一種構(gòu)建茶樹(shù)dna指紋圖譜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜的方法，屬于茶葉分子生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 茶樹(shù)（Camelliasinensis(L. )0?Kuntze)屬山茶科山茶屬茶亞屬茶種植物，起 源于我國(guó)西南地區(qū)，經(jīng)長(zhǎng)期的引種、傳播，我國(guó)茶樹(shù)生長(zhǎng)區(qū)域從N18° 30' -35° 13'， E94° -122°，南至熱帶邊緣，北至暖溫帶。我國(guó)是茶樹(shù)的主要原產(chǎn)地，至今已有3000多年 的人工栽培歷史，經(jīng)過(guò)幾千年的人工或自然育種，形成了非常豐富的茶樹(shù)種質(zhì)資源。目前， 在國(guó)家茶樹(shù)種質(zhì)資源圃已保存近4000份茶樹(shù)種質(zhì)，各省、區(qū)地方茶樹(shù)種質(zhì)資源圃也保存大 量茶樹(shù)種質(zhì)。此外，在我國(guó)廣闊的茶山林海中還有很多未被收集保存的茶樹(shù)新種質(zhì)，其中不 乏一些優(yōu)異珍稀茶樹(shù)新種質(zhì)，這些資源中有許多優(yōu)異種質(zhì)未能被合理有效的利用。因此，將 這些種質(zhì)資源按照親緣關(guān)系、種質(zhì)品種特性、指紋圖譜差異等進(jìn)行有效分類(lèi)和鑒定，對(duì)茶樹(shù) 種質(zhì)資源的研究、品種的創(chuàng)新尤為重要。目前，分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技 術(shù)日漸成熟，已廣泛用于于多種農(nóng)作物。
[0003]DNA分子標(biāo)記以決定生物遺傳特性的基因組DNA為研究對(duì)象，一定程度代表生物 的遺傳特性，且種質(zhì)的性狀變化與其息息相關(guān)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)具有、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性強(qiáng)、多 態(tài)性高、好等優(yōu)勢(shì)，能滿足品種快速準(zhǔn)確鑒定和標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜構(gòu)建的要求。目前，DNA分子 標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于生物體的遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系鑒定、品種鑒 定、新品種選育等方面。而DNA指紋圖譜技術(shù)能反映核苷酸序列的差異，檢測(cè)出個(gè)體間的差 異，鑒定特定的基因型，能夠迅速、準(zhǔn)確地鑒別不同的種質(zhì)，應(yīng)用較廣泛。
[0004]DNA指紋圖譜是指DNA樣品用特定分子標(biāo)記技術(shù)處理顯示出具有特定DNA片段的 總稱(chēng)。DNA指紋圖譜技術(shù)最早用于在刑偵或親子鑒定上確定人的身份，而后隨著生物技術(shù)的 進(jìn)步與發(fā)展，DNA指紋圖譜技術(shù)在很多植物上得到廣泛的應(yīng)用。目前，常用于構(gòu)建DNA指紋 圖譜的分子標(biāo)記有SSR、AFLP、SRAP、SCoT、RAPD、SNP以及ISSR。不同分子標(biāo)記構(gòu)建的DNA 指紋圖譜各有其特點(diǎn)。其中，以ISSR、SSR、SRAP應(yīng)用最廣泛，RAH)作為早期分子標(biāo)記，也有 一定的應(yīng)用。SNP、SC〇T標(biāo)記作為第三代分子標(biāo)記，目前應(yīng)用不廣泛，技術(shù)不夠成熟，且與其 他2種標(biāo)記相比，技術(shù)難度較高，以該技術(shù)為主構(gòu)建DNA指紋圖譜的應(yīng)用較少。而SRAP分子 標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)操作較為繁瑣，且所用試劑毒副作用較大，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員影響較大。 ISSR是當(dāng)前能夠用于大批量種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和DNA指紋圖譜構(gòu)建最理想的一 種分子標(biāo)記。應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建DNA指紋圖譜，在不同植物上都能取得很好的效果。 具有引物用量少、特征標(biāo)記多、有效信息量大的優(yōu)點(diǎn)。
