優(yōu)化的高產(chǎn)率表達(dá)多肽的表達(dá)盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明尤其涉及適于表達(dá)目標(biāo)多肽的表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒包括特定的5' UTR 和hCD33分泌性前導(dǎo)序列的組合。發(fā)現(xiàn)此遺傳元件的特定組合意外地引起目標(biāo)多肽表達(dá)水 平顯著優(yōu)于其它5' UTR與其它分泌性前導(dǎo)序列的組合。因此，使用此表達(dá)盒有利于高產(chǎn)率 生成目標(biāo)多肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 大量克隆和表達(dá)目標(biāo)多肽的能力變得越來越重要。生成和純化高水平蛋白的能力 對于人用藥物和生物技術(shù)領(lǐng)域，例如合成蛋白藥物以及基礎(chǔ)研宄例如結(jié)晶蛋白以能測定其 三維結(jié)構(gòu)尤其重要。其他情況下難以獲得一定量的蛋白能在宿主細(xì)胞中過表達(dá)且隨后被分 離和純化。
[0003] 選擇生成重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)取決于多種因素，包括目標(biāo)蛋白的細(xì)胞生長特性、 表達(dá)水平、胞內(nèi)和胞外表達(dá)、翻譯后修飾和生物活性以及產(chǎn)生治療性蛋白的調(diào)節(jié)問題和經(jīng) 濟(jì)考慮。哺乳動物細(xì)胞相比其它表達(dá)系統(tǒng)如細(xì)菌或酵母的關(guān)鍵優(yōu)勢是完成合適蛋白折疊、 復(fù)雜N-連接糖基化和真0-連接糖基化的能力以及廣譜的其它翻譯后修飾。由于所述優(yōu) 勢，真核且特別是哺乳動物細(xì)胞是目前用于生成復(fù)合治療性蛋白如單克隆抗體的表達(dá)系統(tǒng) 的選擇。
[0004] 獲得高表達(dá)宿主細(xì)胞（也稱為高生產(chǎn)子）的最常見方法以產(chǎn)生合適表達(dá)載體以表 達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物作為第一步。所述表達(dá)載體驅(qū)動編碼目標(biāo)產(chǎn)物的多核苷酸在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)且 通常包括至少一個(gè)選擇標(biāo)記以產(chǎn)生重組細(xì)胞系。除了編碼目標(biāo)蛋白的多核苷酸，用于在宿 主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)多肽的表達(dá)載體通常還包括適于驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄控制元件作為表達(dá)盒元件， 如啟動子、增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄暫?；蚪K止信號。此外，一般包括適當(dāng)翻譯控制元 件且操作性連接待表達(dá)的多核苷酸，如合適的5' UTR和3' UTR。
[0005] 為增加所述表達(dá)系統(tǒng)的效率，優(yōu)化不同元件，尤其是有助于轉(zhuǎn)錄和翻譯效率、蛋白 合成、ER內(nèi)正確折疊和蛋白分泌的DNA序列。沒有經(jīng)優(yōu)化翻譯和分泌組件的高產(chǎn)率表達(dá)系 統(tǒng)可能導(dǎo)致mRNA不穩(wěn)定、蛋白質(zhì)分泌不足、錯(cuò)折疊（失活）蛋白積聚于細(xì)胞質(zhì)或膜中。因 此，對能穩(wěn)定和持續(xù)翻譯并分泌正確折疊蛋白進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)基的表達(dá)系統(tǒng)尤其感興趣。這 種分泌系統(tǒng)提供以下優(yōu)勢：穩(wěn)定和有效的mRNA翻譯；正確的蛋白折疊和有效分泌，簡單且 快速的產(chǎn)物純化過程，以及相較胞質(zhì)系統(tǒng)產(chǎn)率提高。然而，多數(shù)可用分泌系統(tǒng)的產(chǎn)物產(chǎn)率尚 未充分優(yōu)化。為提高生產(chǎn)率和分泌效率，一個(gè)目標(biāo)是優(yōu)化分泌信號（本文也稱為信號肽或 分泌性前導(dǎo)序列）以及其與不同5' UTR序列的組合，從而獲得產(chǎn)生所需高水平表達(dá)的遺傳 元件組合。
