A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡及其制備方法，旨在提供一種檢測方法簡便，靈敏度高且檢測結(jié)果可靠的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡；該檢測試劑卡，包括帶盒蓋的盒體(6)，盒體(6)內(nèi)設(shè)有檢測試紙，所述的檢測試紙包括底板(1)，底板(1)上依次銜接有樣品墊(2)、抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊(3)、包被膜(4)和吸水墊(5)，所述的包被膜(4)上設(shè)有一條A族鏈球菌抗體檢測區(qū)T線和一條羊抗兔多克隆抗體質(zhì)控區(qū)C線，兩條線平行排列；屬于熒光免疫檢測領(lǐng)域。
【專利說明】A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種檢測試劑卡，具體的說是，一種測定咽部拭子中A族鏈球菌的檢測試劑卡，本發(fā)明還公開了該檢測試劑卡的制備方法，屬于熒光免疫檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]小兒上呼吸道感染的常見病原體之一，在呼吸道感染患兒中A族鏈球菌陽性率約為23.2%。如不及時(shí)接受抗感染治療，包括急性咽炎、膿胞病、中毒性休克綜合征、侵襲性筋膜炎、猩紅熱、肺炎、丹毒和A族鏈球菌感染后引起的變態(tài)反應(yīng)性疾病，如急性風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病、急性腎小球腎炎。目前普遍的A族鏈球菌鑒定方法主要有臨床經(jīng)驗(yàn)甄別、細(xì)菌培養(yǎng)法。
[0003]根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)診斷A族鏈球菌的準(zhǔn)確率偏低，據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，即使經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生診斷的準(zhǔn)確率也只有45% -75%。細(xì)菌培養(yǎng)法是A族鏈球菌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，該方法是將采取的咽拭子接種于血瓊脂平板上孵育24?48h，10% CO2或厭氧條件下可增加A族鏈球菌的分離率，最終采取血清學(xué)方法鑒別A族鏈球菌與其他β溶血性鏈球菌，特別是C族和G族，但是需要的時(shí)間較長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、診斷迅速、檢檢測結(jié)果可靠的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的前一技術(shù)方案如下:該A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡，包括帶盒蓋的盒體,盒體內(nèi)設(shè)有檢測試紙,所述的檢測試紙包括底板，底板上依次銜接有樣品墊、抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊、包被膜和吸水墊，所述的包被膜上設(shè)有一條A族鏈球菌抗體檢測區(qū)T線和一條羊抗兔多克隆抗體質(zhì)控區(qū)C線，兩條線平行排列。
[0006]上述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡，所述的盒體的盒蓋上設(shè)有加樣孔和結(jié)果觀察窗口。
[0007]上述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡，所述的包被膜兩端分別與吸水墊和抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊相互交疊連接,在抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊上壓貼有樣品墊。
[0008]進(jìn)一步的，上述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡，所述的樣品墊為玻璃纖維樣品墊。
[0009]進(jìn)一步的，上述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡，所述的包被膜為硝酸纖維素膜。
[0010]進(jìn)一步的,上述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡,所述的抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊為含量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的聚酯纖維素膜。
[0011]本發(fā)明的后一技術(shù)方案是提供該檢測卡的制備方法，該方法依次包括下述步驟:在底板上依次銜接有樣品墊、抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊、包被膜和吸水墊:
[0012]其中:
