一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及利用三葉青提取物的一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NK 細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，腫瘤的生物治療已經(jīng)成為腫瘤治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。NK細(xì)胞是一類(lèi)獨(dú)立 的淋巴細(xì)胞群，NK細(xì)胞主要通過(guò)細(xì)胞毒活性而顯示生物學(xué)效應(yīng)，可直接殺傷腫瘤細(xì)胞、病毒 感染的細(xì)胞，胞內(nèi)寄生菌等。NK細(xì)胞可以識(shí)別自身正常細(xì)胞和異常組織細(xì)胞，其僅殺傷異 常細(xì)胞而對(duì)宿主正常組織細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒作用。此外，NK細(xì)胞通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子，在 免疫調(diào)節(jié)和某些免疫細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。NK細(xì)胞主要以組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex,MHC)非限制性方式識(shí)別腫瘤，通過(guò)顆粒酶B(granzyme B)和 穿孔素（perforin)等途徑殺傷腫瘤細(xì)胞，而T細(xì)胞表面的⑶107aPb分子，與T細(xì)胞活化以 后脫顆粒過(guò)程相關(guān)，其比值可以直接反應(yīng)該效應(yīng)細(xì)胞具有的特異性殺傷活性。
[0003] 同時(shí)，NK細(xì)胞還能與其它固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞相互作用，協(xié)同發(fā)揮抗 腫瘤作用。目前NK細(xì)胞已經(jīng)成為腫瘤患者過(guò)繼免疫治療的重要效應(yīng)細(xì)胞。由此可見(jiàn)，為滿 足生物學(xué)功能研究和臨床過(guò)繼細(xì)胞免疫治療需要，擴(kuò)增出高效和較多數(shù)量的NK細(xì)胞是許 多學(xué)者共同研究的課題。
[0004] 現(xiàn)階段體外擴(kuò)增NK細(xì)胞主要采取飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)法和免疫磁珠分選法，但飼 養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)是將NK細(xì)胞添加到經(jīng)改造后的腫瘤細(xì)胞株，這樣改造在臨床上應(yīng)用的安 全性沒(méi)有得到保障，而免疫磁珠分選法操作過(guò)程繁瑣，成本高，不適合臨床大規(guī)模應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法， 可在體外培養(yǎng)條件下獲得大量的、應(yīng)用安全的、純度較高的以及殺傷活性強(qiáng)的NK細(xì)胞，從 而使得該細(xì)胞達(dá)到能夠安全有效的應(yīng)用于臨床的質(zhì)量指標(biāo)。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)該發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NK細(xì)胞 的方法，包括向NK細(xì)胞培養(yǎng)液中添加三葉青提取物，所述的三葉青提取物的濃度為 0. 00625 u g/ml ~9. 76 u gg/ml。
[0007] 更具體的，本發(fā)明的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)單個(gè)核細(xì)胞分離：靜脈穿刺采集患者外周血，轉(zhuǎn)移至含肝素鈉的抗凝瓶中，上 下混勻，將外周血樣本移至離心管進(jìn)行離心，棄上層血漿，生理鹽水稀釋血樣，淋巴分離液 分離單個(gè)核細(xì)胞，生理鹽水重懸單個(gè)核細(xì)胞，離心收集單個(gè)核細(xì)胞；
[0009] (2)細(xì)胞種瓶：將上述單個(gè)核細(xì)胞用含rhIL-2的NK細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至NK細(xì)胞濃 度為2X10 5~lX106/ml，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5ml，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱培 養(yǎng)；
[0010] ⑶細(xì)胞擴(kuò)增：每2天半量換液1次，并調(diào)整細(xì)胞密度為4X 104~6X 10 4/mL，NK 細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，向培養(yǎng)液中添加三葉青提取物，濃度為0. 00625 y g/ml~9. 76 y g/ml， 此后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0011] ⑷細(xì)胞收集：培養(yǎng)3至21天，收集培養(yǎng)的NK細(xì)胞。