[0006] 來自原核或真核生物的大部分分泌和膜結(jié)合蛋白具有氨基末端前導(dǎo)肽（也稱為 分泌性前導(dǎo)序列或信號肽），其在生物合成期間從新生前體多肽中切割。分泌性前導(dǎo)序列通 常長度為5-60個(gè)氨基酸。此序列對于分泌而言是必須且充足的。分析大量這類分泌性前導(dǎo) 序列顯示在沒有顯著氨基酸序列同源性的情況下出現(xiàn)的共同結(jié)構(gòu)基序[Von Heijne，1981 ; Perlman等，1983]。一般，分泌性前導(dǎo)序列由帶正電荷的氨基末端（n)、疏水核（h)和極性更 高的定義信號肽酶切割位點(diǎn)的羧基末端（c)組成。分泌性前導(dǎo)序列的"n"區(qū)長度為約5-8 個(gè)氨基酸且特征為存在堿性殘基。"h"區(qū)包含8-12個(gè)非極性氨基酸，其平均構(gòu)成為37%亮 氨酸、15%丙氨酸、10%纈氨酸、10%苯丙氨酸、7%異亮氨酸和21 %疏水氨基酸如甘氨酸、 甲硫氨酸、脯氨酸或色氨酸。此區(qū)域形成a-螺旋的傾向高，所述構(gòu)象可促進(jìn)與脂雙層內(nèi)部 的相互作用。對分泌性前導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)特征的研宄主要基于細(xì)菌蛋白，表明"h"區(qū)對信號序列 功能關(guān)鍵[Gierasch, 1990]。通過缺失或者疏水殘基被親水或帶電氨基酸取代來破壞h區(qū) 可導(dǎo)致信號功能損失，而改變"n"區(qū)的影響不大[Bird等，1990]。羧基末端或切割區(qū)通常 長度為約6個(gè)氨基酸。該區(qū)域參與信號肽酶識別和切割，一般需要其來實(shí)現(xiàn)蛋白的最終折 疊和分泌。
[0007] 5' UTR(5'非翻譯區(qū)）是轉(zhuǎn)錄成mRNA而非蛋白的DNA序列部分。其通常始于轉(zhuǎn) 錄起始，終止于起始密碼子前的一個(gè)核苷酸。5' UTR可包含調(diào)節(jié)翻譯效率或mRNA穩(wěn)定性、 蛋白結(jié)合位點(diǎn)、調(diào)控元件的序列，以及促進(jìn)翻譯起始的序列。5' UTR序列的長度可變且能 包括幾十個(gè)核苷酸到多至數(shù)百或甚至數(shù)千個(gè)核苷酸。真核生物中，5' UTR的中值長度是約 100-200nt。5'UTR和其元件的特定作用尚未充分闡明，部分也是因?yàn)樗鲂蛄胁槐环g為 功能蛋白。然而，已知特定5' UTR和特定分泌性前導(dǎo)序列的組合能大幅提高生產(chǎn)系統(tǒng)的翻 譯和分泌效率，因此可增加表達(dá)產(chǎn)率。然而，由于有過多的5' UTR和分泌性前導(dǎo)序列可用， 獲得能確實(shí)提高表達(dá)的有效組合是一個(gè)挑戰(zhàn)。因此，盡管有很多的可用表達(dá)盒和表達(dá)載體， 在真核細(xì)胞中獲得高產(chǎn)率的穩(wěn)健多肽/蛋白生成仍是挑戰(zhàn)。
[0008]因此，本發(fā)明的目的是提供表達(dá)盒，當(dāng)所述表達(dá)盒引入宿主細(xì)胞時(shí)其能以高產(chǎn)率 分泌目標(biāo)多肽。此外，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能以高產(chǎn)率表達(dá)目標(biāo)多肽的表達(dá)載體。此 外，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供適于高產(chǎn)率表達(dá)目標(biāo)多肽的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)：在一個(gè)表達(dá)盒內(nèi)組合特定5'UTR多核苷酸序列（參見SEQ ID N0 1，其也包含于SEQ ID N0 2、3和4以及5、6和7中）與人⑶33分泌性前導(dǎo)序列使 得所述表達(dá)盒所編碼目標(biāo)多肽的表達(dá)高得驚人。在一些示例中，顯示本發(fā)明所述表達(dá)盒優(yōu) 于現(xiàn)有技術(shù)已知的表達(dá)盒，因?yàn)楸磉_(dá)產(chǎn)率增加可多至4倍。本發(fā)明所述表達(dá)盒的優(yōu)越性能 在許多實(shí)驗(yàn)中得到確認(rèn)，其中不同目標(biāo)多肽從所述表達(dá)盒中表達(dá)。因此，本發(fā)明所述表達(dá)盒 對于高產(chǎn)率生成目標(biāo)多肽特別有利。另外，發(fā)現(xiàn)前導(dǎo)序列的正確加工可被改善。因此，本發(fā) 明為本領(lǐng)域作出有價(jià)值的貢獻(xiàn)，因?yàn)榇诵滦捅磉_(dá)盒設(shè)計(jì)顯著提高目標(biāo)多肽的表達(dá)。
[0010] 根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供表達(dá)目標(biāo)多肽的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包括：
[0011] a)啟動子
[0012] b)5' UTR多核苷酸序列，其中所述5' UTR多核苷酸序列選自下組
[0013] i)包括以下序列的5' UTR多核苷酸序列
[0014] agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctcc gcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctatagg cccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggt gacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgca(SEQ ID NO 1);
[0015] ii)包括以下序列的5' UTR多核苷酸序列