[0013]I)樣品墊的制備方法是:
[0014]將樣品墊用樣品墊緩沖液浸泡20~30分鐘，干燥；
[0015]2)抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊的制備方法是:
[0016]①用量子點(diǎn)緩沖液將水溶性羧基量子點(diǎn)QD525稀釋至I μ M ;
[0017]②取ImLlyM的量子點(diǎn)，加入30 μ L的1-(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸溶液，室溫反應(yīng)I~2小時(shí)，用30kDa的超濾管超濾，除去未反應(yīng)的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸，吸取超濾管內(nèi)剩余液體，加入IOmM的硼酸緩沖液恢復(fù)為體積至ImL ；
[0018]③將抗A族鏈球菌抗體加入IOOkDa的超濾管中，用硼酸緩沖液調(diào)整抗體含量為4mg/mL,按200 μ g/lmL的量，將步驟B)中的抗體加入到步驟A)中的量子點(diǎn)溶液中，室溫反應(yīng)I~2小時(shí)；
[0019]④按10 μ L/lmL的量，向步驟C)中加入甘氨酸，封閉未偶聯(lián)抗體的活化羧基位點(diǎn)，反應(yīng)30~60min ；
[0020]⑤將步驟D)偶聯(lián)抗 體的量子點(diǎn)溶液加入到的超濾管中，加入Tris-HCl溶液置換量子點(diǎn)緩沖液，重復(fù)3~5次，吸取超濾管內(nèi)剩余液體，加入Tris-HCl至終體積為100 μ L，離心分離，取上清，并加入抗體保存液；
[0021]⑥將上述所得的溶液用噴金劃膜儀噴至聚酯纖維素膜上，噴量為I~5μ L/cm，干燥；
[0022]3)包被膜的制備方法是:
[0023]①將羊抗兔抗體用0.02M磷酸鹽緩沖液稀釋0.5~2mg/mL，加入3%的甲醇，即為質(zhì)控區(qū)工作液；
[0024]②將抗A族鏈球菌抗體用0.02M磷酸鹽緩沖液稀釋至0.8~1.5mg/mL,加入3 %的甲醇，即為檢測區(qū)工作液；
[0025]③將步驟①、步驟②)所得的溶液，用噴金劃膜儀以0.8-1.2 μ L/cm包被到硝酸纖維膜上，檢測區(qū)與質(zhì)控區(qū)間距為0.4-0.7cm，位于硝酸纖維素膜中間位置，將硝酸纖維膜放入37°C烘箱中，干燥即可。
[0026]進(jìn)一步的，上述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡的制備方法，步驟①所述的量子點(diǎn)緩沖液為PH8.4的硼酸鹽緩沖液。
[0027]進(jìn)一步的，上述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡的制備方法，所述的樣品墊緩沖液為含0.5~5wt% BSA、0.5~5wt %聚乙烯吡咯烷酮、0.5~5wt%聚乙二醇、
0.1~5?七％吐溫-20、I~5wt%曲拉通-100的0.01M磷酸鹽緩沖液。
[0028]進(jìn)一步的，上述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡的制備方法，所述的抗體保存液為含lwt% BSA,20wt%鹿糖，10wt%海藻糖，0.1wt %吐溫-20,0.lwt%聚乙烯批咯烷酮的0.05M Tris-HCl緩沖液。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0030]本發(fā)明提供的技術(shù)方案，利用兩種抗體的特異結(jié)合反應(yīng)，形成特異的“三明治”結(jié)構(gòu)，即“抗體-抗原-抗體”免疫復(fù)合物，結(jié)合免疫層析技術(shù)，應(yīng)用熒光免疫層析法檢測A族鏈球菌抗原，并與熒光試劑卡讀卡儀相配合，大幅度提高A族鏈球菌的檢出率。
[0031]本方法操作簡單，診斷迅速，特異性強(qiáng)，靈敏度高，易儲存，無須專門的操作人員，只需簡單的儀器設(shè)備，即可得出結(jié)果。這樣有利于醫(yī)護(hù)人員抓住最佳治療時(shí)間，避免抗生素的濫用，同時(shí)降低A族鏈球菌變態(tài)反應(yīng)發(fā)生的幾率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1是本發(fā)明提供的檢測試劑卡結(jié)構(gòu)示意圖；
[0033]圖2是本發(fā)明提供的檢測試劑卡的盒蓋俯視圖；
[0034]圖3是本發(fā)明提供的檢測試紙結(jié)構(gòu)示意圖；
[0035]圖4是本發(fā)明提供的檢測試紙俯視圖；
[0036]圖5是本發(fā)明提供的檢測卡判定結(jié)果為陰性時(shí)示意圖；
[0037]圖6是本發(fā)明提供的檢測卡判定結(jié)果為陽性時(shí)示意圖。
[0038]其中:底板1，樣品墊2，抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊3，包被膜4，吸水墊5，A族鏈球菌抗體檢測區(qū)T線，羊抗兔多克隆抗體質(zhì)控區(qū)C線，盒體6，盒蓋61，加樣孔71，結(jié)果觀察窗口 72。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合具體實(shí)施例的方式對本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0040]實(shí)施例1
