專(zhuān)利名稱(chēng)：重組Ⅱ型單純皰疹病毒載體及其制備方法、重組病毒、藥物組合物及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組Ii型單純皰疹病毒載體及其制備方法、包括該重組Ii型單純皰 疹病毒載體的重組病毒、包括該重組II型單純皰疹病毒載體藥物組合物及所述重組II型 單純皰疹病毒載體和重組病毒在制備治療腫瘤的基因藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒載體(Herps simplex virus,HSV)是一種長(zhǎng)約IMkb的雙鏈DNA病 毒，可在受染宿主細(xì)胞核中復(fù)制。HSV載體具有以下優(yōu)點(diǎn)1)宿主細(xì)胞廣泛；幻病毒滴度高； 3)外源基因容量大。HSV載體的缺點(diǎn)在于它的毒性。例如，ICP47蛋白影響與抗原處理相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP1和TAP2)的功能，阻礙MHC I分子的抗原表呈過(guò)程。所以剔除ICP47基因有利于增強(qiáng)免疫反應(yīng)。另外，剔除ICP47基 因，使下游的USll基因表達(dá)增加，USll可對(duì)抗PKR對(duì)病毒生長(zhǎng)繁殖的抑制。ICP34. 5為神 經(jīng)毒因子，缺失了 ICP34. 5的病毒能選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，其機(jī)理為ICP34. 5能對(duì)抗I3KR 對(duì)翻譯起始因子eIf-加的滅活，使病毒順利繁殖。因此，失去了 ICP34. 5的病毒進(jìn)入正常 細(xì)胞后，誘導(dǎo)干擾素/PKR通路活化，進(jìn)而導(dǎo)致eIf-加失活，病毒蛋白不能合成、病毒繁殖受 阻。而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的干擾素/PKR信號(hào)通路受損。因此，失去了 ICP34.5的病毒可以在 腫瘤細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。以及ICP6基因編碼核糖核苷酸還原酶，該酶為病毒DNA復(fù)制提供必 需的前體，在分裂細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)中為非必需基因，剔除該基因可以增加病毒載體的載 量?，F(xiàn)有的單純皰疹病毒載體都是由野生型I型單純皰疹病毒通過(guò)剔除以上基因獲 得的。例如CN 1283803C公開(kāi)了一種的減毒HSV-I基因治療載體，該載體剔除了 ICP47、 ICP6和ICP34. 5三個(gè)基因?，F(xiàn)有的由野生型I型單純皰疹病毒制備的單純皰疹病毒載體存 在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、溶瘤活性不足的問(wèn)題；野生型II型單純皰疹病毒是否能用做單純皰疹病毒 載體，目前還沒(méi)有報(bào)到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有的由野生型I型單純皰疹病毒制備的單純皰疹病毒載 體，生產(chǎn)周期長(zhǎng)、溶瘤活性不足的缺點(diǎn)，提供一種生產(chǎn)周期短、溶瘤活性高的重組II型單純 皰疹病毒載體。現(xiàn)有技術(shù)一般認(rèn)為野生型II型單純皰疹病毒(多寄生在生殖道內(nèi))比野生型I型 單純皰疹病毒(多感染口腔及口周皮膚粘膜)安全性差，因此不選擇野生型II型單純皰疹 病毒制備單純皰疹病毒載體。但是本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由野生型II型單純皰疹病毒僅剔 除ICP47和ICP34. 5得到的重組II型單純皰疹病毒載體，安全性好。此外，現(xiàn)有技術(shù)還認(rèn) 為，ICP6基因在非分裂細(xì)胞(如正常細(xì)胞)中為必需基因，在分裂細(xì)胞中為非必需基因，因 此剔除ICP6可以增加病毒載體的載量和靶向分裂細(xì)胞的選擇性。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)實(shí)際上剔除ICP6以后使病毒的生長(zhǎng)繁殖受到很大影響，溶瘤活性下降，并且很難生產(chǎn)出高滴 度的病毒；反而使保留ICP6的情況下，病毒生長(zhǎng)繁殖好，容易生產(chǎn)出高滴度的病毒，并且減 少了剔除ICP6的步驟可以大大提高生產(chǎn)重組II型單純皰疹病毒載體的效率，而且由于剔 除了 ICP34. 5，本發(fā)明重組II型單純皰疹病毒載體的腫瘤選擇性殺傷并未受到顯著影響。本發(fā)明提供了一種重組II型單純皰疹病毒載體，其中，所述載體剔除了野生II型 單純皰疹病毒HG52株的ICP34. 5基因和ICP47基因。本發(fā)明提供了一種重組II型單純皰疹病毒載體，其中，所述載體剔除了野生II型 單純皰疹病毒HG52株的ICP34. 