還原敏感性聚乙烯亞胺衍生物,其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，涉及一種聚合物載體材料，具體涉及還原敏感性 聚乙烯亞胺衍生物，其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸治療是治療多種先天和后天疾病的一種有力工具，但是如何實現(xiàn)核酸藥物安 全有效的體內(nèi)遞送是核酸治療的一大技術(shù)瓶頸。在眾多核酸遞送載體中，聚乙烯亞胺（PEI) 由于具有較高的電荷密度(有效固縮核酸）和獨特的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運機制(胞內(nèi)溶酶體逃逸）而被 廣泛研究。分子量為25KDa的分枝狀PEI和In vivo jetPEI?(分子量為22KDa的直線型 PEI)分別被認(rèn)為是體外核酸遞送和體內(nèi)核酸遞送的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，未經(jīng)化學(xué)改性的PEI存 在轉(zhuǎn)染活性-毒性的相互制約關(guān)系，即PEI分子量越大，轉(zhuǎn)染活性越高，但同時毒性也越大。
[0003] 為了平衡聚乙烯亞胺的毒性和轉(zhuǎn)染活性，現(xiàn)在多采用結(jié)構(gòu)修飾的方法對聚 乙烯亞胺進行化學(xué)改性，如采用PLGA、肝素、透明質(zhì)酸、PEG等對高分子量聚乙烯亞胺 進行化學(xué)改性（參見 Chumakova 0V, et al, Cancer Lett. 2008; 261 (2):215-225; Jeon 0, et al, J. Control. Release 2008 ; 132 (3) : 236-242 ; Jiang G, et al,Mol. Pharm. 2009; 6 (3) : 727-737; Merkel 0M, et al, Mol. Pharm. 2009; 6 (4) : 1246-1260)，提高其 轉(zhuǎn)染活性的同時降低毒性。中國專利號CN101704949A公開了名稱為"丙烯酰胺類單體修 飾的聚乙烯亞胺、制法和在基因傳遞中的應(yīng)用"，該專利對分子量為25K的分枝狀PEI修飾 后，不僅提高了轉(zhuǎn)染效率，而且大大降低了毒性。中國專利號CN102181053A公開了名稱為 "一種疏水基團修飾的聚乙烯亞胺衍生物及其應(yīng)用"的發(fā)明專利，該專利提供了一種酸敏感 疏水改性的聚乙烯亞胺(分子量為9. 5K-10. 5K)，該修飾方法增強了 PEI與DNA的復(fù)合能力， 且材料細胞毒性較低。
[0004] 另外，采用交聯(lián)劑將無細胞毒性的小分子量PEI交聯(lián)形成二硫鍵、酯鍵、胺酯鍵、 亞胺鍵連接的可降解PEI，交聯(lián)后的小分子量PEI具有比母體PEI大大增強的核算遞送效 能，且交聯(lián)的化學(xué)鍵在一定條件下水解或酶解，可降解為無細胞毒性的小分子量PEI，安全 性高。最早俄亥俄州立大學(xué)的Robert J. Lee課題組用交聯(lián)劑二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸 酯）DSP、二硫二丙二亞氨甲基醚（DTBP)分別與小分子量PEI (PEI800Da)交聯(lián)得到DSP-PEI 和DTBP-PEI，DSP-PEI和DTBP-PEI在中國倉鼠卵巢癌細胞（CHO)中具有與市售高分子量 b-PEI25K 相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染活性（參見 Gosselin MA, et al, Bioconjug. Chem. 2001，12:989-94)。 德國的Manfred Ogris同樣用DSP、DTBP、1, 6己二醇二丙烯酸酯分別與小分子量的聚胺 (亞精胺、精胺、三乙撐四胺、四乙撐五胺、五乙撐六胺、PEISOODa)交聯(lián)，得到二硫鍵交聯(lián)的 IP-Iinked、SP-Linked，酯鍵交聯(lián)的HD-Linked三類共計37個水溶性聚陽離子，其中酯鍵交 聯(lián)PEI800的0EI-HD-1的轉(zhuǎn)染活性好于市售直線型PEI22K Da陽性對照（參見Kloeckner J, et al, Eur. J. Pharm. Sci. 2006;29:414-25.)。中國專利號 CN201110312946. 8 公開了名 稱為"一種氨酯鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺類聚陽離子載體制備工藝"的發(fā)明專利，該發(fā)明專利提 供了一種由1，4-丁二醇氯甲酸酯交聯(lián)得到的高效、低毒的氨酯鍵交聯(lián)的小分子量PEI。中 國專利號CN200610097858. X公開了名稱為"可生物降解的交聯(lián)聚乙烯亞胺及其應(yīng)用"的發(fā) 明專利，該發(fā)明專利采用各種二酸的縮水甘油酯、丙烯酸/甲基丙烯酸縮水甘油酯或各種 多元醇或多元縮醇的丙烯酸/甲基丙烯酸的多元酯中的一種或幾種復(fù)合物為交聯(lián)劑交聯(lián) 各種分子量的PEI，實現(xiàn)了對C6、MCF-7、3T3、A375、EL4、Hela、F10、A549等細胞高效、低毒 的轉(zhuǎn)染。
