用于檢測釀膿鏈球菌的lamp試劑盒及其專用引物的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，設及細菌的分子生物學，特別是設及一種釀脈鏈球菌 的LAMP試劑盒及其專用引物與其在檢測釀脈鏈球菌中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 釀脈鏈球菌臨床感染及治療現(xiàn)狀
[0003] 釀脈鏈球菌（Streptococ州S pyogenes)，即 A群鏈球菌（Group A streptococ州S， GAS,是根據(jù)抗原構(gòu)造不同定義為A群），e溶血（是指能夠完全使綿羊血細胞瓊脂溶血）， 是人體的重要致病菌之一，可W引起很多種疾病，引起的感染性疾病主要有急性咽炎、急性 扁桃體炎，也可致肺部感染、猩紅熱、皮膚軟組織感染，并可致全身性感染。釀脈鏈球菌也是 引起變態(tài)反應性疾病風濕熱和急性腎小球腎炎的間接原因。近年來，A群鏈球菌常引起嚴 重的感染，由侵襲性A群鏈球菌（invasive group A str巧tococ州S infections)引發(fā)的 疾病的發(fā)病率增長，使人們對該類細菌感染更加關注。
[0004] 釀脈鏈球菌可侵襲任何年齡的人，但發(fā)病者多為兒童。正常人鼻咽部、皮膚可帶 菌，并有由肛n、陰道帶菌引起暴發(fā)流行的報告。呼吸道與直接接觸均可傳播。亦有進食被 污染食物引起咽峽炎暴發(fā)的報道。生活貧困、衛(wèi)生條件差、居住擁擠、密切接觸等均有助于 釀脈鏈球菌感染的發(fā)生。
[0005] 目前，釀脈鏈球菌感染的治療藥物首選青霉素，但應考慮到可能有耐藥菌株，應加 大劑量或改用它藥，如紅霉素、克林霉素、第一代、二代頭抱類抗生素等。最好參照當?shù)厮幟?結(jié)果選用。
[0006] 檢測釀脈鏈球菌的方法主要是傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定、血清學分析等，存在耗時和結(jié)果 不易判定等缺點。因此，快速、準確檢測病原菌，予W規(guī)范合理的抗生素治療，是控制釀脈鏈 球菌感染的有效措施。
[0007] LAMP技術(shù)介紹
[0008] 環(huán)介導恒溫核酸擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 由 Notomi(Notomi T，et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000:28(12) :63.)發(fā)明的一種新型基因擴增技術(shù)。具體方法是針對祀基因 值NA或者cDNA)的6個區(qū)域，設計4-6種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件下 可W高效、快速、高特異地擴增祀序列，結(jié)果直接靠擴增副產(chǎn)物焦磯酸儀的沉淀濁度進行判 斷。LAMP技術(shù)具有快速高效、特異性強、靈敏度高、操作簡單、檢測直觀和設備要求低等特 點。
[0009] 自2000年發(fā)明W來，LAMP技術(shù)已被迅速用于病原微生物檢測、遺傳病診斷、 食品安全等領域的分子生物學檢測領域。近年來，國外已將該技術(shù)廣泛應用于病原體 檢測J。Masaki Imai 等人（Imai M，Ninomiya A, Minekawa H，et al. Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza HShemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method. J Virol Methods. 2007 ; 141(2) : 173-80.)利用LAMP建立了禽流感病毒的實驗室確診體 系；Nobuyuki Hayashi 等人化ayashi N，Arai R，Tada S，Taguchi H, Ogawa Y. Detection and identification of Brettanomyces/Dekkera sp. yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method.化〇(1 Microbiol. 2007 ;24(7-8):778-85.)針對四種 香酒酵母的ITS序列設計了 LAMP特異性引物，建立了高效的LAMP檢測體系。LAMP還可W 檢測其它與人類相關的病毒，如病毒性出血性敗血?。╒服)、巨細胞病毒（CMV)、埃博拉病 毒巧B0V)、慢性伯基特淋己瘤病毒巧BV)、虹彩病毒、人類瘡疹病毒8型、造血組織壞死病毒 (工HHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黃化曲葉病毒等。目前，國內(nèi)外均未見有用于檢測釀脈鏈球 菌的LAMP試劑盒及其專用引物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供了用于對釀脈鏈球菌進行LAMP檢測的引物，W實現(xiàn)釀脈鏈球菌的批 量檢測，提高檢測的特異性和靈敏度。
