專利名稱：一種親本特異位點(diǎn)測(cè)序克隆基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種親本特異位點(diǎn)測(cè)序克隆基因的方法。
背景技術(shù)：
自然界物種性狀豐富多樣，如株高、抗病性、產(chǎn)量等。從孟德?tīng)枙r(shí)代起，就逐漸認(rèn)識(shí)到了性狀是由遺傳因子控制，摩爾根進(jìn)一步將遺傳因子明確為“基因”，并指出基因位于染色體上且呈線性排列。確定基因在染色體上具體的位置(基因定位)是研究性狀的基礎(chǔ)，也是分離、克隆并利用基因的前提。經(jīng)典的基因定位策略源于摩爾根的連鎖理論，即染色體上相鄰基因(即基因連鎖)不能自由分離，而是傾向于整體向后代傳遞，它們所控制的性狀也傾向于同時(shí)出現(xiàn)。二者相鄰越近，性狀同時(shí)出現(xiàn)的可能性越大，重組性狀越少。因此，由重組性狀(配子)的比 例可以度量二者間的距離。若已知道其中一個(gè)基因在染色體上的位置(稱這樣的基因?yàn)闃?biāo)記基因)，就可以根據(jù)重組率推斷另一個(gè)基因的位置。例如，黃色圓粒豌豆品種(基因型分別為YYRR)與綠色皺粒品種(基因型為yyrr)雜交產(chǎn)生F1 (基因型YyRr) ,F1自交可能產(chǎn)生YR、Yr、yR和yr4種配子，根據(jù)F2代的性狀表現(xiàn)可以確定它們的比例，進(jìn)而計(jì)算交換率。若交換率為I %，且已知控制顏色的Y基因位于第3染色體上，那么就可以推測(cè)，控制豌豆籽粒形狀的R基因位于第3染色體且與Y基因相距l(xiāng)cM。從以上的分析可以看出，經(jīng)典連鎖標(biāo)記定位的實(shí)質(zhì)是找到與目標(biāo)性狀連鎖的已知分子標(biāo)記，并計(jì)算二者的交換率，進(jìn)而推斷目標(biāo)基因的位置。分離群體分池是基因定位的實(shí)際操作策略，以上述實(shí)例進(jìn)行說(shuō)明如下。以籽粒形狀為標(biāo)準(zhǔn)，將F2群體劃分為兩個(gè)部分(池)顯性池(隨機(jī)抽取的圓粒單株)和隱性池(隨機(jī)抽取的皺粒單株)，比較豌豆基因組上已知的1000個(gè)SSR標(biāo)記(SSR1-SSR1000)擴(kuò)增產(chǎn)物在這兩個(gè)池間的差異。若標(biāo)記SSR17與籽粒形狀R/r連鎖，那么對(duì)籽粒形狀分池，也就相當(dāng)于對(duì)SSR17分池，因此，SSR17在兩個(gè)池間的擴(kuò)增產(chǎn)物是有差異的，相反就沒(méi)有差異，由此確定目標(biāo)基因與SSR17處于同一染色體。再分析F2各個(gè)單株的表現(xiàn)，計(jì)算R/r與SSR17的遺傳距離，即可進(jìn)一步定位R/r在該染色體上的具體位置。分子標(biāo)記連鎖定位基因經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，已成為基因定位的經(jīng)典方法，但該方法依舊存在明顯缺陷，主要表現(xiàn)如下(I)經(jīng)典定位方法依賴于分子標(biāo)記，分子標(biāo)記分為兩種，一種為通用標(biāo)記，如RAPD.AFLP等，可用于任何物種，但這些標(biāo)記在染色體上的位置信息不明確，因此，利用通用標(biāo)記定位基因極為耗時(shí)耗力，且十分困難，利用這類標(biāo)記定位的基因相當(dāng)有限。另一類標(biāo)記是已知染色體信息的，如SSR標(biāo)記。只要找到了與性狀連鎖的標(biāo)記，就相當(dāng)于找到目標(biāo)基因的大致位置，目前大部分性狀是利用此類標(biāo)記定位的。然而，已開(kāi)發(fā)此類標(biāo)記的物種只占了很少一部分，絕大部分自然界的有利基因無(wú)法通過(guò)這一方法定位、克隆和利用。(2)找到的是與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記，即得到的是包含目標(biāo)基因的區(qū)段，而不是目標(biāo)基因本身，還需要基因預(yù)測(cè)和大量驗(yàn)證工作以排除區(qū)段內(nèi)非目標(biāo)基因，當(dāng)區(qū)段較大時(shí)，該工作十分困難甚至難以完成。而且易漏掉基因，如很小的蛋白分子、非編碼基因等。