[0012] 優(yōu)選的，步驟⑵中的rhIL-2的濃度為500U/ml。
[0013] 優(yōu)選的，步驟（2)中NK細(xì)胞濃度為3. 5X 105ml。
[0014] 優(yōu)選的，步驟（3)中調(diào)整細(xì)胞密度為5X104/ml。
[0015] 優(yōu)選的，步驟（3)中三葉青提取物的濃度為0? 01 ii g/ml~2. 44 ii g/ml。
[0016] 優(yōu)選的，所述的三葉青提取物為三葉青總提取物，其制備方法為用乙醇溶液加熱 回流三葉青而提取得到的。
[0017] 優(yōu)選的，所述的三葉青提取物為水煮脫糖部位Th-W3,其制備方法為經(jīng)有機(jī)溶劑提 取后的三葉青藥材用水煮后減壓回收蒸干。
[0018] 優(yōu)選的，所述的三葉青提取物為石油醚部位Th-P，取三葉青總提取物，用石油醚進(jìn) 行分步萃取得到。
[0019] 優(yōu)選的，所述的三葉青提取物為水部位脫糖部位Th-W2,其制備方法為三葉青總提 取物的水部位除去糖分，用30%乙醇水洗脫溶液蒸干后得到。
[0020] 本發(fā)明通過(guò)向NK細(xì)胞培養(yǎng)液中加入三葉青提取物擴(kuò)增自然殺傷細(xì)胞的方法的在 于：
[0021] 三葉青的有效成分主要為含黃酮類(lèi)化學(xué)成份，其性涼，味辛、苦，無(wú)毒，具有清熱解 毒、活血止痛、祛風(fēng)化痰、活血止痛等功效，常用于高熱驚厥，小兒感冒發(fā)熱、喉癢腫痛、咳 嗽、肺炎、肝炎、腸炎、痢疾等疾病。現(xiàn)代藥理研究表明，三葉青提取物具有較好的抗腫瘤、抗 炎、鎮(zhèn)痛及解熱作用等。本發(fā)明人通過(guò)對(duì)三葉青的成分進(jìn)行提取分離和鑒定分析，發(fā)現(xiàn)不 同部位的三葉青提取物，只要很低的劑量即能明顯促進(jìn)人NK細(xì)胞增殖，提高NK細(xì)胞的殺瘤 活性。
[0022] 本發(fā)明從大規(guī)模生產(chǎn)的可操作性，臨床應(yīng)用安全性以及有效性角度出發(fā)，優(yōu)化出 三葉青提取物誘導(dǎo)NK細(xì)胞的最佳方案，與其他方法相比，本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0023] 1.本方法可在體外培養(yǎng)條件下獲得大量的、應(yīng)用安全的、純度較高的以及殺傷活 性強(qiáng)的NK細(xì)胞，從而使得該細(xì)胞達(dá)到能夠安全有效的應(yīng)用于臨床的質(zhì)量指標(biāo)，同時(shí)該方法 操作簡(jiǎn)便，成本低，適用于大規(guī)模應(yīng)用；
[0024] 2.利用本發(fā)明所獲得的NK細(xì)胞，在細(xì)胞數(shù)量、純度、殺傷活性、細(xì)胞因子分泌水平 均有顯著提高，利用本方法培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量提高了幾千倍。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1?三葉青提取技術(shù)路線圖；
[0026] 圖2.不同濃度三葉青提取物TH-t對(duì)NK細(xì)胞增殖影響圖；
[0027] 圖3.不同濃度三葉青提取物TH-p對(duì)NK細(xì)胞增殖影響圖；
[0028] 圖4.不同濃度三葉青提取物TH-a對(duì)NK細(xì)胞增殖影響圖；
[0029] 圖5.不同濃度三葉青提取物TH-b對(duì)NK細(xì)胞增殖影響圖；
[0030] 圖6.不同濃度三葉青提取物TH-W對(duì)NK細(xì)胞增殖影響圖；
[0031] 圖7.不同濃度三葉青提取物TH-wl對(duì)NK細(xì)胞增殖影響圖；
[0032] 圖8.不同濃度三葉青提取物TH_w2對(duì)NK細(xì)胞增殖影響圖；
[0033] 圖9.不同濃度三葉青提取物TH-w3對(duì)NK細(xì)胞增殖影響圖；
[0034] 圖10.濃度0. 62 ii g/ml的三葉青提取物Th-t對(duì)NK細(xì)胞增殖影響圖；
[0035] 圖11.濃度0. 62 ii g/ml三葉青提取物Th-p對(duì)NK細(xì)胞增殖影響圖；
[0036] 圖12.濃度0. 166 ii g/ml三葉青提取物Th-W2對(duì)NK細(xì)胞增殖影響圖；
[0037] 圖13.濃度0. 62 ii g/ml三葉青提取物Th_W3對(duì)NK細(xì)胞增殖影響圖；
[0038] 圖14.三葉青總提取物誘導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)三株腫瘤細(xì)胞殺傷活性圖；
[0039] 圖15.0. 15iig/ml三葉青總提取物（TH-t)誘導(dǎo)后的NK細(xì)胞顆粒酶、穿孔素和 CD107a的表達(dá)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0041] 實(shí)施例1 :三葉青藥材提取分離實(shí)驗(yàn)
[0042] 提取液分組：根據(jù)提取時(shí)所選用的制劑將提取液分為9組，分別命名為：TH_t、 TH-p、TH-a、TH-b、TH-w、TH-wl、TH-w2、TH-w3 和 TH-w4;