[0005]目前，DNA指紋圖譜的在茶樹(shù)上的研究不多，以ISSR分子標(biāo)記技術(shù)和二維碼技術(shù) 構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜的研究未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明在于提供一種構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜的方法，通過(guò)該方法構(gòu)建茶樹(shù)DNA指 紋圖譜以二維碼圖形的形式體現(xiàn)，具有信息容量大、直觀、簡(jiǎn)潔、應(yīng)用性廣的特點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)和二維碼技術(shù)構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜，將指紋圖譜 信息通過(guò)二維碼技術(shù)處理，轉(zhuǎn)化成二維碼圖形。
[0008] 具體實(shí)施如下： 采用改良CTAB法提取供試茶樹(shù)品種的總DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和純 度，并將DNA樣本稀釋至100ng/uL，利用優(yōu)化后的ISSR反應(yīng)體系和篩選的引物對(duì)茶樹(shù)DNA 樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分離ISSR分子標(biāo)記，拍攝電泳圖片。 根據(jù)ISSR圖譜條帶的有無(wú)，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將電泳圖譜轉(zhuǎn)換成"0-1"形式 的原始字符串。利用二維碼技術(shù)處理原始字符串，通過(guò)在一個(gè)矩形空間通過(guò)黑、白像素在矩 陣中的不同分布進(jìn)行編碼，將原始字符串轉(zhuǎn)化成為二維碼圖形。
[0009] 所述對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，是根據(jù)ISSR圖譜條帶的有無(wú)，利用人工方 法統(tǒng)計(jì)讀帶，將電泳圖上穩(wěn)定出現(xiàn)的條帶，無(wú)論強(qiáng)弱均賦值為"1"，同一位置無(wú)條帶賦值為 "〇"，輸入讀帶數(shù)據(jù)，建立原始字符串。
[0010]優(yōu)化后的ISSR反應(yīng)體系為：在 20i! L體系中，Ex-Buffer用 1XEx-Buffer，1U/ML Ex-Taq酶，0.2mM/MLdNTPs，0.5mM/MLISSR引物，2ng/MLDNA模板。篩選的引物如SEQID NO. 1-12 所示。
[0011] 構(gòu)建的茶樹(shù)DNA指紋圖譜可通過(guò)圖象輸入設(shè)備或光電掃描設(shè)備自動(dòng)識(shí)讀以實(shí)現(xiàn) 信息自動(dòng)處理，通過(guò)掃描二維碼圖形便可知該茶樹(shù)品種的指紋信息，從而鑒別不同的茶樹(shù) 品種。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： 在構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜過(guò)程中進(jìn)行通過(guò)二維碼技術(shù)處理，將大量的指紋圖譜信息， 轉(zhuǎn)化成二維碼圖形。構(gòu)建的DNA指紋圖譜既能正確反應(yīng)該茶樹(shù)樣本的DNA指紋圖譜信息， 又能在茶葉的市場(chǎng)流通、栽培管理等領(lǐng)域進(jìn)一步推廣利用，并且應(yīng)用于可追溯體系建設(shè)和 管理。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為以表一所示12條引物對(duì)黃金桂進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng) 計(jì)分析，形成原始指紋信息字符串，并以其原始指紋信息字符串構(gòu)建的DNA指紋圖譜。
[0014] 圖2為以引物UBC834對(duì)48份不同武夷山地方茶樹(shù)種質(zhì)進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增所得 的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1 1、茶樹(shù)總DNA提取 利用改良后的CTAB法提取供試茶樹(shù)總DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度，通過(guò)微 量核酸測(cè)定儀檢測(cè)供試DNA樣本在260nm、280nm的吸光值，260/280比值，260/230比值， 以及樣品濃度值，選擇純度好、濃度高的DNA樣本稀釋至100ng/uL。
