用于檢測(cè)中藥口服液體制劑中乳桿菌的培養(yǎng)基和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥品微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)中藥口服液體制劑中， 是否污染乳桿菌的檢測(cè)方法，以及用于檢測(cè)中藥口服液體制劑中乳桿菌的培養(yǎng)基
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥口服液體制劑是以中藥湯劑為基礎(chǔ)，提取原藥材中的有效成分，加入矯味劑、 抑菌劑等，再經(jīng)靜置、過(guò)濾、滅菌等工藝制成，具有劑量小、服用方便、起效迅速、味道易于接 受等優(yōu)點(diǎn)，臨床應(yīng)用廣泛。然而，中藥口服液原料藥多以天然動(dòng)、植物成分為主，蛋白含量 高，且制劑多加入蔗糖、蜂蜜等用于調(diào)整口味，營(yíng)養(yǎng)成分豐富；又其原材料中多攜帶有大量 微生物，其中不乏耐熱桿菌、耐輻照細(xì)菌、孢子和芽孢等，對(duì)不良環(huán)境有較強(qiáng)抗逆性。因此， 產(chǎn)品在生產(chǎn)、貯藏和使用過(guò)程中容易受到微生物污染，導(dǎo)致藥物變質(zhì)，不但起不到治療作 用，嚴(yán)重時(shí)，微生物產(chǎn)生的代謝毒素、藥物成分改變所形成的致敏原等等，甚至?xí)＜盎颊?生命健康。
[0003] 乳桿菌（Lactobacillaceae)為革蘭陽(yáng)性桿菌，兼性厭氧，耐酸，自然界中廣泛存 在，也寄生于溫血?jiǎng)游锏目谇?、腸道和陰道中。一般乳桿菌可耐受70°C的溫度，也有報(bào)道證 實(shí)，某些植物乳桿菌在80°C的高溫時(shí)仍可生長(zhǎng)。作為益生菌群，乳桿菌在現(xiàn)代食品工業(yè)中應(yīng) 用廣泛，查閱文獻(xiàn)，幾乎未見(jiàn)關(guān)于其危害性的報(bào)道。但是，對(duì)于中藥口服液體制劑，乳桿菌卻 會(huì)造成嚴(yán)重的產(chǎn)品質(zhì)量安全隱患，主要原因有以下幾點(diǎn)：①中藥口服液原料藥中攜帶有大 量乳桿菌，野生株多對(duì)不良環(huán)境有較強(qiáng)的抗逆性。②為有效保留藥物的活性成分，生產(chǎn)工藝 盡量避免高溫提取或滅菌，為乳桿菌的存活創(chuàng)造了有利條件。③藥物中的富含蔗糖、蜂蜜等 調(diào)味劑，是乳桿菌善于利用的碳源。④產(chǎn)品中雖然添加了山梨酸鉀等抑菌劑，但該成分僅對(duì) 霉菌、酵母菌和好氧性細(xì)菌有抑制作用，對(duì)乳酸菌屬幾乎無(wú)效。⑤產(chǎn)品多進(jìn)行嚴(yán)格密封，瓶 內(nèi)剩余空間較少，生存環(huán)境接近于厭氧或微需氧狀態(tài)，適于乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖。⑥患者購(gòu)買 后，多置于常溫貯存，逢夏秋季節(jié)，溫度尤適于乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖。產(chǎn)品受乳桿菌污染后，即 便極低水平的污染，在適宜的條件下，乳桿菌會(huì)快速繁殖，短時(shí)間內(nèi)使產(chǎn)品性狀發(fā)生改變。 主要表現(xiàn)為脹氣、沉淀、PH值下降和有效成分降低等現(xiàn)象，威脅患者健康。如果企業(yè)生產(chǎn)線 受到該菌污染，常會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品連續(xù)批次的大規(guī)模污染，給企業(yè)帶來(lái)巨額的經(jīng)濟(jì)損失。近年 來(lái)，國(guó)內(nèi)數(shù)起中藥口服制劑的召回事件即是源于該菌的污染。
[0004] 目前，中國(guó)藥品檢測(cè)相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，如中國(guó)藥典等，僅將金黃色葡萄球菌、大腸埃 希菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌等致病性微生物作為控制菌，并列出了相關(guān)的 檢測(cè)方法和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。乳桿菌本身并不會(huì)直接對(duì)人體造成危害，因此，藥品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn) 未將其作為有害菌進(jìn)行控制。隨著我國(guó)藥品GMP管理制度的實(shí)施和完善，現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中 規(guī)定檢測(cè)的致病菌對(duì)藥品質(zhì)量安全的威脅幾本消除，某些強(qiáng)抗逆性的非致病菌或條件致病 菌，例如本發(fā)明所述乳桿菌，已經(jīng)上升為中藥制劑質(zhì)量安全的主要威脅因素。
