專利名稱：一種革蘭氏陽(yáng)性菌dna疫苗及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種革蘭氏陽(yáng)性菌DNA疫苗及其構(gòu)建和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
海豚鏈球菌(Str印tococcus iniae)是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，能夠感染人、動(dòng)物和多 種魚(yú)類，包括羅非魚(yú)、真鯛、牙鲆、鱸魚(yú)、虹鱒、大菱鲆、條石斑等。海豚鏈球菌已被公認(rèn)為一 種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌，每年給我國(guó)以及世界養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，商業(yè)化 海豚鏈球菌疫苗只有簡(jiǎn)單的滅活疫苗，這種疫苗在以色列的使用已證明其具有各種缺點(diǎn)， 包括保護(hù)效應(yīng)短并具有區(qū)域性等。不同于簡(jiǎn)單的滅活疫苗，DNA疫苗是一種分子疫苗，其構(gòu) 建原理是用將疫苗抗原基因克隆于真核表達(dá)載體，隨后將攜帶疫苗抗原的表達(dá)載體導(dǎo)入所 要免疫的動(dòng)物；隨著疫苗載體進(jìn)入宿主動(dòng)物細(xì)胞，疫苗抗原在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、合成并刺激 機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而誘發(fā)一系列保護(hù)性免疫應(yīng)答。研究表明，滅活疫苗主要誘發(fā)以抗體為 主的體液免疫，而DNA疫苗則既能誘發(fā)體液免疫也能誘發(fā)細(xì)胞免疫，并且其免疫效應(yīng)可以 很長(zhǎng)。另外，DNA疫苗具有穩(wěn)定、應(yīng)用簡(jiǎn)單、可以長(zhǎng)期儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)，因而是一種具有良好應(yīng)用 和發(fā)展前景的疫苗形式。目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，針對(duì)細(xì)菌的DNA疫苗很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種革蘭氏陽(yáng)性菌DNA疫苗及其構(gòu)建和應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種革蘭氏陽(yáng)性菌DNA疫苗疫苗序列表由SEQ ID No. 1中的堿基序列所示。構(gòu)建以海豚鏈球菌G26為模板，用引物F4和R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與載 體pBS-T連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α而后在含有100Ug/ml安卡青霉素(Ap)、 40ug/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(Xgal)和24ug/ml異丙基-β -D-硫代半乳 糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒；所得質(zhì)粒用SmaI酶切， 回收0. 5kb片段，同時(shí)將質(zhì)粒pCN3用SmaI酶切回收5. 5kb片段，將上述回收的兩片段用 T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后在含有Ap(100ug/ml) 的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為含有序列表SEQ ID No. 1中 的堿基序列的DNA疫苗質(zhì)粒pCNSlO ；所述引物F4為5，-CCCGGGCCACCATGGCAGAATTTAATCAA TCAAA-3' ；R2 為 5’ -CTCGAGCCCGGGGATATGAATATAATTATATGAGCT-3，。應(yīng)用所述DNA疫苗對(duì)海豚鏈球菌具有免疫保護(hù)作用。所述DNA疫苗使牙鲆對(duì)海 豚鏈球菌具有免疫保護(hù)作用。所述將DNA疫苗質(zhì)粒溶于PBS至濃度為200ug/ml，DNA疫苗 懸液以100-120ul的劑量對(duì)魚(yú)類進(jìn)行肌肉注射。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.高保護(hù)率。本發(fā)明的疫苗對(duì)海豚鏈球菌的免疫保護(hù)效率達(dá)86%以上。2.長(zhǎng)效。本發(fā)明的疫苗在免疫后兩個(gè)月的保護(hù)效率仍然可達(dá)86.7%。
3.安全。本發(fā)明的疫苗沒(méi)有任何細(xì)胞毒性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而 非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相 應(yīng)試劑盒。2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrookand Russell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購(gòu)自于“北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司”。
實(shí)施例1DNA疫苗由序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列所示。序列表1ATGAAAAAAATCGCAACTATTACTACATTAACAGCAGGCATTGGCGCTGCATATTTCGGTACAACTGCT CATCACGCAGATGCTGCAGAATTTAATCAATCAAATAATCAATCATATAATTATAATACAGCTCAAACATCTACTAGCAA TACTACATCAGAAAGATCTGCTTCTGGTAACTTATATACAGCTGGTCAATGTACTTGGTACGTTTATGACAAAGTTGGCG GAAAAGTAGGCTCAACTTGGGGAGACGCTAGAAACTGGGCATCAGCTGCACAACAAGCTGGTTATACAGTCAATCATACA CCAAAAGCTGGATCAATTTTACAATCATCAGCAGGTGGTTATGGTCACGTTGCTTATGTTGAAAGTGTTGGTTCTGACGG TTCAGTTACAGTTTCTGAAATGAACTATAGCGGTGGACCTTTCTCAGTAAGCACACGTACTATTTCTGCAGGTGAAGCAA GCTCATATAATTATATTCATATCTAA(a)序列特征 長(zhǎng)度495bp 類型堿基序列 鏈型單鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型雙鏈DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源海豚鏈球菌G26(f)特異性名稱SiGHlO實(shí)施例2