5基因和ICP47基因，并且所述載體在被剔除的ICP34. 5基 因的位置上插入了人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)表達(dá)盒。本發(fā)明還提供了一種重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其中，該方法包括 以下步驟(1)從野生型II型單純皰疹病毒HG52株中剔除ICP47基因，構(gòu)建HG52dICP47重 組II型單純皰疹病毒a.提取II型單純皰疹病毒HG52株的全長(zhǎng)病毒DNA ；b.構(gòu)建含有ICP47基因上游側(cè)翼區(qū)序列和下游側(cè)翼區(qū)序列的質(zhì)粒pdICP47H2 bl.使用表1所示的引物，以步驟a得到的全長(zhǎng)病毒DNA為模板，PCR擴(kuò)增ICP47 基因上游側(cè)翼區(qū)序列和下游側(cè)翼區(qū)序列；表 權(quán)利要求
1.一種重組II型單純皰疹病毒載體，其特征在于，所述載體剔除了野生II型單純皰疹 病毒HG52株的ICP34. 5基因和ICP47基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組II型單純皰疹病毒載體，其中，所述載體在被剔除的 ICP34. 5基因的位置上插入了人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)盒。
3.—種重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)從野生型II型單純皰疹病毒HG52株中剔除ICP47基因，構(gòu)建HG52dICP47重組II型單純皰疹病毒a.提取II型單純皰疹病毒HG52株的全長(zhǎng)病毒DNA；b.構(gòu)建含有ICP47基因上游側(cè)翼區(qū)序列和下游側(cè)翼區(qū)序列的質(zhì)粒pdICP47H2bl.使用表1所示的引物，以步驟a得到的全長(zhǎng)病毒DNA為模板，PCR擴(kuò)增ICP47基因 上游側(cè)翼區(qū)序列和下游側(cè)翼區(qū)序列； 表1
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其特征在于，該方 法包括以下步驟(3)插入人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)盒，構(gòu)建重組II型單純皰疹病毒載體 HG52dICP47dICP34. 5-hGM-CSF i.提取步驟C5得到的重組II型單純皰疹病毒載體HG52dICP47d34. 5的全長(zhǎng)病毒DNA ； .將巨細(xì)胞病毒IE啟動(dòng)子控制的人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)盒插入到步 驟B3獲得的pH2d34. 5質(zhì)粒的EcoRV位點(diǎn)，得到pH2d34. 5-hGMCSF質(zhì)粒；iii.將步驟i得到的重組II型單純皰疹病毒載體HG52dICP47d34.5全長(zhǎng)病毒DNA與 步驟ii得到的pH2d34. 5-hGMCSF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，發(fā)生同源重組的病毒的毒斑表達(dá)人 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；iv.挑選酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定陽(yáng)性的毒斑，純化出重組II型單純皰疹病毒載體HG52dICP47dICP34. 5-hGM-CSF。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其特征在于，該方 法包括以下步驟I.提取步驟C2獲得的重組II型單純皰疹病毒HG52dICP47d34.5-GFP的全長(zhǎng)病毒DNA ；II.將巨細(xì)胞病毒IE啟動(dòng)子控制的人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)盒插入到步 驟B3獲得的pH2d34. 5質(zhì)粒的EcoRV位點(diǎn)，得到pH2d34. 5-hGMCSF質(zhì)粒；III.將步驟I得到的重組II型單純皰疹病毒載體HG52dICP47d34.5-GFP全長(zhǎng)病毒DNA 與步驟II得到的pH2d34. 5-hGMCSF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，發(fā)生同源重組的病毒的毒斑表達(dá) 人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子但不發(fā)熒光；IV.挑選無(wú)熒光毒斑，純化出重組II型單純皰疹病毒載體 HG52dICP47dICP34. 5-hGM-CSF