[0005] 中國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，收載了含乳食品中乳酸菌的檢測(cè)方法和含活性乳酸菌 的食品中乳酸菌的檢測(cè)方法，將其作為益生菌進(jìn)行檢測(cè)。與中藥口服液體制劑中，將乳桿菌 作為有害菌的檢測(cè)目的不同，因此，培養(yǎng)基、檢測(cè)方法和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)均不適用。
[0006] 查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，均未見(jiàn)關(guān)于中藥口服液污染乳桿菌的檢測(cè)方法。因此，建立 一套適用于中藥口服液體制劑中，污染乳桿菌的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)，開發(fā)專屬性培養(yǎng)基，對(duì)確 ?；颊叩挠盟幇踩?、促進(jìn)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有非常積極的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供用于檢測(cè)中藥口服液體制劑中乳桿菌的培養(yǎng)基、以及中藥 口服液體制劑中乳桿菌的檢測(cè)方法，可以有效避免供試品中各類雜菌的干擾，檢測(cè)限低于 5cfu/100mL〇
[0008] 本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)中藥口服液體制劑中乳桿菌的培養(yǎng)基，包括有
[0009] (1) -種為乳桿菌增菌培養(yǎng)基，為液體培養(yǎng)基，用于乳桿菌的前增菌培養(yǎng)；其成分 為：蛋白胨5. 0g、酵母浸出粉4. 0g、葡萄糖10. 0g、蔗糖、10. 0g、磷酸氫二鉀I. 0g、硫酸鎂 0· 3g、聚山梨酯805. 0g、山梨酸鉀3g、水1000 mL ;
[0010] 采用以下方法制成：上述成分中除葡萄糖和蔗糖外，煮沸溶解，然后加入葡萄糖和 蔗糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)pH值5. 5~6. 0,分裝，115°C，30min滅菌；
[0011] (2)另一種為乳桿菌瓊脂培養(yǎng)基，為固體瓊脂培養(yǎng)基，用于增菌液的劃線培養(yǎng)，其 成分為：蛋白胨10. 〇g、葡萄糖5. 0g、鹿糖5. 0g、氯化鈉3. 0g、酵母浸出粉5. 0g、L-胱氨酸 I. 〇g、磷酸氫二鉀I. 〇g、瓊脂17g、山梨酸鉀3g、水1000 mL ;
[0012] 采用以下方法制成：上述成分中除葡萄糖和蔗糖外，煮沸溶解，然后加入葡萄糖和 蔗糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)pH值5. 5~6. 0,分裝，115°C，30min滅菌，傾注平皿。
[0013] 本發(fā)明還公開了一種采用上述培養(yǎng)基用于中藥口服液體制劑中乳桿菌的檢測(cè)方 法，其特征在于，包括以下步驟：
[0014] (1)取供試品，接種至乳桿菌增菌培養(yǎng)基中，37°C ±1°C，厭氧，振蕩培養(yǎng)18~24 小時(shí)，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)，振搖速度100~150r/min ;
[0015] (2)取上述培養(yǎng)物，劃線接種至乳桿菌瓊脂培養(yǎng)基中，37°C ±1°C，厭氧，培養(yǎng)24~ 48小時(shí)；
[0016] (3)如果平皿上出現(xiàn)菌落具有以下特征：灰白色，菌落中心顏色較深，圓形凸起， 光滑，邊緣整齊，菌落直徑1. 0~I. 5mm，且培養(yǎng)皿散發(fā)出乳酸味道，則應(yīng)挑選2~3個(gè)菌 落，分別接種于乳桿菌瓊脂培養(yǎng)基，37°C ± 1°C，厭氧，培養(yǎng)24~48小時(shí)，取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭 染色鏡檢和適宜的鑒定試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果判斷是否檢出乳桿菌；
[0017] (4)如果平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或無(wú)典型菌落生長(zhǎng)，判產(chǎn)品未檢出乳桿菌。
[0018] 上述本發(fā)明的檢測(cè)方法，優(yōu)選的：所述步驟（1)中，乳桿菌增菌培養(yǎng)基的用量是接 種供試品體積的5-10倍。
[0019] 上述本發(fā)明的檢測(cè)方法，優(yōu)選的：所述供試品最少檢驗(yàn)數(shù)量如下（表1)，
[0020]