[0016] agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcct ccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtcta taggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatt taggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctc ggttctatcg(SEQIDNO 2);
[0017] iii)包括以下序列的5' UTR多核苷酸序列
[0018] agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcct ccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtcta taggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatt taggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctc ggttctatcgaaaacgcgtccacc(SEQIDNO 3)；
[0019] iv)包括以下序列的5' UTR多核苷酸序列
[0020] agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctcc gcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctatagg cccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtg acactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctat cgcgattgaattccccggggatcctctagggtgaccgtttggtgccgccacc(SEQIDNO 4)；
[0021] V)包括以下序列的5'UTR多核苷酸序列
[0022] agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctcc gcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctatagg cccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtg acactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctat cgaaaacgcgcctctagagccgccacc(SEQIDNO 5)；
[0023] vi)包括以下序列的5' UTR多核苷酸序列
[0024] agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcct ccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtcta taggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatt taggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctc ggttctatcgaaaaacgcgtgccgccacc(SEQIDNO 6)；
[0025] vii)包括以下序列的5' UTR多核苷酸序列
[0026] agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcct ccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtcta taggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatt taggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctc ggttctatcgaaaacgcgtgccgccacc(SEQIDNO 7)；
[0027] viii)包括與SEQIDNO 1、SEQIDNO 2、SEQIDNO 3或SEQIDNO 4或SEQID NO 5、SEQIDNO 6或SEQIDNO 7所示序列至少85%，優(yōu)選至少90%同一的序列的5'UTR 多核苷酸序列；
[0028] c)編碼h⑶33分泌性前導(dǎo)序列的多核苷酸；和
[0029] d)編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸或用于插入編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸的插入位點(diǎn)。
[0030] 根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供表達(dá)目標(biāo)多肽的表達(dá)載體，所述載體包括至少一個(gè)如 本發(fā)明第一方面所述的表達(dá)盒。
[0031] 根據(jù)第三方面，本發(fā)明提供真核宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包括至少一個(gè)如本發(fā)明第一 方面所述的表達(dá)盒和/或至少一個(gè)如本發(fā)明第二方面所述的表達(dá)載體。
[0032] 根據(jù)第四方面，本發(fā)明提供生成如本發(fā)明第三方面所述的宿主細(xì)胞