(3)要求定位群體遺傳距離大，找到連鎖標(biāo)記的可能性才大。從而導(dǎo)致一些問(wèn)題。第一，過(guò)大遺傳距離常導(dǎo)致性狀偏分離，需另建群體調(diào)查性狀分離比，增加了工作量。第二，遠(yuǎn)緣雜交難以用于育種，導(dǎo)致基因定位理論研究與育種應(yīng)用實(shí)踐脫節(jié)，這違背了基因定位的初衷。(4)精細(xì)定位時(shí)，連鎖標(biāo)記與目標(biāo)基因距離很近，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性標(biāo)記變得越來(lái)越難，常出現(xiàn)無(wú)標(biāo)記可用的情況。另外，相鄰很近導(dǎo)致交換很難 發(fā)生，要獲得準(zhǔn)確的交換率，群體要求很大。而交換率計(jì)算是定量分析，需要檢查群體每一個(gè)單株，工作量十分巨大
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種能夠準(zhǔn)確、快速克隆目標(biāo)基因的未本特異位點(diǎn)測(cè)序克隆基因的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種親本特異位點(diǎn)測(cè)序克隆基因的方法，其特征在于，包括以下步驟選用遺傳距離近但目標(biāo)性狀有差異的材料做親本，通過(guò)兩個(gè)親本雜交構(gòu)建群體，從分離群體中選擇具有隱性性狀的個(gè)體構(gòu)建隱性基因池，對(duì)兩個(gè)親本進(jìn)行基因組高通量測(cè)序，通過(guò)初步、de novo(直接)組裝并比對(duì)，獲得顯性與隱性親本特異位點(diǎn)，將它們定義為目標(biāo)基因的候選位點(diǎn)；通過(guò)富集隱性池候選位點(diǎn)并重測(cè)序或PCR方式逐個(gè)檢查隱性池每個(gè)個(gè)體的每個(gè)候選位點(diǎn)的方式，確定目標(biāo)基因座位；通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆全長(zhǎng)目標(biāo)基因，通過(guò)遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證目標(biāo)基因。本發(fā)明更具體的技術(shù)方案是一種親本特異位點(diǎn)測(cè)序克隆基因的方法，包括以下步驟(I)構(gòu)建分離群體利用分別含有相對(duì)性狀的親本雜交后構(gòu)建分離群體；(2)隱性池的獲得隨機(jī)選擇分離群體中目標(biāo)性狀為隱性的個(gè)體組成隱性池；(3)DNA提取取兩個(gè)親本的葉片或其它組織，分別提取并獲得兩個(gè)親本的基因組DNA ;從隱性池中每個(gè)體上取等量組織混合后提取DNA，或從每個(gè)個(gè)體中提取DNA后等量混合，獲得隱性池DNA ；(4)確定候選位點(diǎn)按高通量測(cè)序流程構(gòu)建2個(gè)親本文庫(kù)，PCR并高通量測(cè)序；初步組裝親本基因組后，比對(duì)2個(gè)親本基因組DNA，分別獲得顯性親本與隱性親本中的特異位點(diǎn)，將這些特異位點(diǎn)定義為目標(biāo)基因候選位點(diǎn)；(5)目標(biāo)位點(diǎn)的確定通過(guò)兩個(gè)方式確定目標(biāo)位點(diǎn)；第一種候選位點(diǎn)超過(guò)50個(gè)時(shí)，通過(guò)雜交(如安捷倫SureSelect平臺(tái))或PCR方式在隱性池中富集候選位點(diǎn)后再次高通量測(cè)序，檢測(cè)顯性親本中特有的候選位點(diǎn)是否在隱性池中出現(xiàn)，若沒(méi)有出現(xiàn)，則為目標(biāo)性狀的基因位點(diǎn)。第二種候選位點(diǎn)不足50個(gè)時(shí)，可采用普通PCR、實(shí)時(shí)PCR或高通量的OppenArray的檢測(cè)方式，逐個(gè)檢查隱性池每個(gè)個(gè)體的每個(gè)候選位點(diǎn)。同樣,沒(méi)有出現(xiàn)的顯性座位位點(diǎn)即為目標(biāo)位點(diǎn)。(6)基因克隆與功能驗(yàn)證通過(guò)比對(duì)親本基因組的方式獲得基因的全長(zhǎng)序列，PCR擴(kuò)增克隆目標(biāo)基因，按通用的遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所克隆基因的功能。所述親本雜交構(gòu)建分離群體最好利用遺傳距離近的純系親本構(gòu)建，且距離越近越好。
