用于誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的方法及組成物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明關(guān)于在患有細(xì)胞自噬（autophagy)缺陷的個(gè)體誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的方法，特別 是一種通過(guò)對(duì)個(gè)體投予靈芝萃取物而用于在患有細(xì)胞自噬缺陷的個(gè)體中誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞自嗤（autophagy)或稱"自體消化過(guò)程（selfdigestionprocess) "，為一 種重要的生理過(guò)程，其靶向細(xì)胞質(zhì)中的成分，諸如要于溶酶體中降解的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)聚集 體（aggregates)和胞器。細(xì)胞自噬過(guò)程對(duì)于維持神經(jīng)恒定性也是必要的，且其功能失調(diào) (dysfunction)與多種疾病有直接關(guān)聯(lián)。
[0003] 當(dāng)細(xì)胞處在饑餓狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞自噬的目的在于回收細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞代 謝，而當(dāng)細(xì)胞處于壓力時(shí)，細(xì)胞自噬也能將累積的損壞胞器和蛋白質(zhì)清除。
[0004] 細(xì)胞自噬的缺陷是多種疾病的主要成因，這些疾病可以是，但不限于：神經(jīng) 退行性疾病、肝臟疾病和癌癥。許多人類神經(jīng)退行性疾病與異常突變和/或泛素蛋白 (polyubiquitinatedprotein)的累積以及過(guò)度的神經(jīng)細(xì)胞死亡有關(guān)。
[0005] 神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Nervegrowthfactor,NGF)于1951年被分離出來(lái)，且其為是 第一個(gè)被分離出來(lái)的神經(jīng)滋養(yǎng)因子。在發(fā)育過(guò)程及成熟動(dòng)物個(gè)體中，NGF是由星狀細(xì)胞 (astrocytes)分泌，且對(duì)于神經(jīng)突觸可塑性以及建立有功能的神經(jīng)回路亦扮演重要的角 色。內(nèi)生性的NGF對(duì)于前腦負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)記憶的膽堿神經(jīng)元的存活及功能的重要性亦被證實(shí)， 此種神經(jīng)滋養(yǎng)因子的部分去除與可量測(cè)的學(xué)習(xí)和記憶缺陷相關(guān)。
[0006] 在許多動(dòng)物模式中，NGF已顯示具有潛在的神經(jīng)保護(hù)效果。此外，在大鼠中，NGF 能保護(hù)對(duì)抗諸如3-NP和MPTP的線粒體毒素所引起的神經(jīng)元死亡。因此，在神經(jīng)退行性 疾病的治療的藥理應(yīng)用中，NGF被認(rèn)為扮演關(guān)鍵的角色。然而，NGF的獲取受到血腦障壁 (blood-brainbarrier)的限制，且當(dāng)經(jīng)由周邊投藥時(shí)又易被代謝掉；因此，使用時(shí)它只能 被直接注入至腦部。當(dāng)NGF經(jīng)由腦室注射時(shí)，其與許多的副作用相關(guān)聯(lián)，因而使該傳遞途徑 不實(shí)用。因此，對(duì)于神經(jīng)退行性疾病，調(diào)控內(nèi)生性NGF表達(dá)可能是一種嶄新的治療策略。
[0007] 神經(jīng)退行泛指神經(jīng)元的功能或結(jié)構(gòu)漸進(jìn)式的喪失。許多神經(jīng)退行性疾病，包括帕 金森氏癥（Parkinson'sdisease,F*D)、阿茲海默癥（Alzheimer'sdisease,AD)、亨丁頓氏 舞蹈癥（Huntington'sdisease,HD)和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（amyotrophiclateral sclerosis，ALS)都是因神經(jīng)退行的過(guò)程所造成。最近，許多神經(jīng)退行性疾病的類似疾病被 發(fā)現(xiàn)，這些疾病彼此之間都有些關(guān)聯(lián)。舉例來(lái)說(shuō)，有些神經(jīng)退行性疾病與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì) 的不正常堆積有關(guān)，其亦被稱為非典型的蛋白質(zhì)集結(jié)（atypicalproteinassemblies)。
[0008] 亨丁頓氏舞蹈癥（HD)是一種常染色體顯性的神經(jīng)退行性疾病，其由亨丁頓 (huntingtin,Htt)基因的外顯子l(exon1)上CAG三核苷酸重復(fù)序列的異常擴(kuò)張所導(dǎo) 致。HD的主要特征是HD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及病患腦中受影響的紋狀體神經(jīng)元的突變亨丁頓蛋白 Htt(mHtt)聚集體的形成。Htt基因的多谷氨酰胺（polyglutamine，polyQ)延伸大于37個(gè) 谷氨酰胺的擴(kuò)張或編碼該polyQ延伸的短N(yùn)-端片段就足以造成小鼠或該疾病的細(xì)胞模型 中的聚集體形成。
