用于透明質(zhì)酸酶的穩(wěn)定劑和包括透明質(zhì)酸酶的液體制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及包含透明質(zhì)酸酶和用于透明質(zhì)酸酶的穩(wěn)定劑的穩(wěn)定液體制劑，其優(yōu)勢 在于其可以在延長的時段中在液態(tài)穩(wěn)定地保持其酶活性，并且其施用簡單從而其可被有效 地使用。
【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸酶，其是用于降解透明質(zhì)酸的酶的統(tǒng)稱，一開始被Duran-Reynals稱作 擴散因子，但是后來，因為觀察到其展示對透明質(zhì)酸（HA)強的活性，所以被稱為透明質(zhì)酸 酶（HAase)。根據(jù)其作用機制，該酶被歸類為分布在睪丸、溶酶體和蜂毒中的透明質(zhì)酸鹽 4_聚糖水解酶（EC 3. 2. 1. 35)、存在于水蛭中的透明質(zhì)酸鹽3-聚糖水解酶（EC 3. 2. 1. 36)、 和存在于細菌中的透明質(zhì)酸鹽裂解酶（EC 4. 2. 2. 1)。
[0003] 尤其，因為睪丸中的透明質(zhì)酸酶（PH-20)結(jié)合至精子頂體部分上的糖基磷脂酰肌 醇（GPI)錨定位點，所以它們是通過降解卵子外側(cè)厚的外壁層而導(dǎo)致受精的關(guān)鍵的酶。已 知透明質(zhì)酸（HA)、軟骨素和硫酸軟骨素中存在的N-乙?；?D-葡糖胺和D-葡糖醛酸之間 的β (1-4)鍵通過PH-20的作用而水解。這些酶的分子通式是C2455H3775N617O 7tl4S2^它們的 分子量是53870. 9g/mol。人的包括HYAL1、HYAL2、HYAL3和PH-20/SPAM1的六個基因與該 酶相關(guān)。
[0004] 自從20世紀(jì)50年代，已經(jīng)廣泛評述了透明質(zhì)酸酶的大量應(yīng)用。第一個應(yīng)用是皮 下注射腸胃外流體，并且另外它們已經(jīng)在整形外科、眼科、整形外科手術(shù)、牙科、口腔外科手 術(shù)、婦科和耳鼻喉科外科手術(shù)中用于滲透和阻滯麻醉以增加類固醇類和局部麻醉劑的分 散，和用于體液的分散而不形成凝聚比如血腫、防止腹膜粘合、防止結(jié)石形成、和治療不育。
[0005] 目前市面可用的透明質(zhì)酸酶是提取自綿羊睪丸然后進行凍干。將這些未處理的透 明質(zhì)酸酶以適當(dāng)?shù)臐舛热诨?，填入小瓶然后凍干成它們的制成品。由此制造的透明質(zhì)酸酶 包含過多量的外源蛋白。所以，通過現(xiàn)有方法獲得的透明質(zhì)酸酶不僅僅具有當(dāng)轉(zhuǎn)化成溶液 時它們穩(wěn)定性的問題，而且也從實踐角度留下它們應(yīng)用的巨大問題，這是因為，由于它們的 穩(wěn)定性隨著時間的推移降低，因而它們的生理學(xué)活性下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明人發(fā)明了本發(fā)明以提供取代現(xiàn)有凍干透明質(zhì)酸酶制劑的液體制劑，現(xiàn)有的 凍干透明質(zhì)酸酶制劑不僅僅具有當(dāng)轉(zhuǎn)化成溶液時它們穩(wěn)定性的問題，而且也從實踐角度留 下它們應(yīng)用的巨大問題，這是因為，由于它們的穩(wěn)定性隨著時間的推移降低，因而它們的生 理學(xué)活性下降。
[0007] 本發(fā)明涉及包含透明質(zhì)酸酶的液體制劑，以解決現(xiàn)有凍干制劑由于它們的穩(wěn)定性 和雜質(zhì)而帶來的問題，以及當(dāng)從現(xiàn)有材料制備成液體形式時，由于它們穩(wěn)定性隨著時間的 推移降低因而生理學(xué)活性下降的問題。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供制備具有改善的穩(wěn)定性、包含透明質(zhì)酸酶的液體制劑的 方法。
[0009] 本發(fā)明的再一目的是提供增加透明質(zhì)酸酶的純度和穩(wěn)定性的純化方法。
[0010] 本發(fā)明的再一目的是提供用于包含透明質(zhì)酸酶的制劑的穩(wěn)定劑。
[0011] 本發(fā)明涉及包含高純度透明質(zhì)酸酶的液體制劑，更優(yōu)選地涉及包含純度為95%或 更高并且比活性是70, 000IU/mg或更高的透明質(zhì)酸酶的液體制劑。
[0012] 本發(fā)明的液體制劑可包含穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑包含：(a)約1至50mM的緩沖劑，以 提供pH 4. 5至6. 0 ; (b)0. 001至0. 5v/v %的非離子表面活性劑；和（c)0. 1至5mM的螯合 劑或堿金屬和堿土金屬氯化物。