本發(fā)明實(shí)施例的有益效果是(I)可應(yīng)用于任何物種。經(jīng)典克隆方法依賴于分子標(biāo)記，目前大部分物種分子標(biāo)記發(fā)展還不成熟，應(yīng)用受限。本發(fā)明以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)，不需要分子標(biāo)記，可應(yīng)用于任何物種，大大拓寬了對(duì)自然界基因利用的范圍，對(duì)基因克隆產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)步。(2)直接克隆基因本身。傳統(tǒng)方法克隆基因之前需要定位基因，獲得的是包含目標(biāo)基因的區(qū)域，本發(fā)明直接克隆了目標(biāo)基因。(3)工作量大為減少，速度大為加快。傳統(tǒng)克隆方法耗時(shí)數(shù)年是很正常的，本發(fā)明群體構(gòu)建完成后，只需要提取3份DNA、富集I份DNA，并進(jìn)I次或2次高通量測(cè)序即可完成實(shí)驗(yàn)，可在數(shù)月內(nèi)完成，工作量大為減少，速度大為加快。(4)風(fēng)險(xiǎn)大為降低。傳統(tǒng)克隆方法常因缺乏足夠或合適的標(biāo)記而失敗。本發(fā)明技術(shù)方案中，只要保證測(cè)序覆蓋度，即可發(fā)現(xiàn)目的基因。大部分步驟有概率保證，具有判斷的標(biāo)準(zhǔn)。比如，在隱性池中測(cè)得的序列，可以與顯性親本或隱性親本序列組成比較，以排除測(cè)序誤差、基因突變等偶然因素的影響。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例I提供的基因克隆方法流程示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例2提供的水稻高桿基因克隆方法流程示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例I :一種親本特異位點(diǎn)測(cè)序克隆基因的方法(參見(jiàn)圖I)(I)構(gòu)建分離群體選擇具有相對(duì)目標(biāo)性狀的兩個(gè)親本進(jìn)行正反交(除目標(biāo)性狀外，其它性狀差異越小越好，可通過(guò)突變株/野生株或回交育種產(chǎn)生姊妹系等方式創(chuàng)造親本)。根據(jù)F1的表現(xiàn)判斷控制性狀的基因座位是顯性還是隱性；根據(jù)正反交的性狀是否有差異，判斷是否具有細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)，若沒(méi)有差異，表明不受細(xì)胞質(zhì)基因影響，否則該性狀與細(xì)胞質(zhì)基因相關(guān)A自交形成F2群體。根據(jù)相對(duì)性狀在F2群體中植株的比例，判斷控制目標(biāo)性狀的基因?qū)?shù)，卡方檢驗(yàn)若符合3 I的分離比，則為I對(duì)基因控制，否則為多對(duì)基因控制。(2)隱性池的構(gòu)建與DNA提取。從F2群體中隨機(jī)選擇隱性個(gè)體構(gòu)建隱性池(在保證性狀鑒定準(zhǔn)確的前提下，隱性池中植株數(shù)盡可能多)。將選出的每株葉片或其它組織等量混合后，提取獲得隱性池基因組DNA,也可將隱性池的單株分別提取DNA后再等量混合獲得隱性混合池DNA。同時(shí)分別提取2個(gè)親本的基因組DNA。(3)全基因組高通量測(cè)序與候選基因位點(diǎn)的確定。按高通量測(cè)序操作流程，分別構(gòu)建2個(gè)親本的DNA文庫(kù)，然后進(jìn)行PCR并上機(jī)測(cè)序。比對(duì)2個(gè)親本的測(cè)序片段，對(duì)親本基因組進(jìn)行初步的de novo組裝(忽略重復(fù)序列等不能組裝的區(qū)域，因?yàn)檫@些區(qū)域通常不含編碼基因)，通過(guò)比對(duì)獲得每一親本的特異位點(diǎn)，比較特異位點(diǎn)在組裝后的基因組上的位置，判斷它們之間的等位關(guān)系。所有這些親本特異的位點(diǎn)被定義為目標(biāo)基因的候選位點(diǎn)。(4)目標(biāo)基因的確定與克隆。具體操作如下當(dāng)目標(biāo)基因候選位點(diǎn)數(shù)超過(guò)50個(gè)時(shí)，向安捷倫公司提交目標(biāo)基因候選位點(diǎn)的序列，由安捷倫公司設(shè)計(jì)探針，在SureSelect平臺(tái)上,從隱性混合池中富集所有候選位點(diǎn)。