海豚鏈球菌DNA疫苗的構(gòu)建方法以海豚鏈球菌G26為模板，采用F4/R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94°C 60s 預(yù)變性模板 DNA，然后 94°C 40s, 47 °C 60s, 72 °C 60s，5 個(gè)循環(huán)后改為 94°C 40s, 65 °C 60s， 72°C 60s，25個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)lOmin。PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒 純化后與PCR克隆載體pBS-T (購(gòu)自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室溫連接2-4 小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)、40ug/ml 5_溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷(Xgal)和24ug/ml異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBSSlO。將pBSSlO 用SmaI酶切回收0. 5kb片段，同時(shí)將質(zhì)粒pCN3用SmaI酶切回收5. 5kb片段(所述質(zhì)粒 pCN3 Jiao X, Zhang Μ, Hu Y, Sun L. Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiellatarda antigens. Vaccine. 2009 ；27 5195-5202)；將上 述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含 有Ap(100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為pCNSlO。 將pCNSlO用引物CNFl (5，-TGCGTTTCTGATAGGCACCTAT-3，)測(cè)序，結(jié)果表明其含有序列表 SEQ ID No. 1中的疫苗堿基序列。所述LB組成成分按重量百分比計(jì)1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 %氯化鈉， 97. 5%蒸餾水；所述菌株G26保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC No. 1984，分類命名為海豚鏈球菌(Sti^ptococcus iniae)。
所述弓丨物 F4 為 5，-CCCGGGCCACCATGGCAGAATTTAATCAATCAAA-3，和 R2 為 5，-CTCGA GCCCGGGGATATGAATATAATTATATGAGCT-3’。實(shí)施例3海豚鏈球菌DNA疫苗的應(yīng)用步驟1)疫苗制備液的制備。將上述所得質(zhì)粒pCNSlO懸浮于PBS中至終濃度為 200ug/ml,即為DNA疫苗制備液。所述PBS組成成分按重量百分比計(jì)0. 8 % NaCl,0. 02 % KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2P04。步驟2)疫苗的免疫注射。將50條牙鲆(每條重約9g)隨機(jī)分為2組(25條/ 組)，分別命名為A和B。將A組(免疫組)的每條魚(yú)肌肉注射IOOul上述步驟1)的DNA 疫苗制備液，將B組(對(duì)照組)的每條魚(yú)肌肉注射IOOul PBS0步驟3)海豚鏈球菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)海豚鏈球菌G26至0D_為 0. 7，然后以5000g，4°C離心lOmin。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為2 X 108cfu/ml， 即為海豚鏈球菌懸液。步驟4)疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng)檢測(cè)。在步驟2)免疫注射后的第60天，用上述步驟 3)的海豚鏈球菌懸液腹腔注射步驟2)的A和B組魚(yú)，每條魚(yú)的注射量為lOOul。在以后 的20天中，每天觀察并記錄各組魚(yú)的死亡情況。20天后，統(tǒng)計(jì)各組魚(yú)的總死亡數(shù)目A組， 2條；B組，15條。利用下列公式計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)效率(RPS)RPS = 100X (1_免疫組魚(yú)的總死亡百分比/對(duì)照組魚(yú)的總死亡百分比)據(jù)此算出DNA疫苗針對(duì)海豚鏈球菌的免疫保護(hù)效率為86. 7%。故本發(fā)明的DNA疫苗能夠高效并較長(zhǎng)期性地保護(hù)牙鲆抵御海豚鏈球菌感染。
權(quán)利要求
一種革蘭氏陽(yáng)性菌DNA疫苗，其特征在于疫苗序列表由SEQ IDNo.1中的堿基序列所示。
2.一種按權(quán)利要求1所述的革蘭氏陽(yáng)性菌DNA疫苗的構(gòu)建，其特征在于以海豚鏈球菌G26為模板，用引物F4和R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pBS_T連 接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α而后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)、40ug/ml 5_溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷(Xgal)和24ug/ml異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒；所得質(zhì)粒用SmaI酶切，回收0. 5kb片 段，同時(shí)將質(zhì)粒PCN3用SmaI酶切回收5. 5kb片段，將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于 室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后在含有Ap (100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基 上培養(yǎng)24小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為含有序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列的DNA 疫苗質(zhì)粒pCNSlO ；所述引物 F4 為 5’ -CCCGGGCCACCATGGCAGAATTTAATCAATCAAA-3，；R2 為 5’ -CTCGAGCCCG GGGATATGAATATAATTATATGAGCT-3’。
3.一種按按權(quán)利要求1所述的革蘭氏陽(yáng)性菌DNA疫苗的應(yīng)用，其特征在于所述DNA疫 苗對(duì)海豚鏈球菌具有免疫保護(hù)作用。
4.按權(quán)利要求3所述的革蘭氏陽(yáng)性菌DNA疫苗的應(yīng)用，其特征在于所述DNA疫苗使 牙鲆對(duì)海豚鏈球菌具有免疫保護(hù)作用。
5.按權(quán)利要求3所述的革蘭氏陽(yáng)性菌DNA疫苗的應(yīng)用，其特征在于所述將DNA疫苗 質(zhì)粒溶于PBS至濃度為200ug/ml，DNA疫苗懸液以100_120ul的劑量對(duì)魚(yú)類進(jìn)行肌肉注射。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種革蘭氏陽(yáng)性菌DNA疫苗及其構(gòu)建和應(yīng)用。所述疫苗具序列表SEQ ID No.1中的堿基序列。其制備方法利用真核表達(dá)載體pCN3構(gòu)建海豚鏈球菌DNA疫苗質(zhì)粒pCNS10，后者懸浮于PBS中即可作為DNA疫苗。DNA疫苗對(duì)海豚鏈球菌具有免疫保護(hù)作用。本發(fā)明所得對(duì)海豚鏈球菌具有免疫保護(hù)作用的DNA疫苗為國(guó)際上首次構(gòu)建，其應(yīng)用簡(jiǎn)單，一次免疫即可達(dá)到高效和長(zhǎng)期的免疫保護(hù)效果。
文檔編號(hào)A61P31/04GK101837133SQ20101015185
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者孫云, 孫黎 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所