[0043] 各組三葉青提取物的提取方法：參照文獻(xiàn)[楊陽(yáng).甘西鼠尾草及頭花寥化學(xué)成分 研究.第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2009]分離純化得到，經(jīng)高效液 相色譜（HPLC)檢查?？蓞⒖紙D1關(guān)于三葉青提取技術(shù)路線圖。
[0044] TH-t部分：取三葉青干燥藥材200g，加5倍體積80 %乙醇水溶液浸泡24h后，加熱 回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，過(guò)濾，減壓回收蒸干，得總提取物TH-t 21. 6g， 得率10. 8%。TH-p部分：取此總提取，加水混懸，分別采用10倍體積的石油醚（水飽和） 進(jìn)行分步萃取。分別得到石油醚部位TH-p 0. 15g，得率0.075%。
[0045] TH-a部分：乙酸乙酯部位TH-a 0? 58g，得率0? 29%
[0046] TH-b部分：正丁醇部位TH-b 2g，得率1 %
[0047] TH-w部分：以及水部位TH-w 18. 9g，得率9. 45 %
[0048] THil部分：取水部位進(jìn)行大孔吸附樹(shù)脂色譜，先使用純水進(jìn)行洗脫，除去糖分， 再使用10 %、30 %、60 %、95 %乙醇水溶液分別依次洗脫。其中，10 %乙醇水洗脫溶液減壓回 收蒸干后得到水部位脫糖流分1^110.14§，得率0.07%
[0049] THi2部分：取水部位進(jìn)行大孔吸附樹(shù)脂色譜，先使用純水進(jìn)行洗脫，除去糖分， 再使用10 %、30 %、60 %、95 %乙醇水溶液分別依次洗脫。其中，30 %乙醇水洗脫溶液蒸干后 得到水部位脫糖流分THil 0. 3g，得率0. 15%
[0050] TH_w3部分：將上述經(jīng)有機(jī)溶劑提取后的三葉青藥材用水煮后減壓回收蒸干，獲 得脫水物2. 1克。
[0051] TH-w4部分：將上述經(jīng)有機(jī)溶劑提取后的三葉青藥材用減壓回收蒸干脫水，再使 用10%、30%、60%、95%乙醇水溶液分別依次脫糖，其中，獲得了10%乙醇水部位脫糖流 分。
[0052] 可參考圖1關(guān)于三葉青提取技術(shù)路線圖。
[0053] 實(shí)施例2:不同濃度的三葉青提取物對(duì)NK細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)
[0054] NK細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定：
[0055] 取健康獻(xiàn)血者外周抗凝血10ml，淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，用含500U/ml rhIL-2的NK培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為3. 5 X 105/mL，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5ml，于 37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2天半量換液1次，并調(diào)整細(xì)胞密度為5X105/mL，收集培養(yǎng)7 天的NK細(xì)胞，加入PE標(biāo)記的⑶3、FITC標(biāo)記的⑶56進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)。
[0056] CCK8法檢測(cè)不同三葉青提取物對(duì)人NK細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：
[0057] 取培養(yǎng)7天的NK細(xì)胞配成5 X 104/mL的細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，200 ill/ 孔。實(shí)驗(yàn)組：共設(shè)11個(gè)濃度組，分別加入5 X104/mL的NK細(xì)胞，180 yl/孔。然后加入不 同濃度的三葉青提取物（終濃度分別為〇. 〇〇〇625、0. 0025、0. 01、0. 039、0. 155、0. 62、2. 44、 9. 76、39、156 y g/ml)每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)高末加藥物空白對(duì)照組：于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、 48h、72h。培養(yǎng)結(jié)束前4個(gè)小時(shí)每孔加入CCK8 20 iil，繼續(xù)培養(yǎng)4h后于酶標(biāo)儀450nm處檢 測(cè)各孔吸光值（0D)記錄結(jié)果。增殖率（％ )=(實(shí)驗(yàn)0D值）一（對(duì)照0D值V(對(duì)照0D 值）X100%。
[0058] 各階段三葉青提取物對(duì)NK細(xì)胞生長(zhǎng)影響：
[0059] 各提取階段三葉青提取物對(duì)NK細(xì)胞生長(zhǎng)影響有較大差異，在藥物濃度相同條件 下，以水煮脫糖部位（Th_w3)時(shí)促NK細(xì)胞生長(zhǎng)活性最強(qiáng)；總提取物（Th-t)、石油醚部位 (Th-p)和水部位脫糖部位（Th-w2)次之，與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p < 0. 05)。其他 結(jié)果均有一定的促NK細(xì)胞增殖作用。提取物Th-