在候選位點(diǎn)不多的情況下，也可采用PCR擴(kuò)增的方式在隱性混合池中富集候選基因。對(duì)富集的候選位點(diǎn)進(jìn)行高通量測(cè)序。將顯性親本中的特異位點(diǎn)按完全匹配的方式與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，沒(méi)有出現(xiàn)的顯性親本位點(diǎn)為目標(biāo)位點(diǎn)。當(dāng)目標(biāo)基因候選位點(diǎn)數(shù)不足50個(gè)時(shí)，可針對(duì)每一個(gè)候選位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，按普通PCR、實(shí)時(shí)PCR或高通量的PCR如OpenArray等方式,逐一檢驗(yàn)隱性池中每一個(gè)體的每一候選位點(diǎn)，同樣，沒(méi)有出現(xiàn)的顯性親本特異位點(diǎn)為目標(biāo)位點(diǎn)。另外，等位位點(diǎn)比例接近I : I的為與目標(biāo)性狀無(wú)關(guān)的非連鎖位點(diǎn)，比例介于I : O和I : I之間為與目標(biāo)性狀連鎖的位點(diǎn)。設(shè)隱性混合池中個(gè)體數(shù)為η個(gè)，連鎖位點(diǎn)與目標(biāo)座位遺傳距離為m CM，則隱性混合池測(cè)序中，該連鎖位點(diǎn)不能出現(xiàn)的概率(該位點(diǎn)不 能與目標(biāo)座位區(qū)分開(kāi)的概率)為(l-m% VntjSn = SOOOm = O. I，則概率為(1_0. 1%) 2*3000= 0.25%。因此，即使遺傳距離很近(O. IcM)，也有超過(guò)99%的把握直接獲得目標(biāo)位點(diǎn)。目標(biāo)位點(diǎn)獲得后，可通過(guò)信息學(xué)基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)基因的起始位點(diǎn)與結(jié)束位點(diǎn)，再通過(guò)PCR方式克隆獲得全長(zhǎng)基因。(5)目標(biāo)基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。利用轉(zhuǎn)顯性基因于隱性植株或RNAi等經(jīng)典方法，進(jìn)行遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證基因功能，檢測(cè)所克隆基因的正確性。實(shí)施例2 下面通過(guò)一個(gè)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明水稻高桿基因克隆方法(參見(jiàn)圖2)(I)群體構(gòu)建RH23與RS35為育種選育的兩個(gè)水稻親本，其中，RH23平均株高為134. 56cm, RS35平均株高為87. 89cm，二者為姊妹系，除了株高性狀外，其余性狀基本相同。RH23與RS35進(jìn)行正反交產(chǎn)生F1, F1表現(xiàn)為高桿(平均株高134. 49cm)，表明高桿為顯性，矮桿為隱性，正反交之間株高沒(méi)有顯著差異，表明株高不受細(xì)胞質(zhì)基因控制。種植F2共20000株，按株高>135cm和< 86cm將群體分為高桿和矮桿兩個(gè)群體，其中高桿13783株，矮桿為4637株，經(jīng)卡方檢驗(yàn)在95%的概率保證下符合3 I的分離比，表明高桿受一對(duì)顯性基因控制，定名為HD。從矮桿群體中隨機(jī)選擇3000個(gè)植株，每個(gè)植株取少許葉片，混合磨樣后充分混勻，與親本RH23和RS35 —起分別按植物DNA提取試劑盒(DP305，天更，北京)操作手冊(cè)分離純化基因組DNA，利用ND2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定樣品濃度與純度。(2)親本測(cè)序與目標(biāo)基因候選位點(diǎn)的確定按Illumina GAIIx高通量測(cè)序技術(shù)規(guī)程建兩個(gè)親本RH23、RS35和矮桿隱性池文庫(kù)并高通量測(cè)序，采用Fragment建庫(kù)方式，采用條形碼對(duì)2種基因組DNA進(jìn)行區(qū)分。