[0041]本發(fā)明提供的一種A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡，參閱圖1至圖4，所述的檢測試劑卡包括帶盒蓋61的盒體6，為了方便加樣和觀察檢測結(jié)果，所述的盒蓋61上設(shè)有加樣孔71和結(jié)果觀察窗口 72。
[0042]盒體6內(nèi)設(shè)有檢測試紙，所述的檢測試紙包括底板1，所述的底板I為PVC板，在底板I上依次銜接有樣品墊2、抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊3、包被膜4和吸水墊5，在包被膜4上設(shè)有一條A族鏈球菌抗體檢測區(qū)T線和一條羊抗兔多克隆抗體質(zhì)控區(qū)C線，兩條線平行排列。為了達(dá)到快速、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，所述的樣品墊2優(yōu)選玻璃纖維樣品墊；所述的包被膜4優(yōu)選硝酸纖維素膜；所述的抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊3為聚酯纖維素膜。
[0043]更具體的說，所述的包被膜4壓貼在底板I中間部位，包被膜4的兩端分別與吸水墊5和抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊3相互交疊連接,在抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊3上壓貼有樣品墊2。
[0044]樣品墊2壓在抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊3的1/3?1/4左右,抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊3壓在包被膜的1_處，A族鏈球菌抗體檢測區(qū)T線距離包被膜4左端IOmm,羊抗兔多克隆抗體質(zhì)控區(qū)C線距離包被膜4右端10mm, C、T線間距4?7mm(優(yōu)選5mm),吸水墊壓在包被膜I?2.5mm(優(yōu)選2mm)處。
[0045]本發(fā)明還提供的該A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡的制備方法:
[0046]I)樣品墊的制備方法是:[0047]將樣品墊用含0.5~5wt%BSA、0.5~5wt%聚乙烯吡咯烷酮、0.5~5wt%聚乙二醇、0.1~5￥七％吐溫-20、1~5wt%曲拉通-100的0.01M磷酸鹽緩沖液(0.01M磷酸氫二鈉:0.01M磷酸二氫鈉=81:19 (V:V)) (pH7.4)浸泡完全后，37°C烘干或在相對濕度≤35%的環(huán)境下干燥。
[0048]樣品墊緩沖液優(yōu)選為0.01M磷酸鹽緩沖液中溶解0.5wt% BSA、0.5被％聚乙烯吡咯烷酮、0.5wt%聚乙二醇、0.25wt%吐溫-20和Iwt %曲拉通-100。
[0049]2)抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊的制備方法是:
[0050]①用IOmM pH8.4的硼酸緩沖液(2.5mM硼砂:10mM硼酸=4.5:5.5 (V: V))，將水溶性羧基量子點(diǎn)8 μ M的QD525稀釋至I μ Μ。
[0051]②取ImLlyM的量子點(diǎn)，加入30 μ L10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸溶液，室溫反應(yīng)I~2小時(shí)。用30kDa的超濾管超濾，除去未反應(yīng)的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸，吸取超濾管內(nèi)剩余液體，加入IOmM的硼酸緩沖液恢復(fù)為體積至ImL。
[0052]③將抗A族鏈球菌抗體加入IOOkDa的超濾管中，用IOmM硼酸緩沖液調(diào)整抗體含量為 4mg/mL。
[0053]③按200 μ g/lmL的量，將步驟②制備的抗體加入到步驟①量子點(diǎn)溶液中，室溫反應(yīng)I~2小時(shí)。
[0054]④按10 μ L/lmL的量，向步驟③中加入10mg/mL的甘氨酸，封閉未偶聯(lián)抗體的活化羧基位點(diǎn)，反應(yīng)30~60min。
[0055]⑤將偶聯(lián)抗體的量子點(diǎn)溶液加入到30kDa的超濾管中，加入pH9.0濃度0.05MTris-HCl溶液置換溶液緩沖體系，重復(fù)3~5次，恢復(fù)終體積為100 μ L。
[0056]⑥將步驟⑤中的溶在液4°C 1800g離心，取上清液。
[0057]⑦在步驟⑥所得的上清液中加入100 μ L抗體保存液，所述的體保存液為含Iwt %BSA, 20wt %鹿糖，IOwt %海藻糖，0.1wt %吐溫-20和0.1wt %聚乙烯批咯燒酮的0.05MTris-HCl緩沖液。
[0058]⑧將上述所得的溶液用噴金劃膜儀噴至聚酯纖維素膜上，噴量為I~5 μ L/cm(優(yōu)選2 μ L/cm)，放入37°C烘箱，干燥2~5小時(shí)。
[0059]3)包被膜的制備方法是:
