)合物相接觸； 確定樣品中Src活性的水平，與參照物相比較，其中Src活性的接近參照物中Src的水平則 指示所述處理可被終止。
[0044] 在特定實(shí)施方式中，所述方法包括確定何時(shí)可以在受試者中