核酸提取用磁性微珠的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及磁性微珠的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷廣泛應(yīng)用，分子生物學(xué)技術(shù)已從以往的小規(guī)模的實驗室研究逐漸轉(zhuǎn)變成諸如疾病診斷、基因組測序、疾病基因的流行病學(xué)調(diào)研等需要大規(guī)模的程序化的操作的實用手段。以人類基因組測序為例，需要年復(fù)一年的核酸提取、純化、測序。許多優(yōu)秀的高級科研人員的大量的時間被花費在簡單的重復(fù)勞動之中，實在是一種巨大的浪費。同時手工操作的不可避免的不規(guī)范性容易造成誤差，人類基因組測序一般要重復(fù)3次以上，又進(jìn)一步加重工作強(qiáng)度。
[0003]磁性高分子微珠簡稱磁性微珠，是由磁性材料與高分子材料通過化學(xué)或物理方法復(fù)合而成的一種具有眾多優(yōu)異性能的功能材料。磁性材料主要有鐵酸鹽、鐵磁礦、純鐵粉、Fe3O4等，高分子材料有天然高分子材料及合成高分子材料兩種，天然高分子材料有淀粉、明膠、纖維素、殼聚糖等，合成高分子材料有聚苯乙烯、聚苯乙烯醇、消化纖維等。磁性微珠可以通過磁珠表面改性或者功能團(tuán)嫁接等方式將功能團(tuán)(-oh、-cooh、nh2等)引入磁性微珠表面，進(jìn)而得到具有功能化的磁性微珠。
[0004]磁性高分子微珠作為近年發(fā)展起來的一種新型磁性材料，不但具有納米效應(yīng)，SP表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)和體積效應(yīng)，還具有磁學(xué)性質(zhì)，如超順磁性與高磁化率等特性。其應(yīng)用已經(jīng)從傳統(tǒng)的技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展到高新技術(shù)領(lǐng)域，從單純的磁學(xué)范圍擴(kuò)展到與磁學(xué)相關(guān)的交叉學(xué)科領(lǐng)域。以核酸分離領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛。
[0005]傳統(tǒng)的核酸分離需要乙醇沉淀、氯仿萃取、離心分離、層膜析出、清晰、富集等操作，其步驟繁瑣、耗時費力，而分離效果及效率并不理想。磁性微珠在核酸分離中的應(yīng)用，加快了核酸富集分離的自動化程度，提高了分離效果和效率，大大降低了其他物質(zhì)對核酸的分離干擾，對推進(jìn)核酸快速富集分離提取技術(shù)的發(fā)展起到了積極的作用。
[0006]目前磁珠純化技術(shù)正在朝著全自動操作，提取和分離樣本多樣化、系統(tǒng)化方向發(fā)展。國產(chǎn)化磁珠的研制成功必將大幅度提高生物學(xué)科研工作效率、推動生物學(xué)科研究和產(chǎn)業(yè)化快速發(fā)展。但現(xiàn)有提取核酸用的生物磁珠粒徑大，存在表面能小、核酸吸附效率低的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明是要解決現(xiàn)有生物磁珠粒徑大，表面能小，核酸吸附效率低的問題，提供核酸提取用磁性微珠的制備方法。