[0060]①將羊抗兔抗體用0.02M磷酸鹽緩沖液稀釋至lmg/mL，加入3%的甲醇，即為質(zhì)控
區(qū)工作液。
[0061]②將抗A族鏈球菌抗體2用0.02M磷酸鹽緩沖液稀釋至1.2mg/mL,加入3%的甲醇，即為檢測區(qū)工作液。
[0062]③將①、②所得的溶液，用噴金劃膜儀以I μ L/cm包被到硝酸纖維膜上。檢測區(qū)與質(zhì)控區(qū)間距為0.4~0.7cm (優(yōu)選0.5cm)，位于硝酸纖維素膜中間位置。
[0063]④將步驟③硝酸纖維膜放入37°C烘箱中，干燥過夜。
[0064]4)組裝:
[0065]①硝酸纖維素膜的粘貼:輕輕揭開PVC板上NC膜粘貼處的保護(hù)膜，將NC膜從左向右均勻推進(jìn)，使其牢固的粘貼在PVC板上。
[0066] ②吸水墊的粘貼:將PVC板平鋪于工作臺面上，輕輕揭開PVC板上吸收墊粘貼處的保護(hù)膜，將吸收墊粘附于其上，均勻、輕微滾動式推進(jìn)，以加強(qiáng)粘合力，并防止產(chǎn)生氣泡，吸收墊覆蓋在NC膜上Imm處。
[0067]③抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊的粘貼:將量子點(diǎn)標(biāo)記墊裁為5mmX 300mm。輕輕揭開NC膜上緣量子點(diǎn)標(biāo)記墊粘貼處的保護(hù)膜，將膠體金量子點(diǎn)標(biāo)記墊粘附于其上，方法同吸收墊。抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊3覆蓋在NC膜上1_處。
[0068]④樣品墊的粘貼:將干燥后的樣品墊裁為18mmX 300mm后，輕輕揭開薄板最上端的保護(hù)膜，將樣品墊粘附于抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊3上部，方法同吸收墊。樣品墊覆蓋在抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊上2_處。
[0069]⑤抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊的加固:將銜接膠帶裁為12mmX300mm,粘貼到樣品墊處，頂端距試紙條樣品墊端15mm。
[0070]⑥切條與裝卡:將粘貼好的PVC板切成3.0mm(2.5?4.5mm)寬的試紙條。將每一試紙條裝入塑料卡內(nèi)，將每一試劑卡置于鋁膜袋中，并加入Ig干燥劑I包，熱合封口。
[0071]該A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡的具體使用方法:
[0072]取樣后，在抽提管中加入裂解液A(1M亞硝酸鈉)和裂解液B(2M乙酸)各3?4滴，放入棉拭子后擠壓幾次，靜置3?5min。
[0073]檢測時(shí)，參閱圖5和圖6，將樣本裂解液滴入本檢測試劑的加樣孔中3?4滴，由于毛細(xì)管作用檢測樣品將沿著檢測試紙向吸水墊端移動，樣品中的A族鏈球菌經(jīng)過裂解液裂解后，可與抗A族鏈球菌多克隆抗體熒光標(biāo)記探針發(fā)生特異結(jié)合，然后繼續(xù)移動與包被在硝酸纖維素膜上的抗體結(jié)合，從而被抗A族鏈球菌的多克隆抗體識別，即發(fā)生雙抗體夾心的特異結(jié)合，用手持式紫外線燈照射觀察窗口，在檢測區(qū)出現(xiàn)量子點(diǎn)熒光條帶，從而通過檢測樣本中的A族鏈球菌進(jìn)行呼吸道感染病源的鑒定。檢測過程中，當(dāng)上行液面即滯留于檢測區(qū)的熒光探針將顯示相應(yīng)的熒光。即設(shè)定A族鏈球菌界限值為103CFU/mL，當(dāng)質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)都有熒光出現(xiàn)時(shí)，說明樣品中A族鏈球菌的含量超過103CFU/mL，為陽性；當(dāng)只有質(zhì)控區(qū)有熒光而檢測區(qū)無熒光出現(xiàn)時(shí)，說明樣品中不含A族鏈球菌或者含量低于103CFU/mL，為陰性。
[0074]當(dāng)移動至羊抗兔多克隆抗體質(zhì)控區(qū)時(shí)，無論樣品中A族鏈球菌有無，熒光探針都會與硝酸纖維素膜上包被的羊抗兔IgG結(jié)合滯留，使質(zhì)控區(qū)顯示熒光。因此質(zhì)控區(qū)無熒光產(chǎn)生則代表操作有誤或檢測結(jié)果無效，需重復(fù)試驗(yàn)。
[0075]為了更好的說明本發(fā)明的有益效果，下面給出采用本發(fā)明提供的檢測試劑卡與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)檢測法，臨床經(jīng)驗(yàn)甄別發(fā)的結(jié)果對比實(shí)驗(yàn)。
[0076]檢測例I
[0077]
【權(quán)利要求】