[0011] 本發(fā)明所提供的用于檢測釀脈鏈球菌的LAMP引物，是根據(jù)釀脈鏈球菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控 基因（the putative transcriptional regulator gene) spyl258 的特異性保守勒1序列設 計的，用W定性檢測純菌、疲液、腦脊液及其它分泌物等樣品中的釀脈鏈球菌，所述LAMP引 物由五條引物組成，包括外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP、化及環(huán)引物LF的組合；所述釀 脈鏈球菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因spyl258的特異性保守祀序列如序列表中SEQ ID NO ;1所示。
[0012] 具體來講，所述用于對釀脈鏈球菌進行LAMP檢測的五條引物的核巧酸序列如序 列表中 SEQ ID N0;2(F3)、SEQ ID N0;3 炬3)、SEQ ID N0;4(FIP)、SEQ ID N0;5 炬I巧和 SEQ ID NO ;6 (L巧所示。
[0013] 所述的LAMP引物，為FIP和BIP、F3和B3、W及LF按摩爾比 40:5:20 的組合物。
[0014] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于對釀脈鏈球菌進行LAMP檢測的試劑盒。
[0015] 本發(fā)明所提供的試劑盒，包括上述用于對釀脈鏈球菌進行LAMP檢測的引物。
[0016] 具體來講，所述試劑盒包括W下用于25 y 1反應體系的試劑；20mM Tris ?肥1(抑8. 8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4,〇. 1% Tween20,0. 8M 甜菜堿（betaine)，8mM M拆〇4，1.4mM dNTP each, 8U Bst DM polymerase,引物加入量為；40pmol 引物 FIP 和 BIP， 5pmol 引物 F3 和 B3,20pmol 引物 LF。
[0017] 為方便檢測，所述試劑盒中還可包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為釀脈 鏈球菌標準株基因組DNA，所述陰性對照為不含DNA的LAMP擴增體系，如雙蒸水。
[001引上述LAMP引物或試劑盒在釀脈鏈球菌LAMP檢測中的應用也屬于本發(fā)明的保護范 圍。
[0019] 本發(fā)明的第S個目的是提供一種釀脈鏈球菌的LAMP檢測方法。
[0020] 本發(fā)明所提供檢測方法，可包括W下步驟：
[002U 1) W待測樣品基因組DM為模板，在上述引物的引導下進行LAMP擴增，25 LAMP反應體系包括：待測樣品基因組DM 2yl，20mM Tris ?肥1(抑8. 8)，10mM KC1， 10mM(NH4)2S04,0. l%Tween20,0. 8M 甜菜堿化etaine)，8mM MgS04，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase,引物加入量為；40pmol 引物 FIP 和 BIP，5pmol 引物 F3 和 B3,20pmol 引物 LF ;LAMP擴增條件為；置60-65°C恒溫45-55min ;
[0022] 2)反應結(jié)束后進行結(jié)果判定；在反應液中添加巧黃綠素指示劑，根據(jù)反應液的顏 色變化判斷結(jié)果，綠色表示待測樣品中存在釀脈鏈球菌，澄色表示待測樣品中不存在釀脈 鏈球菌；或者不添加巧黃綠素指示劑直接用濁度儀檢測反應前后反應液的濁度變化來判斷 結(jié)果，濁度上升表示待測樣品中存在釀脈鏈球菌，濁度無變化表示待測樣品中不存在釀脈 鏈球菌。
[0023] 在上述檢測方法中，所述步驟1)中的LAMP反應體系中還設有陽性對照和陰性對 照，所述陽性對照為釀脈鏈球菌標準株基因組DNA，所述陰性對照為不含DNA的LAMP擴增體 系，如雙蒸水；所述LAMP擴增條件優(yōu)選為：置63°C恒溫50min。
[0024] 所述步驟2)中巧黃綠素指示劑的添加量可為1 y 1 (終反應體系為26 y 1)，含有 0. 5mM巧黃綠素和lOmM氯化車孟。
[0025] 本發(fā)明提供了一種釀脈鏈球菌的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒。本發(fā)明 檢測的釀脈鏈球菌原理是采用LAMP技術(shù)，對釀脈鏈球菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因spyl258的特異性保 守祀序列進行檢測。spy