[0013] 此外，本發(fā)明涉及改善包含透明質(zhì)酸酶、優(yōu)選高純度透明質(zhì)酸酶的制劑的穩(wěn)定性 的穩(wěn)定劑。
[0014] 透明質(zhì)酸酶可以是未純化的透明質(zhì)酸酶，或純化的透明質(zhì)酸酶。根據(jù)本發(fā)明的用 于透明質(zhì)酸酶的穩(wěn)定劑包含：（a)約1至50mM的緩沖劑，以提供pH 4. 5至6. 0 ; (b)0. 001 至0. 5v/v%的非離子表面活性劑；和（c)0. 1至5mM的螯合劑或堿金屬和堿土金屬氯化物。
[0015] 此外，本發(fā)明涉及獲得具有改善的純度和穩(wěn)定性的透明質(zhì)酸酶的方法，所述透明 質(zhì)酸酶通過選自由親和性色譜、離子交換色譜和凝膠過濾組成的組的一種或多種方法對包 含透明質(zhì)酸酶的材料進行純化來獲得。
【附圖說明】
[0016] 圖1顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例1的使用藍色瓊脂糖的親和性色譜純化圖；
[0017] 圖2顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例2的使用Mono S的陽離子交換色譜純化圖；
[0018] 圖3顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例3的使用DEAE瓊脂糖的陰離子交換色譜純化圖； [0019] 圖4顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例4的使用肝素瓊脂糖的親和性色譜純化圖；
[0020] 圖5顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例5的第一鹽析材料的第五次純化之后的GPC(凝膠 滲透色譜）分析；
[0021] 圖6顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例5的第二鹽析材料的第五次純化之后的GPC(凝膠 滲透色譜）分析；
[0022] 圖7顯示根據(jù)本發(fā)明的實施例5的Hdase材料的第五次純化之后的GPC(凝膠滲 透色譜）分析；
[0023] 圖8顯示根據(jù)本發(fā)明的透明質(zhì)酸酶的純化方法和使用未純化的或純化的透明質(zhì) 酸酶的制備液體制劑的方法的圖。
【具體實施方式】
[0024] 下文，更詳細描述本發(fā)明。
[0025] 本發(fā)明涉及包含透明質(zhì)酸酶的液體制劑，其中透明質(zhì)酸酶的純度為95%或更高并 且比活性是70, OOOIU/mg或更高。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的透明質(zhì)酸酶可以是通常源自哺乳動物（例如人、母牛、綿羊和豬）的 睪丸的酶。通常市面上可用的透明質(zhì)酸酶是通過將哺乳動物的睪丸進行鹽析然后凍干、或 者通過在鹽析之后去熱原然后凍干而獲得。例如，以下材料可以用作純化方法的源材料：鹽 析一次然后凍干的哺乳動物的睪丸材料、鹽析兩次然后凍干的睪丸材料，或鹽析兩次、去熱 原然后凍干的睪丸材料?，F(xiàn)有的透明質(zhì)酸酶通過從綿羊睪丸兩次鹽析、凍干、透析、去熱原、 然后冷凍干燥來提取，并且提取的物質(zhì)摻混大量的透明質(zhì)酸酶之外的蛋白質(zhì)。
[0027] 市面上可用的粗品狀態(tài)的凍干透明質(zhì)酸酶包含大量的雜質(zhì)，因此它們的純度低， 并且當(dāng)制備成液體制劑時，它們的穩(wěn)定性低。此外，凍干制劑不方便，因為在使用之前其應(yīng) 制備成液體形式。所以，亟需一種包含透明質(zhì)酸酶、優(yōu)選高純度的透明質(zhì)酸酶的具有卓越的 穩(wěn)定性的液體制劑。
[0028] 在根據(jù)本發(fā)明的液體制劑中包含的透明質(zhì)酸酶包含純度為95%或更高并且比活 性是70, OOOIU/mg或更高的透明質(zhì)酸酶，通過選自由親和性色譜、離子交換色譜和凝膠過 濾組成的組中的一種方法或兩種以上組合的方法來對酶的粗原料進行純化。
[0029] 通過英國藥典專論（British Pharmacopoeia Monograph)的"用于注射的透明質(zhì) 酸酶（Hyaluronidase for injection)"中闡釋的試驗來測量根據(jù)本發(fā)明純化的透明質(zhì)酸 酶的活性。本說明書中，當(dāng)根據(jù)英國藥典專論的"用于注射的透明質(zhì)酸酶"中闡釋的試驗測 量的透明質(zhì)酸酶的活性（含量或比活性）與儲存之前測量的它們的初始活性（100% )相比 為至少90 %或更高、例如90 %至115 %時，可認為保持了透明質(zhì)酸酶的穩(wěn)定性。至于評估穩(wěn) 定性的標(biāo)