[0021] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0022] 本發(fā)明建立了中藥口服液體制劑污染乳桿菌的檢測(cè)方法，并開發(fā)了兩種選擇性菌 培養(yǎng)基，一種是乳桿菌增菌培養(yǎng)基，另一種是乳桿菌瓊脂培養(yǎng)基。采用本發(fā)明進(jìn)行中藥口服 液體制劑乳桿菌的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，可以有效避免供試品中各類需氧菌、革蘭氏陰性菌、霉菌和酵 母菌等雜菌的干擾，檢測(cè)限低于5cfu/100mL。采用本發(fā)明對(duì)中藥口服液體制劑進(jìn)行質(zhì)量控 制，可以對(duì)批出廠產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，有效防止受污染產(chǎn)品上市銷售；采用本發(fā)明對(duì)中藥口服液 體制劑生產(chǎn)線關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行連續(xù)監(jiān)控，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)線存在的污染隱患，及時(shí)排除，防 止大規(guī)模污染事件的發(fā)生。本發(fā)明對(duì)于確保患者的用藥安全、促進(jìn)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展 具有非常積極的意義。
【具體實(shí)施方式】：
[0023] 以下是對(duì)本法明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0024] 實(shí)施例1 :
[0025] 采用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis) [CMCC (B) 63501]、金黃色葡萄球 菌（Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌（Escherichia coli) [CMCC (B) 44102]、生抱梭菌（Clostridium sporogenes) [CMCC (B) 64941]、白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F)98001]、和黑曲霉（Aspergillus niger)[CMCC(F)98003] 作為驗(yàn)證用菌株，分別代表環(huán)境中常見(jiàn)的芽孢桿菌、革蘭氏陽(yáng)性球菌、革蘭氏陰性桿菌、霉 菌和酵母菌等，用于驗(yàn)證本發(fā)明中所述兩種乳桿菌培養(yǎng)基對(duì)雜菌的抑制能力；采用植物乳 桿菌植物亞種（Lactobacillus plantarum)[CICC20718]和布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri) [CICC 20293]作為驗(yàn)證用菌株，驗(yàn)證中藥口服液體制劑乳桿菌檢測(cè)方法的有效 性，檢查兩種培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力和指示能力等。
[0026] 1、菌液制備接種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng) 養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30~35°C培養(yǎng) 18~24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23~28°C培養(yǎng)24~48 小時(shí)，上述培養(yǎng)物用0. 9%的無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于IOOcfu的菌懸液。接種 黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23~28°C培養(yǎng)5~7天，加入3~5ml 含0. 05%聚山梨酯80的0. 9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后制成孢子數(shù)小于IOOcfu 的孢子懸液。
[0027] 2、培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查取上述植物乳桿菌植物亞種和布氏乳桿菌菌懸液各 lml，分別接種于100mL乳桿菌增菌培養(yǎng)基中，37°C，厭氧，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，振搖速度 100~150r/min ;取增菌培養(yǎng)液一環(huán)，劃線接種于乳桿菌瓊脂培養(yǎng)基，37°C，厭氧，培養(yǎng)48小 時(shí)。同時(shí)，以菌種傳代說(shuō)明書中規(guī)定的培養(yǎng)基作為對(duì)照培養(yǎng)基平行操作。
[0028] 3、培養(yǎng)基抑制能力檢查取枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和生孢梭 菌菌懸液個(gè)lml，分別接種于100mL乳桿菌增菌培養(yǎng)基中，37°C，厭氧，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，振 搖速度100~150r/min ;取增菌培養(yǎng)液一環(huán)，劃線接種于乳桿菌瓊脂培養(yǎng)基