[0005] 經(jīng)專利查詢及文獻檢索，目前國內(nèi)外還沒有將疏水修飾和交聯(lián)劑交聯(lián)兩種方法同 時應(yīng)用來對聚乙烯亞胺進行改性以平衡其轉(zhuǎn)染活性和毒性的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種還原敏感性聚乙烯亞胺衍生物，其在體內(nèi)外 的穩(wěn)定性要好，轉(zhuǎn)染效率高，且細胞毒性小。
[0007] 此外，還需要提供一種還原敏感性聚乙烯亞胺衍生物的制備方法及其作為核酸載 體的應(yīng)用。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0009] 在本發(fā)明的一個方面，提供了還原敏感性聚乙烯亞胺衍生物，其化學(xué)組成式為 (R1-PEI) X-SS- (PEI-R2) y，化學(xué)組成式中兩個PEI可以均為直線型PEI，或者均為分枝狀PEI， 或者一個為直線型PEI，一個為分枝狀PEI，-SS-為二硫鍵，R 1和R2各自獨立選擇為通式為 H-(CH2) η-的基團，η選自0-14中的任意整數(shù)；其結(jié)構(gòu)式為：
[0010]
[0011] 組成式和結(jié)構(gòu)式中，X和y表示重復(fù)單元的個數(shù),且x=l-120，y=l-120 各自 獨立選擇為通式為H-(CH2)n-的基團，η選自0-14中的任意整數(shù)，即Rp R2各自獨立選擇 為氧原子、甲基、乙烷基、丙烷基、丁烷基、戊烷基、己烷基、庚烷基、半烷基、壬烷基、癸烷基、 十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基，且該脂肪烴基來自相應(yīng)鹵代烴，優(yōu)選的脂肪烴 基是癸烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、和十四烷基；更優(yōu)選的脂肪烴基是十二烷基； 直線型聚乙烯亞胺的重均分子量為200-5000g/mol ;分支狀聚乙烯亞胺的重均分子量為 1250-5000g/mol ;優(yōu)選的，直線型聚乙烯亞胺的重均分子量為800-4400g/mol，分枝狀聚乙 烯亞胺的重均分子量為1250-4400g/mol。
[0012] 本發(fā)明的另一方面，提供了一種還原敏感性聚乙烯亞胺衍生物（如上所述）的制備 方法，包括如下步驟：
[0013] (1)將聚乙烯亞胺溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中，在30-40°C下攪拌溶解，得 到聚乙烯亞胺溶液；
[0014] (2)將鹵代烴溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中，以一定速度（10_50ml/h)滴加至 聚乙烯亞胺溶液中，在30-40°C下，避光反應(yīng)12-48h ;
[0015] (3)將所得混合溶液旋干溶劑得到半固體膏狀物，將該半固體膏狀物混懸于 5-lOml蒸餾水中，然后用截留分子量為100-1000的透析袋進行透析，冷凍干燥后制得烷基 化疏水修飾的聚乙烯亞胺；
[0016] (4)稱取一定量冷凍干燥的聚乙烯亞胺或烷基化疏水修飾的聚乙烯亞胺，溶解 于一定體積的甲醇溶液中，加入一定量的硫化丙烯，在氮氣保護條件下60°C，避光反應(yīng) 24-48h ；
[0017] (5)將所得混合溶液旋干溶劑得到半固體膏狀物，加入一定體積DMSO溶解該膏狀 物后，室溫避光反應(yīng)48-72h，然后用截留分子量為100-1000的透析袋透析該反應(yīng)液，透析 介質(zhì)為去離子水，將透析液體冷凍干澡后，即得到還原敏感性聚乙烯亞胺衍生物；
[0018] 當(dāng)制備的還原敏感性聚乙烯亞胺衍生物中的R1或R2均選擇為氫原子時，則省略烷 基化修飾步驟1-3。
[0019] 步驟（1)中，優(yōu)選的聚乙烯亞胺與混合溶劑的比例為Ig聚乙烯亞胺溶解于 80-150ml混合溶劑中，二氯甲烷和甲醇混合溶劑的體積比為90:10-99:1 ;
[0020] 步驟（2)中，所述加入脂肪烴基量與聚乙烯亞胺的摩爾比為，0:1-25:1 ;優(yōu)選是 0:1-20:1 ;更優(yōu)選是 0:1-15:1 ;最優(yōu)選是 0:1-12:1。
[0021] 當(dāng)與鹵代烴反應(yīng)的聚乙烯亞胺為直線型聚乙烯亞胺時，需在反應(yīng)體系中添加一定 量三乙胺；優(yōu)選的，Ig直線型聚乙烯亞胺需加入的三乙胺的體積為l-4ml ;
[0022] 用于第（4)步反應(yīng)的聚乙烯亞胺的pH值需調(diào)節(jié)為7. 2-7. 4。
[0023] 步驟（4)中，硫化丙烯與聚乙烯亞胺反應(yīng)的摩爾比為2:1-15:1 ;優(yōu)選的，硫化丙烯 與聚乙烯亞胺反應(yīng)的摩爾比為3:1-10:1;更優(yōu)選的的摩爾比為5:1-8:1。
[0024] 本發(fā)明的再一個方面，提供了上述還原敏感性聚乙烯亞胺衍生物作為體內(nèi)、體外 核酸遞送載體的應(yīng)用。作為體內(nèi)或體外核酸遞送載體時，遞送的質(zhì)粒DNA的大小為l_30Kb ; 優(yōu)選遞送的siRNA的大小為15-30bp。
[0025] 上述作為體內(nèi)、體外核酸遞送載體應(yīng)用時，還原敏感性聚乙烯亞胺衍生物與核酸 的質(zhì)量比、脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺與核酸復(fù)合的孵育介質(zhì)、體外遞送時的血 清濃度對轉(zhuǎn)染效率和毒性有顯著影響。優(yōu)選的，脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺與核 酸的質(zhì)