RH23和RS35測(cè)序上樣量比例為I : I。對(duì)輸出的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除低質(zhì)量序列等處理后，2個(gè)樣本的總測(cè)序量的Clean data分別為9. 3G和7. SG。水稻基因組總長(zhǎng)約為O. 3G，這些測(cè)序數(shù)據(jù)平均覆蓋31和26倍水稻基因組,用基因組組裝程序ABySS (http ://www. bcgsc. ca/platform/bio info/software/abyss)對(duì)兩個(gè)親本 RH23 和 RS35 基因組進(jìn)行初步 de novo 組裝。比較兩親本基因組間的差異，在RH23和RS35基因組間分別有258個(gè)特有的差異位點(diǎn)，分別命名為Hl，H2，H3……H258和SI，S2，S3……S258。這些特異位點(diǎn)兩兩之間，除一個(gè)堿基外，其余部分均相同，表明它們兩兩之間可能為等位基因，且均為單堿基點(diǎn)突變位點(diǎn)(因?yàn)橛H本互為姊妹系，所以差異位點(diǎn)不多，大部分差異位點(diǎn)可能是自然突變后形成，因此為點(diǎn)突變)。將這258個(gè)等位位點(diǎn)確定為控制株高性狀的候選基因。(3)安捷倫SureSelect平臺(tái)富集目標(biāo)基因候選位點(diǎn)、重測(cè)序與目標(biāo)基因的克隆根據(jù)這258個(gè)目標(biāo)基因的候選位點(diǎn)序列，按安捷倫基于Web的探針設(shè)計(jì)方案(https://earray. chem. agilent. com/earray/)設(shè)計(jì)這258個(gè)候選位點(diǎn)的雜交探針，按安捷倫SureSelect試劑盒操作手冊(cè)對(duì)這258個(gè)序列進(jìn)行捕獲并建立測(cè)序文庫(kù)，每個(gè)位點(diǎn)捕獲
0.5kb，258個(gè)位點(diǎn)共129kb。按Illumina GAIIx高通量測(cè)序技術(shù)規(guī)程，選用擴(kuò)增子串聯(lián)法建庫(kù)，對(duì)以上258個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行高通量測(cè)序，共獲得獲得152. 93G測(cè)序數(shù)據(jù)(Clean Data :清除了接頭和不完全匹配的序列)，每個(gè)位點(diǎn)平均被覆蓋320. 72萬(wàn)次。其中，H3中被檢測(cè)到了 320. 22萬(wàn)次，除9條序列與S3匹配外，其余均與H3完全匹配，考慮到高通量測(cè)序也存在錯(cuò)誤，因此，極低頻率與S3匹配可以看作是測(cè)序的隨機(jī)錯(cuò)誤，判斷該位點(diǎn)為控制株高的目標(biāo)位點(diǎn)(最終通過(guò)遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證)。H41被檢測(cè)到了 325. 42萬(wàn)次，有322. 10萬(wàn)次與H41完全匹配，3. 32萬(wàn)次與S41完全匹配，表明H41為與H3連鎖的位點(diǎn)，二者遺傳距離大約為I. 03cM。其余256個(gè)目標(biāo)基因的候選位點(diǎn)的顯性頻率與隱性頻率之間的比例很接近I 1，表明它們?yōu)榕c目標(biāo)位點(diǎn)無(wú)關(guān)的位點(diǎn)。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)表明，H3為控制水稻高桿的基因座位。將上述H3與初步組裝顯性親本基因組比對(duì)，通過(guò)基因組注釋內(nèi)容發(fā)現(xiàn)，H3位點(diǎn)位于一基因外顯子內(nèi)，整個(gè)基因全長(zhǎng)為3123bp,功能注釋為赤酶素氧化酶?；谌L(zhǎng)為3123bp基因起始點(diǎn)前500bp和結(jié)束點(diǎn)后500bp的堿基序列，利用Primer5設(shè)計(jì)引物于RH23親本中擴(kuò)增全長(zhǎng)基因序列，引物設(shè)計(jì)按該軟件提供的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行。