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任意一項(xiàng)所述的重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其特 征在于，所述方法還包括對(duì)所有涉及的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序以證實(shí)無(wú)突變發(fā)生的步驟。
7.—種重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)從野生型II型單純皰疹病毒HG52株中剔除ICP47基因，構(gòu)建HG52dICP47重組II型單純皰疹病毒a.提取II型單純皰疹病毒HG52株的全長(zhǎng)病毒DNA；b.構(gòu)建含有ICP47基因上游側(cè)翼區(qū)序列和下游側(cè)翼區(qū)序列的質(zhì)粒pdICP47H2bl.使用表1所示的引物，以步驟a得到的全長(zhǎng)病毒DNA為模板，PCR擴(kuò)增ICP47基因 上游側(cè)翼區(qū)序列和下游側(cè)翼區(qū)序列； 表1
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其特征在于，所述 方法還包括對(duì)所有涉及的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序以證實(shí)無(wú)突變發(fā)生的步驟。
9.一種重組II型單純皰疹病毒載體，其特征在于，所述載體為由權(quán)利要求3-8中任意 一項(xiàng)所述的方法所制備的重組II型單純皰疹病毒載體。
10.一種重組病毒，所述重組病毒包括作為載體的病毒和目的基因，其特征在于，所述 作為載體的病毒為權(quán)利要求1-2和9中任意一項(xiàng)所述的重組II型單純皰疹病毒載體。
11.一種藥物組合物，所述組合物包括權(quán)利要求1-2和9中任意一項(xiàng)所述的重組II型 單純皰疹病毒載體和/或權(quán)利要求10所述的重組病毒，以及藥物可接受的載體或賦形劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為注射液，所述注射液 包括藥學(xué)上可接受的載體以及權(quán)利要求1-2和9中任意一項(xiàng)所述的重組II型單純皰疹病 毒載體和/或權(quán)利要求10所述的重組病毒，每毫升所述注射液中含有IO2-IOki病毒噬斑形 成單位的所述病毒和/或重組病毒。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中，所述藥學(xué)上可接受的載體為PH值為 4. 0-9. 0的磷酸緩沖液。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中，所述注射液還含有保護(hù)劑和/或滲透 壓調(diào)節(jié)劑；以所述注射液為基準(zhǔn)，所述保護(hù)劑的含量為0. 01-30重量％，所述保護(hù)劑選自 肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調(diào)節(jié)劑的含量使所述注射液的滲透壓為 200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉和/或氯化鉀。
15.根權(quán)利要求1-2和9中任意一項(xiàng)所述的重組II型單純皰疹病毒載體和權(quán)利要求 10所述的重組病毒在制備治療腫瘤的基因藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種重組Ⅱ型單純皰疹病毒載體，其剔除了野生Ⅱ型單純皰疹病毒HG52株的ICP34.5基因和ICP47基因，優(yōu)選在被剔除的ICP34.5基因的位置上插入了hGM-CSF表達(dá)盒。本發(fā)明還提供了前述重組Ⅱ型單純皰疹病毒載體的制備方法，以該重組Ⅱ型單純皰疹病毒為載體的重組病毒，由該重組Ⅱ型單純皰疹病毒載體和藥物可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物，以及所述的重組Ⅱ型單純皰疹病毒載體在制備治療腫瘤的基因藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的重組Ⅱ型單純皰疹病毒載體，剔除了ICP34.5的基因，使溶瘤病毒更安全且能選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖；剔除ICP47基因以促進(jìn)免疫應(yīng)答及增強(qiáng)溶瘤活性；療效好于現(xiàn)有重組Ⅰ型單純皰疹病毒載體且安全性高。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102146418SQ20101011627
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者劉濱磊 申請(qǐng)人:武漢濱會(huì)生物科技有限公司