[0016] 2、ISSR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選 采用單因子分析的方法，分別在特定的反應(yīng)體系和擴(kuò)展程序下以初始的反應(yīng)體系為基 礎(chǔ)，做不同參數(shù)梯度的比較分析，對(duì)PCR反應(yīng)的DNA模板使用量、反應(yīng)引物濃度、Ex-Tag酶用 量、dNTP濃度、Ex-Buffer濃度、引物退火溫度以及反應(yīng)引物等各參數(shù)逐一進(jìn)行篩選調(diào)整， 優(yōu)化建立ISSR反應(yīng)體系。優(yōu)化后的ISSR-PCR反應(yīng)體系為：在20iiL體系中，Ex-Buffer用 lXEx-Buffer，lU/MLEx-Taq酶，0.2mM/MLdNTPs，0.5mM/MLISSR引物，2ng/MLDNA模板能 較好的進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。利用上述體系篩選出條帶清晰，多態(tài)性好的引物，引物序列信 息及退火溫度（Tm)如表1所示。優(yōu)化后的ISSR反應(yīng)體系和篩選的引物可同時(shí)擴(kuò)增山茶科 山茶屬茶種植物。
[0017] 表1篩選出的12條引物
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜的方法，其特征在于：采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)和二維碼 技術(shù)構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜，將指紋圖譜信息通過(guò)二維碼技術(shù)處理，轉(zhuǎn)化成二維碼圖形。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜的方法，其特征在于：所述方法具體 實(shí)施如下： 采用改良CTAB法提取供試茶樹(shù)品種的總DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和純 度，并將DNA樣本稀釋至100 ng/uL，利用優(yōu)化后的ISSR反應(yīng)體系和篩選的引物對(duì)茶樹(shù)DNA 樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分離ISSR分子標(biāo)記，拍攝電泳圖片； 根據(jù)ISSR圖譜條帶的有無(wú)，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將電泳圖譜轉(zhuǎn)換成"0-1"形式 的原始字符串，利用二維碼技術(shù)處理原始字符串，將原始字符串轉(zhuǎn)化成為二維碼圖形。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜的方法，其特征在于：所述對(duì)PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，是根據(jù)ISSR圖譜條帶的有無(wú)，利用人工方法統(tǒng)計(jì)讀帶，將電泳圖上 穩(wěn)定出現(xiàn)的條帶，無(wú)論強(qiáng)弱均賦值為" 1"，同一位置無(wú)條帶賦值為"〇"，輸入讀帶數(shù)據(jù)，建 立原始字符串。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜的方法，其特征在于：優(yōu)化后的ISSR 反應(yīng)體系為：在 20 yL 體系中，Ex-Buffer 用 IXEx-Buf fer，lU/^L Ex-Taq 酶，0.2mM/>L dNTPs，0· 5mM/^L ISSR 引物，2ng/^L DNA 模板。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜的方法，其特征在于：篩選的引物如 SEQ ID NO. 1-12 所示。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜的方法，屬于茶葉分子生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)和二維碼技術(shù)構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜，將指紋圖譜信息通過(guò)二維碼技術(shù)處理，轉(zhuǎn)化成二維碼圖形。通過(guò)該方法構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜以二維碼圖形的形式體現(xiàn)，具有信息容量大、直觀、簡(jiǎn)潔、應(yīng)用性廣的特點(diǎn)。在構(gòu)建茶樹(shù)DNA指紋圖譜過(guò)程中進(jìn)行通過(guò)二維碼技術(shù)處理，將大量的指紋圖譜信息，轉(zhuǎn)化成二維碼圖形。構(gòu)建的DNA指紋圖譜既能正確反應(yīng)該茶樹(shù)樣本的DNA指紋圖譜信息，又能在茶葉的市場(chǎng)流通、栽培管理等領(lǐng)域進(jìn)一步推廣利用，并且應(yīng)用于可追溯體系建設(shè)和管理。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104651515
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510089500
【發(fā)明人】孫威江, 林志坤, 陳志丹
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年2月27日