一種海豚鏈球菌環(huán)介導等溫擴增試劑盒及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實時定 量檢測海豚鏈球菌的環(huán)介導等溫擴增試劑盒及其應用。
【背景技術(shù)】
[0003] 魚類鏈球菌病是一種由鏈球菌感染引起的疾病，病原菌歸屬3個屬和7個種。 鏈球菌屬的病原菌有海豚鏈球菌（Streptococcusiniae)、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactme)、副乳房炎鏈球菌（Streptococcusparauberis)及停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae);乳球菌屬的有格氏乳球菌（Lactococcusgarvieae)和魚乳球菌 (Lactococcuspiscium);漫游菌屬的有鮭魚漫游菌（Vagococcussalmoninarum)。其中， 海豚鏈球菌、無乳鏈球菌、副乳房炎鏈球菌、停乳鏈球菌及格氏乳球菌為暖水魚類鏈球菌病 的病原菌，而魚乳球菌和鮭魚漫游菌屬于冷水性魚類鏈球菌病的病原菌。
[0004]目前發(fā)現(xiàn)海豚鏈球菌和無乳鏈球菌是引起多種野生魚類和經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類鏈球菌 病的最主要兩種病原。其中，由海豚鏈球菌引起的鏈球菌病在全世界范圍內(nèi)可引發(fā)多種淡 水和海水魚類大面積感染，具有很高感染率和致死率。該菌可感染包括虹鱒魚、海鯉、羅非 魚、黃獅魚、鯰魚、白花魚、鯡魚、鯔魚等在內(nèi)的17種魚類。
[0005] 鏈球菌病呈全球流行，每年給世界羅非魚產(chǎn)業(yè)造成巨額經(jīng)濟損失。在中國，2001~ 2006年羅非魚養(yǎng)殖陸續(xù)出現(xiàn)鏈球菌病，并在個別養(yǎng)殖場造成5~15%的累計死亡率。 2009~2012連續(xù)4年，該病在中國羅非魚主要養(yǎng)殖區(qū)大面積暴發(fā)流行，累計死亡率在15~ 95%之間，給我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失累計高達16億美元。如何快捷、高效、準確 地診斷海豚鏈球菌病就顯得格外重要。
[0006]目前，魚類海豚鏈球菌的檢測技術(shù)主要有常規(guī)方法和分子生物學方法。常規(guī)方法 是通過對細菌的表型特征和生化指標進行鑒定。鑒定海豚鏈球菌的生化指標主要包括：革 蘭氏染色、氧化酶實驗、過氧化氧酶實驗、CAMP實驗、V-P反應（福格斯-普利斯考爾）產(chǎn)物 實驗、凝集實驗、ELISA實驗；Lancefield氏群特異性抗原群鑒定等。但常規(guī)鑒定方法存在 操作復雜，所需時間長以及特異性不強的缺點。目前有一些自動快速細菌鑒定系統(tǒng)用于鏈 球菌鑒定，如RAPIDStrepstrip、APIrapidstrep32、API20EVitek系統(tǒng)、ATB快速檢 測系統(tǒng)等，但細菌自動鑒定儀器檢測海豚鏈球菌的結(jié)果不穩(wěn)定，且由于細菌自動化鑒定的 數(shù)據(jù)庫中模式菌株數(shù)量有限，鏈球菌的關(guān)鍵數(shù)據(jù)尚在研究中，因此該方法的應用也受到限 制。
[0007] 利用基因組16SrRNA基因開發(fā)的特異性聚合酶鏈式反應（PCR)方法常用于鑒定鏈 球菌。此外，還有利用16S-23SrDNA序列、乳酸氧化酶（lctO)和CAMP因子等對鏈球菌進 行快速PCR鑒定。另外，也建立了海豚鏈球菌的雙重PCR方法和巢式PCR方法用于檢測海 豚鏈球菌。雖然PCR方法較常規(guī)方法快速準確，但需要復雜的儀器設(shè)備，成本較高，不適合 基層和現(xiàn)場檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種為基層簡便、快捷準確地檢測魚類海豚鏈球菌的方法， 公開一種快速、可視化并可實時定量的檢測海豚鏈球菌的環(huán)介導等溫擴增試劑盒。為實現(xiàn) 本發(fā)明目的所提供的技術(shù)方案為：一種海豚鏈球菌環(huán)介導等溫擴增試劑盒，該試劑盒包括 LAMP引物、2X反應緩沖液、BstDNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和海豚鏈球菌DNA 模板，所述的LAMP引物包括外引物F3(SEQIDN0:1)與B3(SEQIDN0:2)和內(nèi)引物FIP (SEQIDNO:3)與BIP(SEQIDNO:4); 其中引物的序列分別為： F3AAGCAGATTTGGAACAAGC B3TTTAAGAGCAGGTTTTTCTTCT FIPTCTGCCAATTGTTTTTGAAGTTCAGTGCACGAGAATTAGATACGC BIPAACACAGAATTAACAGCAACTGTTGGCTTCTTTCTTAGCCGCT； 所述的 2X反應緩沖液包括Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0009] 所述的海豚鏈球菌DNA模板提取自海豚鏈球菌培養(yǎng)物，使用細菌基因組DNA提取 試劑盒提取。
[0010] 所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。
[0011]所述的 2X反應緩沖液包括Tris-HCL30-60mM、KCL25-40mM、MgS04 15-25mM、 (NH4)2S04 2 5-30mM、Tween20 0.3-0.7%、Betaine1.5-3.5M和dNTPs3-5mM，其配制方法 在pH為8. 8條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。