Sense primer (正向引物)為序列表中的 SEQID NO. I ACTCACTCCCGCTCAACA ；Antisense primer(反向引物)為序列表中的 SEQ IDN0. 2 :CATTCATCCGTCGTTCCA。PCR 擴(kuò)增體系按試劑盒 DreamTaq Green PCRMaster Mix(2X) (K1081, fermentas)推薦體系進(jìn)行，即含 PCR 混合物 501，RH23 模板 15ng,引物21 (濃度0. 5M/L)，加純水至總體積為1001。擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性4分鐘；94°C，I分鐘，54°C，3分鐘，72°C，3分鐘，循環(huán)44次；72°C延伸8分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。按PCR產(chǎn)物按瓊脂糖凝膠回收試劑盒(K0691,Fermentas)操作手冊(cè)回收并純化擴(kuò)增片段并測(cè)序，獲得控制水稻高桿的目的基因序列為序列表中的SEQ ID N0.3所示。atggtggccgagcaccccacgccaccacagccgcaccaaccaccgcccatggactccaccgccggctctggcattgccgccccggcggcggcggcggtgtgcgacctgaggatggagcccaagatcccggagccattcgtgtggccgaacggcgacgcgaggccggcgtcggcggcggagctggacatgcccgtggtcgacgggggcgtgctccgcgacggcgacgccgaggggctgcgccgcgccgcggcgcaggtggccgccgcgtgcgccacgcacgggttcttccaggtgtccgagcacggcgtcgacgccgctctggcgcgcgccgcgctcgacggcgccagcgacttcttccgcctcccgctcgccgagaagcgccgcgcgcgccgcgtcccgggcaccgtgtccggctacaccagcgcccacgccgaccgcttcgcctccaagctcccatggaaggagaccctctccttcggcttccacgaccgcgccgccgcccccgtcgtcgccgactacttctccagcaccctcggccccgacttcgcgccaatggggtaattaaaacgatggtggacgacattgcatttcaaattcaaaacaaattcaaaacacaccgaccgagattatgctgaattcaaacgcgtttgtgcgcgcaggagggtgtaccagaagtactgcgaggagatgaaggagctgtcgctgacgatcatggaactcctggagctgagcctgggcgtggagcgaggctactacagggagttcttcgcggacagcagctcaatcatgcggtgcaactactacccgccatgcccggagccggagcggacgctcggcacgggcccgcactgcgaccccaccgccctcaccatcctcctccaggacgacgtcggcggcctcgaggtcctcgtcgacggcgaatggcgccccgtcagccccgtccccggcgccatggtcatcaacatcggcgacaccttcatggtaaaccatctcctattctcctctcctctgttctcctctgcttcgaagcaacagaacaagtaattcaagcttttttttctctctcgcgcgaaattgacgagaaaaataagatcgtggtaggggcggggctttcagctgaaagcgggaagaaaccgacctgacgtgatttctctgttccaatcacaaacaatggaatgccccactcctccatgtgttatgatttatctcacatcttatagttaataggagtaagtaacaagctacttttttcatattatagttcgtttgattttttttttttaaagtttttttagttttatccaaatttattgaaaaactt