[0009] 靈芝（Ganodermalucidum)是亞洲地區(qū)使用廣泛且歷史悠久的藥用植物（真 菌）之一。已有許多研究探討靈芝在疾病治療上的應(yīng)用。靈芝的最重要藥理活性小 分子成分是三萜類（triterpenoids)，其被報(bào)導(dǎo)具有肝臟保護(hù)、抗高血壓、降膽固醇 (hypocholesterolemic)、抗組織胺（anti-histaminic)、抗癌以及抗血管新生活性。然而， 其增進(jìn)智能的特性尚未被充分研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 在一方面，本發(fā)明提供一種在患有細(xì)胞自噬缺陷的個(gè)體中誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的方法。 根據(jù)本發(fā)明，該方法包含對(duì)該個(gè)體投予治療有效量的靈芝萃取物，其中，該細(xì)胞自噬增進(jìn)該 個(gè)體中的蛋白質(zhì)聚集體的清除。
[0011] 在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，該細(xì)胞自噬缺陷是在該個(gè)體的細(xì)胞，其表達(dá)蛋白質(zhì) 聚集體，且其中該細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，該蛋白質(zhì) 聚集體是選自下列所組成的群組的聚集體：亨丁頓蛋白、淀粉樣蛋白0、a-突觸核蛋白、 T蛋白、超氧化物歧化酶1、其變異體和突變形式以及其組合。
[0012] 在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，該細(xì)胞自噬缺陷為選自于由神經(jīng)退行性疾病、克隆 氏癥（Crohn'sdisease)、老化、心臟疾病和肝臟疾病所組成的群組的疾病。在本發(fā)明的一 具體實(shí)施例中，該神經(jīng)退行性疾病選自于由亨丁頓氏舞蹈癥、阿茲海默癥、帕金森氏癥、肌 萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和致死性家族性失眠癥所組成的群組。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，該靈芝萃取物是經(jīng)由口服投予至該個(gè)體。
[0014] 另一方面，本發(fā)明提供一種用于在患有細(xì)胞自噬缺陷的個(gè)體中活化神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (NGF)的方法，其中，該神經(jīng)生長(zhǎng)因子可活化個(gè)體的細(xì)胞自噬，且其中該細(xì)胞自噬可增進(jìn)個(gè) 體的蛋白質(zhì)聚集體的清除。根據(jù)本發(fā)明，該方法包含對(duì)該個(gè)體投予治療有效量的靈芝萃取 物。
[0015] 在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，該細(xì)胞自噬缺陷是在該個(gè)體的細(xì)胞，其表達(dá)蛋白質(zhì) 聚集體。
[0016] 在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，該蛋白質(zhì)聚集體是亨丁頓蛋白、淀粉樣蛋白3、 a-突觸核蛋白、t蛋白、超氧化物歧化酶1、其變異體和突變形式以及其組合中的一種或 多種。
[0017] 另一方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防個(gè)體記憶喪失的方法。根據(jù)本發(fā)明，該方法包 含對(duì)該個(gè)體投予治療有效量的靈芝萃取物，其中，該靈芝萃取物可活化該個(gè)體的細(xì)胞自噬。
[0018] 在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，該靈芝萃取物誘導(dǎo)神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF)以活化該個(gè) 體的細(xì)胞自噬。在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，該細(xì)胞自噬可增進(jìn)個(gè)體的蛋白質(zhì)聚集體的清 除。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明，該個(gè)體患有細(xì)胞自噬缺陷。在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，該細(xì)胞自噬 缺陷為選自于由亨丁頓氏舞蹈癥、阿茲海默癥、帕金森氏癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和致 死性家族性失眠癥所組成的群組神經(jīng)退行性疾病