[0008]本發(fā)明核酸提取用磁性微珠的制備方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0009]一、向0.5mol/L檸檬酸溶液中加入納米Fe3O4,用NH3.H2O調(diào)節(jié)溶液的pH值至5.5，在氮氣保護(hù)下攪拌2h，然后將納米Fe3O4取出，用丙酮洗滌，再將納米Fe3O4放入去離子水中超聲波分散45min，之后加入無水乙醇，形成乙醇-水體體系，并加入冊3.H2O調(diào)節(jié)溶液的pH值至6，然后向含有納米Fe3O4的乙醇-水體溶液滴加正硅酸乙酯，升溫至80°C，強(qiáng)力攪拌下反應(yīng)8h，最后將納米Fe3O4依次用去離子水和無水乙醇反復(fù)沖洗，干燥箱干燥48小時，得到Fe3OVS12磁性微珠;
[0010]二、將步驟一制備的Fe304/Si02磁性微珠加入乙醇-水溶液中，再分別加入質(zhì)量濃度為28%的濃氨水和TE0S，于室溫振蕩反應(yīng)3h，然后取出磁性微珠用去離子水洗滌至中性，再依次用無水乙醇和丙酮洗滌，之后于60°C真空干燥12h，再將磁性微珠放入質(zhì)量濃度為35 %的稀鹽酸溶液中浸泡30min，然后重新用去離子水洗滌至中性，再依次用無水乙醇和丙酮洗滌；
[0011]三、將步驟二洗滌后的磁性微珠分散于無水甲苯中，在氮氣保護(hù)下加入環(huán)氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷試劑，在110°C下回流反應(yīng)8h，得到改性磁珠，將所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液和甲醇洗滌并抽干，烘干后得到表面鍵合環(huán)氧基的磁性微珠；
[0012]四、將烘干得到表面鍵合環(huán)氧基的磁性微珠分散于pH值為3的質(zhì)量濃度為35%的稀鹽酸溶液中，在100°c下加熱回流2h，產(chǎn)物以去離子水洗滌至中性后，再分別以無水乙醇和丙酮洗滌，過濾收集磁性微珠，烘干得到表面鍵合二醇基的磁性微珠。
[0013]步驟一中檸檬酸溶液的體積與納米Fe3O4的質(zhì)量比為30mL:5g。
[0014]步驟一中納米Fe3O4與正硅酸乙酯的質(zhì)量比為1:1。
[0015]步驟二所述乙醇-水溶液中無水乙醇和水的體積比為5:1。
[0016]步驟二中Fe3OVS12磁性微珠與乙醇-水溶液的比為Ig: (38?39)mL。
[0017]步驟二中Fe3OjS12磁性微珠與氨水的比為5g: (3?5)mL。
[0018]步驟二中Fe3OjS12磁性微珠與TEOS的比為5g: (I?2)mL。
[0019]步驟三中磁性微珠與無水甲苯的比為lg:(5?6)mL。
[0020]步驟三中磁性微珠與環(huán)氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷的比為5g: (I?2)mL。
[0021 ] 步驟三中甲醇水溶液的體積濃度為50%。
[0022]步驟四中表面鍵合環(huán)氧基的磁性微珠的質(zhì)量與稀鹽酸溶液的體積比為lg:10mL。
[0023]本發(fā)明另一種核酸提取用磁性微珠的制備方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0024]一、向0.5mol/L檸檬酸溶液中加入納米Fe304，用NH3.H2O調(diào)節(jié)溶液的pH值至5.5，在氮氣保護(hù)下攪拌2h，然后將納米Fe3O4取出，用丙酮洗滌，再將納米Fe3O4放入去離子水中超聲波分散45min，之后加入無水乙醇，形成乙醇-水體體系，并加入冊3.H2O調(diào)節(jié)溶液的pH值至6，然后向含有納米Fe3O4的乙醇-水體溶液滴加正硅酸乙酯，升溫至80°C，強(qiáng)力攪拌下反應(yīng)8h，最后將納米Fe3O4依次用去離子水和無水乙醇反復(fù)沖洗，干燥箱干燥48小時，得到Fe3OVS12磁性微珠;