agcaacgtttataataccaaattagtctcatttagtttaatattgtatatattttgataatatatttatgttatattaaaaatattactatatttttctataaacattattaaaagccatttataatataaaatggaaggagtaattaatatggatctcccccgacatgagaatattttccgatggtgtgacgacgccatgtaagcttcggtgggcctggacggccagaggtgccaacagccacgtccaacaacccctgggtccccccctaacactccaaacagtagtgagtagtgtctcgtcgcgttttagtatttgatgacaaacaaagtgtgagttgagttagccaccaccaacttgcacacgagcacatacatttgtgtccattctcgccagtcacttccatctctagtcctaactcctatctagcgatgtaagcggataatttcatcatccgtatataaacctgtttgttatagttaatttcctatataatactataacagtatacattttaaaagaaaacaaaattaggataaacaggccctgctcctatccatccatggcacttggaaggaccagactcggtcatgccatgccaagccaagatatgggttatggaagagtagagaagaggagagatgagagataagcatgcgttctcctcctcgttggatgtgtattttggagggatttgtgtagtagtagcagcggcgccgcggggacggatgcggatggtggcgctttcggtggcgttttcccgggggggttttggtttggcgcttgggggggatggcatggcgcggcgtgcggctgcacgccacacacacgcgcgcgcacgcacgtacgtcgtcgtcgccgcgggcggacggtagcttagggtggtgtgttccgcgcgcgggcgcggattgttccatgccgatcgatttggcgccaccctcgccgcggctcttgtcgcgtcgtgcgcctctctcgcgcggtttgtccttgtcgcgttgctcagccggcgacgggggcacggacattggcgatgtagccctgcacgtgtcggcctctccgttgatgaatgatgatgtatgtatgtatttttttttgtctgaaggaatttgtggggaattgttgtgtgtgcaggcgctgtcgaacgggaggtataagagctgcctgcacagggcggtggtgaaccagcggcgggagcggcggtcgctggcgttcttcctgtgcccgcgggaggacagggtggtgcggccgccgccgagcgccgccacgccgcagcactacccggacttcacctgggccgacctcatgcgcttcacgcagcgccactaccgcgccgacacccgcacgctcgacgccttcacgcgctggctcgcgccgccggccgccgacgccgccgcgacggcgcaggtcgaggcggccagctgao 通過(guò)以上技術(shù)手段，克隆獲得了控制水稻株高的基因HD，(4)功能互補(bǔ)驗(yàn)證利用根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體，將HD轉(zhuǎn)入矮桿親本RS23中，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株表現(xiàn)為高桿，證明HD控制了水稻高桿性狀。以上所述的實(shí)施例，只是本發(fā)明較優(yōu)選的具體實(shí)施方式
的一種，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)進(jìn)行的通常變化和替換都應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種親本特異位點(diǎn)測(cè)序克隆基因的方法，其特征在于，包括以下步驟選用目標(biāo)性狀有差異的材料做親本，通過(guò)兩親本雜交構(gòu)建分離群體，從分離群體中選擇具有隱性性狀的個(gè)體構(gòu)建隱性基因池；對(duì)兩個(gè)親本進(jìn)行基因組高通量測(cè)序，通過(guò)初步直接組裝并比對(duì)，獲得顯性與隱性親本特異位點(diǎn)，該特異位點(diǎn)為目標(biāo)基因的候選位點(diǎn)；通過(guò)富集隱性池候選位點(diǎn)并重測(cè)序或PCR方式逐個(gè)檢查隱性池每個(gè)個(gè)體的每個(gè)候選位點(diǎn)的方式，確定目標(biāo)基因位點(diǎn)；通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆全長(zhǎng)目標(biāo)基因，通