[0020]另一方面，本發(fā)明提供一種在患有細(xì)胞自噬缺陷的個(gè)體中誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的組合 物，其中，該方法包含靈芝酸和醫(yī)藥上可接受的載劑。在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，該靈芝 酸是一種或多種選自于由靈芝酸C2、靈芝酸A、靈芝酸H、靈芝烯酸D、靈芝酸D和12-乙酰 氧基靈芝酸F所組成的群組的靈芝酸。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 靈芝（Ganodermalucidum)在說(shuō)明書及附圖中縮寫為GaLu。圖1A至1E顯示神 經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF)對(duì)表達(dá)mHtt-74Q的PC12細(xì)胞模型的影響。（A)經(jīng)NGF處里后的細(xì)胞的 熒光平均強(qiáng)度（FMI)比。直方圖表示在兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的FMI的量化（n= 6)。（B) 在表達(dá)mHtt-74Q并經(jīng)50ng/ml的NGF處理的細(xì)胞中，熒光分布向左移，代表聚集體減少。X 軸代表測(cè)得的綠色熒光幅度，而呈熒光程度繪制的Y軸代表細(xì)胞數(shù)。數(shù)值以平均標(biāo)準(zhǔn)偏差 (mean土SD)方式表示（#P〈0. 01 為與未經(jīng)Dox處理（NoDox)相比；而 #P〈0. 05、##P〈0. 01 為與經(jīng)Dox處理（Dox)相比）。（C)NGF促進(jìn)自嗤小體（autophagosome)的形成，并可促進(jìn) mHtt的降解。利用MDC染色以檢視細(xì)胞內(nèi)表達(dá)自體吞噬泡。在經(jīng)NGF處理的細(xì)胞中可見 MDC染色后的熒光強(qiáng)度增加。白色箭頭代表在經(jīng)NGF處理的細(xì)胞中的MDC與EGFP的影像重 迭（co-localization)，而黃色箭頭代表在經(jīng)Dox處理的細(xì)胞中的EGFP聚集體和經(jīng)MDC染 色的點(diǎn)狀熒光影像。在Dox細(xì)胞中有稀少的EGFP與MDC的影像重迭。（比例尺為10微米 (ym))。（D)MDC染色的量化結(jié)果。與控制組（noDox)相比，結(jié)果為每細(xì)胞中所含的點(diǎn)狀 熒光影像。（E)以西方墨點(diǎn)法檢視在不同條件下LC3-I與LC3-II的蛋白質(zhì)濃度（以200nM 的雷帕霉素（Rapamycin)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬作為正控制組）（n= 3) /P〈0. 05, #P〈0. 01為與No Dox相比，而#P〈0. 05廣P〈0. 01為與Dox相比。
[0022] 圖2A至2G顯示靈芝（GaLu)(為星狀細(xì)胞NGF誘導(dǎo)物）在PC12細(xì)胞中調(diào)節(jié)粒腺 體的生體合成（biogenesis)與在HD細(xì)胞模型中減緩mHtt所誘導(dǎo)的損害。分析初級(jí)星狀 細(xì)胞經(jīng)GaLu處理六小時(shí)的mRNA表達(dá)量（A)或二十四小時(shí)的蛋白質(zhì)表達(dá)量（B)。（C)顯示 NGF于星狀細(xì)胞經(jīng)GaLu(GaLu-ACM)處理二十四小時(shí)所收集的二十倍濃縮細(xì)胞培養(yǎng)液的西 方墨點(diǎn)圖示。（D)利用流式細(xì)胞儀分析以GaLu-ACM抑制mHtt-74Q聚集體。直方圖表示在 兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的FMI的量化（n= 6)。（E)在表達(dá)mHtt-74Q并經(jīng)100iig/ml的GaLu 處理的細(xì)胞中，熒光分布向左移，代表聚集體數(shù)目減少。（F)GaLu增加MDC強(qiáng)度。白色箭頭 所指為經(jīng)GaLu處理的細(xì)胞有MDC和EGFP的影像重迭。（比例尺為10微米）。與未經(jīng)處 理的控制組（noDox)相比，將每細(xì)胞的點(diǎn)狀熒光影像區(qū)進(jìn)行MDC的量化。（G)顯示利用西 方墨點(diǎn)法觀察LC3-I和LC3-II在每個(gè)條件下的蛋白質(zhì)表達(dá)濃度。（使用200nM的雷帕霉 素處理作為誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的正控制組）（n= 3)。乍〈0. 05，，〈0. 01為與NoDox相比，而 #P〈0. 05, ##P〈0. 01 為與Dox相比。
[0023] 圖3顯示靈芝萃取物在初級(jí)星狀細(xì)胞中專一性的增加NGFmRNA的表達(dá)量。星狀細(xì) 胞經(jīng)靈芝萃取物處理6小時(shí)后進(jìn)行RT-PCR，分析神經(jīng)滋養(yǎng)因子（NGF,IGF-1，bFGF和BDNF) 的表達(dá)。
[0024] 圖4A至4C顯示星狀細(xì)胞NGF誘導(dǎo)物（靈芝萃取物）在PC12細(xì)胞中誘導(dǎo)神經(jīng)突 觸的生長(zhǎng)。所使用的培養(yǎng)液為經(jīng)靈芝（GaLu-ACM)處理或未經(jīng)靈芝處理24小時(shí)后的初級(jí)星 狀細(xì)胞培養(yǎng)液。將PC12細(xì)胞以GaLu-ACM或NGF處理后收集。
[0025] 圖5A至5J顯示區(qū)分來(lái)自靈芝粗萃物的