1.一種A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡，包括帶盒蓋的盒體(6)，盒體(6)內(nèi)設(shè)有檢測試紙，所述的檢測試紙包括底板(I)，其特征在于，底板(I)上依次銜接有樣品墊(2)、抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊(3)、包被膜(4)和吸水墊(5)，所述的包被膜(4)上設(shè)有一條A族鏈球菌抗體檢測區(qū)T線和一條羊抗兔多克隆抗體質(zhì)控區(qū)C線，兩條線平行排列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡，其特征在于，所述的盒體(6)的盒蓋(61)上設(shè)有加樣孔(71)和結(jié)果檢測窗口(72)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡，其特征在于，所述的包被膜(4)兩端分別與吸水墊(5)和抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊(3)相互交疊連接，在抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊(3)上壓貼有樣品墊(2)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡，其特征在于，所述的樣品墊(2)為玻璃纖維樣品墊。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡，其特征在于，所述的包被膜(4)為硝酸纖維素膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡，其特征在于，所述的抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊為包被量子點(diǎn)標(biāo)記A族鏈球菌抗體聚酯纖維素膜。
7.制備權(quán)利要求1所述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡，其特征在于，依次包括下述步驟:在底板(I)上依次銜接有樣品墊(2)、抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊(3)、包被膜⑷和吸水墊(5): 其中: .1)樣品墊的制備方法是: 將樣品墊用樣品墊緩沖液浸泡20~30分鐘，干燥。 .2)抗A族鏈球菌抗體量子點(diǎn)標(biāo)記墊的制備方法是: ①用量子點(diǎn)緩沖液將水溶性羧基量子點(diǎn)QD525稀釋至Iμ M ; ②取ImLlyM的量子點(diǎn)，加入30μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸溶液，室溫反應(yīng)I~2小時(shí)，用30kDa的超濾管超濾，除去未反應(yīng)的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸，吸取超濾管內(nèi)剩余液體，加入IOmM的硼酸緩沖液恢復(fù)為體積至.1mL ； ③將抗A族鏈球菌抗體加入IOOkDa的超濾管中，用硼酸緩沖液調(diào)整抗體含量為4mg/mL，按200μ g/lmL的量，將步驟B)中的抗體加入到步驟A)中的量子點(diǎn)溶液中，室溫反應(yīng).1~2小時(shí)； ④按10μL/lmL的量，向步驟C)中加入甘氨酸，封閉未偶聯(lián)抗體的活化羧基位點(diǎn)，反應(yīng).30 ~60min ； ⑤將步驟D)偶聯(lián)抗體的量子點(diǎn)溶液加入到的超濾管中，加入Tris-HCl溶液置換量子點(diǎn)緩沖液，重復(fù)3~5次,吸取超濾管內(nèi)剩余液體,加入Tris-HCl至終體積為100 μ L,離心分離，取上清，并加入抗體保存液； ⑥將上述所得的溶液用噴金劃膜儀噴至聚酯纖維素膜上，噴量為I~5μL/cm，干燥。 .3)包被膜的制備方法是: ①將羊抗兔抗體用0.02M磷酸鹽緩沖液稀釋0.5~2mg/mL，加入3%的甲醇，即為質(zhì)控區(qū)工作液； ②將抗A族鏈球菌抗體用0.02M磷酸鹽緩沖液稀釋至0.8~1.5mg/mL,加入3%的甲醇，即為檢測區(qū)工作液； ③將步驟①、步驟②所得的溶液，用噴金劃膜儀以0.8-1.2 μ L/cm包被到硝酸纖維膜上，檢測區(qū)與質(zhì)控區(qū)間距為0.4-0.7cm，位于硝酸纖維素膜中間位置，將硝酸纖維膜放入.37°C烘箱中，干燥即可。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡的制備方法，其特征在于，步驟2)①中所述的量子點(diǎn)緩沖液為pH8.4的硼酸鹽緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡的制備方法，其特征在于，所述的樣品墊緩沖液為含0.5~5wt% BSA、0.5~5wt%聚乙烯吡咯烷酮、0.5~.5wt%聚乙二醇、0.1~5wt%吐溫-20、I~5wt%曲拉通-100的0.01M磷酸鹽緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的A族鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測試劑卡的制備方法，其特征在于，所述的抗體保存液 為含lwt% BSA,20wt%鹿糖，10wt%海藻糖,0.]^1:%吐溫-20,.0.1wt %聚乙烯吡咯烷酮的0.05M Tris-HCl緩沖液。
【文檔編號】G01N33/533GK103926403SQ201410178876
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】湯永平, 張曉麗, 潘秀華 申請人:廣州市微米生物科技有限公司