過(guò)遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證目標(biāo)基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的親本特異位點(diǎn)測(cè)序克隆基因的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)構(gòu)建分離群體利用分別含有相對(duì)性狀的兩親本雜交后構(gòu)建分離群體； (2)隱性池的獲得隨機(jī)選擇分離群體中目標(biāo)性狀為隱性的個(gè)體組成隱性池； (3)DNA提取取兩個(gè)親本的葉片或其它組織，分別提取并獲得兩個(gè)親本的基因組DNA；從隱性池中每個(gè)體上取等量組織混合后提取DNA，或從每個(gè)個(gè)體中提取DNA后等量混合，獲得隱性池DNA ； (4)確定候選位點(diǎn)按高通量測(cè)序流程分別構(gòu)建親本文庫(kù)，PCR并高通量測(cè)序；按denovo (直接)組裝，初步構(gòu)建兩親本全基因組，通過(guò)比對(duì)，分別獲得顯性親本與隱性親本中的特異位點(diǎn)及其等位關(guān)系，該位點(diǎn)為目標(biāo)性狀的候選位點(diǎn)； (5)目標(biāo)位點(diǎn)的確定當(dāng)候選位點(diǎn)超過(guò)50個(gè)時(shí)，通過(guò)雜交或PCR方式在隱性池中富集候選位點(diǎn)后再次高通量測(cè)序，檢測(cè)顯性親本中特有的候選位點(diǎn)是否在隱性池中出現(xiàn)，若沒(méi)有出現(xiàn)，則為目標(biāo)性狀的基因位點(diǎn)；當(dāng)候選位點(diǎn)不足50個(gè)時(shí)，采用普通PCR、實(shí)時(shí)PCR或高通量的OppenArray的檢測(cè)方式，逐個(gè)檢查隱性池每個(gè)個(gè)體的每個(gè)候選位點(diǎn)，沒(méi)有出現(xiàn)的顯性座位位點(diǎn)即為目標(biāo)位點(diǎn)； (6)基因克隆與功能驗(yàn)證通過(guò)比對(duì)親本基因組的方式獲得基因的全長(zhǎng)序列，PCR擴(kuò)增克隆目標(biāo)基因，按通用的遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所克隆基因的功能。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的親本特異位點(diǎn)測(cè)序克隆基因的方法，其特征在于，所述親本雜交構(gòu)建分離群體是利用遺傳距離近的純系親本。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種親本特異位點(diǎn)測(cè)序克隆基因的方法。其包括以下步驟選用目標(biāo)性狀有差異的材料做親本，通過(guò)兩親本雜交構(gòu)建分離群體，從分離群體中選擇具有隱性性狀的個(gè)體構(gòu)建隱性基因池；對(duì)兩個(gè)親本進(jìn)行基因組高通量測(cè)序，通過(guò)初步直接組裝并比對(duì)，獲得顯性與隱性親本特異位點(diǎn)，該特異位點(diǎn)為目標(biāo)基因的候選位點(diǎn)；通過(guò)富集隱性池候選位點(diǎn)并重測(cè)序或PCR方式逐個(gè)檢查隱性池每個(gè)個(gè)體的每個(gè)候選位點(diǎn)的方式，確定目標(biāo)基因位點(diǎn)；通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆全長(zhǎng)目標(biāo)基因，通過(guò)遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證目標(biāo)基因。本發(fā)明以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)，可用于任何物種，直接克隆基因本身。采用本發(fā)明的方法，工作量大為減少，速度大為加快，而且降低了風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102899312SQ201110215778
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者彭海, 張靜, 章偉雄 申請(qǐng)人:江漢大學(xué)