[0012] 一種海豚鏈球菌環(huán)介導等溫擴增試劑盒的應用，用于檢測疑似海豚鏈球菌，具體 檢測步驟包括： (1) LAMP引物的設(shè)計與合成 (2) 海豚鏈球菌DNA模板的提取 (3) LAMP反應體系建立 (4) LAMP檢測方法。
[0013] 所述LAMP反應體系建立以25iiL計， 2X反應緩沖液 12. 5yL BstDNA聚合酶 1iiL FIP 40 pmol BIP 40 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 海豚鏈球菌DNA 2uL 超純水 補足25iiL。
[0014] 所述的LAMP檢測方法檢測樣品溶液為提取的海豚鏈球菌、對照細菌以及臨床分 離菌的基因組DNA。
[0015] 所述的LAMP檢測方法采用LoopampLA-320C實時濁度儀進行密閉全程監(jiān)控，反應 溫度為63°C、反應在20-30分鐘間出現(xiàn)擴增。
[0016] 本發(fā)明的實質(zhì)性特點和顯著進步是： 1)特異性強 本發(fā)明的環(huán)介導等溫擴增試劑盒特異性檢測出海豚鏈球菌，所檢測的陰性對照病毒、 陰性對照細菌和水對照均無陽性結(jié)果出來，與PCR檢測結(jié)果一致。
[0017] 2)靈敏度高 普通的PCR檢測方法的靈敏度為1. 7X1(T6ng/yL，而使用本發(fā)明檢測方法，檢測限約 為1.7父10_81^/111，比普通？0?的靈敏度提高了將近100倍。
[0018] 3)迅速得出結(jié)果 普通的PCR整個過程在24小時左右才能得出結(jié)果，目前多數(shù)建立的LAMP反應方法在 反應結(jié)束后，須采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結(jié)果，從細菌DNA提取到獲取 試驗結(jié)果，需要5-6小時左右。本發(fā)明提供的LAMP檢測方法反應在20-30分鐘間出現(xiàn)擴 增，60分鐘內(nèi)即可完成擴增，且結(jié)果判讀方式簡便，在可見光下將陽、陰性管進行比較，通過 肉眼可明顯看到陽性反應呈明顯渾濁，陰性反應管透明；短暫離心后，陽性反應管底部有明 顯的白色焦磷酸鎂沉淀物，而陰性反應管底部無沉淀物；或加入熒光染料，陽性反應管在紫 外光下呈綠色，用肉眼便可觀察實驗結(jié)果。不需要再進行瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像 或者開蓋加入熒光染料進行來判讀結(jié)果，從細菌DNA提取到獲得最終結(jié)果可在2-3小時內(nèi) 完成。
[0019] 4)不造成污染 目前雖然已經(jīng)建立有LAMP顯色法用于檢測海豚鏈球菌，但顯色法只能是反應結(jié)束后 開蓋加入熒光染料進行顯色反應，觀察是否有顯色來判讀試驗結(jié)果，開蓋容易造成實驗室 污染。而本發(fā)明的LAMP熒光目視檢測方法，熒光染料是在反應前加入，避免開蓋造成污染， 此外，本發(fā)明的LAMP檢測方法在結(jié)果判定上，可以直接通過濁度儀檢測反應管的濁度值來 判定結(jié)果，可不進行熒光染料法檢測結(jié)果或者進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，不需要開蓋， 能有效避免污染。
[0020] 5)可實時定量 本發(fā)明利用Tubidimeterreal-timeLA-320池度儀來實時分析LAMP反應的結(jié)果，不 同的標準樣品的濃度對應的濁度值的時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可求 出各時間的海豚鏈球菌拷貝數(shù)，達到定量檢測產(chǎn)物的目的。
【附圖說明】
[0021] 圖1是本方明LAMP方法特異性檢測結(jié)果；其中1、海豚鏈球菌；2、大腸桿菌；3、嗜 水氣單胞菌；4、維氏氣單胞菌；5、鮰愛德華氏單胞菌；6、哈氏孤菌；7、創(chuàng)傷孤菌；8、無乳鏈 球菌；9、陰溝腸桿菌；10、水對照。結(jié)果顯示1株魚海豚鏈球菌反應管出現(xiàn)濁度的上升曲線， 8株陰性對照菌反應管和水對照反應均無擴增。
[0022] 圖2和圖3是本發(fā)明LAMP檢測方法及傳統(tǒng)PCR方法的敏感性檢測結(jié)果；其 中A: 1. 7X102ng/iiL;B: :1. 7X101ng/iiL;C: 1. 7X10。ng/iiL;D: 1. 7X1CT1ng/iiL; E: 1. 7X1(T2ng/iiL;F:1. 7Xl(T3ng/iiL;G: 1. 7X1(T4ng/iiL;H: 1. 7X1(T5ng/iiL; 1:1. 7X1CT6ng/iiL;J: 1. 7X1CT7ng/iiL;K: 1. 7X1CT8ng/iiL;L:water。重組質(zhì)粒pMD18-T-&i的起始濃度為1. 7X10 2ng/iiL，經(jīng)10倍倍比稀釋后進行LAMP和PCR擴增，結(jié) 果顯示LAMP法檢測限約為1. 7X10_8ng/iiL，而PCR法檢測限為1. 7X10_6ng/iiL。
[0023] 圖4是加入熒光染料檢測結(jié)果：右管為以海豚鏈球菌基因組DNA為模板的反應情 況，為陽性結(jié)果，左管為陰性對照的反應情況，為陰性對照結(jié)果。
[0024] 圖5是本發(fā)明定量檢測海豚鏈球菌LAMP方法的標準曲線；利用不同的標準樣品的 濃度對應的濁度值對時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可求出各時間的海豚