[0025]二、將步驟一制備的Fe3O^S12磁性微珠加入乙醇-水溶液中，再分別加入質(zhì)量濃度為28%的濃氨水和TE0S，于室溫振蕩反應(yīng)3h，然后取出磁性微珠用去離子水洗滌至中性，再依次用無水乙醇和丙酮洗滌，之后于60°C真空干燥12h，再將磁性微珠放入質(zhì)量濃度為35 %的稀鹽酸溶液中浸泡30min，然后重新用去離子水洗滌至中性，再依次用無水乙醇和丙酮洗滌；
[0026]三、將步驟二洗滌后的磁性微珠分散于無水甲苯中，在氮氣保護(hù)下加入環(huán)氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷試劑，在110°C下回流反應(yīng)8h，得到改性磁珠，將所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液和甲醇洗滌并抽干，烘干后得到表面鍵合環(huán)氧基的磁性微珠；
[0027]四、將NaOH溶于去離子水中，隨后加入亞氨基二乙酸使其溶解，所得亞氨基二乙酸鈉溶液在60 °C下加熱至溶解，然后于剩余溶液中加入大量甲醇溶液，使得亞氨基二乙酸鈉鹽析出，過濾收集固體，600C下真空烘干，得到亞氨基二乙酸鈉；
[0028]將步驟三得到的表面鍵合環(huán)氧基的磁性微珠與亞氨基二乙酸鈉先后加于甲醇中，攪拌下反應(yīng)48h，磁性微珠產(chǎn)物依次以水、甲醇處理以除去過量的亞氨基二乙酸鈉后，浸泡于PH值為3的質(zhì)量濃度為35%的稀HCl中30min，然后以去離子水洗滌產(chǎn)物至中性，再以甲醇、丙酮各洗滌一遍，過濾收集，烘干得到表面包覆亞氨基二乙酸的磁性微珠。
[0029]步驟一中檸檬酸溶液的體積與納米Fe3O4的質(zhì)量比為30mL:5g。
[0030]步驟一中納米Fe3O4與正硅酸乙酯的質(zhì)量比為1:1。
[0031 ] 步驟二所述乙醇-水溶液中無水乙醇和水的體積比為5:1。
[0032]步驟二中Fe3OjS12磁性微珠與乙醇-水溶液的比為Ig: (38?39)mL。
[0033]步驟二中Fe3OjS12磁性微珠與氨水的比為5g: (3?5)mL。
[0034]步驟二中Fe3OjS12磁性微珠與TEOS的比為5g: (I?2)mL。
[0035]步驟三中磁性微珠與無水甲苯的比為Ig:(5?6)mL。
[0036]步驟三中磁性微珠與環(huán)氧丙基丙氧基硅烷的比為5g:(I?2)mL。
[0037]步驟三中甲醇水溶液的體積濃度為50%。
[0038]步驟四中NaOH的質(zhì)量與去離子水的體積比為2g:30mL。
[0039]步驟四中NaOH與亞氨基二乙酸的質(zhì)量比為2: 3。
[0040]步驟四中表面鍵合環(huán)氧基的磁性微珠與亞氨基二乙酸鈉的質(zhì)量比為4:0.2。
[0041 ]步驟四中亞氨基二乙酸鈉的質(zhì)量與甲醇的體積比為0.2g: 20mL。
[0042]本發(fā)明的有益效果:
[0043 ]本發(fā)明方法制備的磁珠粒徑達(dá)到20納米左右，磁珠表面形成均勾穩(wěn)定的高分子包覆層，通過二次包覆與功能團(tuán)嫁接，實現(xiàn)納米磁珠對核酸的有效提取。利用納米磁性微珠表面嫁接的活性官能團(tuán)(-COOH、-COH、-NH2、-OH等)與核酸中的-COOH或_順2偶聯(lián)，將核酸分子吸附在磁珠表面。利用磁性微珠的超順磁性，通過外加磁場，將磁珠移動到指定區(qū)域，去除細(xì)胞裂解液，然后在低鹽濃度環(huán)境下使用洗脫液將核酸從磁珠表面洗脫下來，從而提取核酸。
[0044]該磁珠可以通過外加磁場對核酸進(jìn)行有效的控制分離。不但降低了產(chǎn)品的成本，同時加快了核酸提取的速度、簡化了提取步驟，為核酸富集分離全自動化提供技術(shù)基礎(chǔ)。
[0045]本發(fā)明方法制備的磁珠粒徑小，為納米級;提高了磁珠的表面能，延長磁珠在提取液中的懸浮時間，能夠與目標(biāo)提取物更有效地接觸，提高目標(biāo)提取物的提取率;利用納米Fe3O4的超順磁性和