一種馬臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基及其分離培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種馬臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基及其分離 培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞定義：間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells,MSC)是干細(xì)胞家 族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向 分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān) 注。如間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、 韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛 能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。目前的研宄表明， MSC細(xì)胞表面抗原為⑶73、⑶90、⑶105陽性，⑶34、⑶45陰性。
[0003] 鑒于間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能、能支持造血和促進(jìn)造血干細(xì)胞植入、調(diào)節(jié) 免疫以及分離培養(yǎng)操作簡便等特點(diǎn)，正日益受到人們的關(guān)注。隨著間充質(zhì)干細(xì)胞及其相關(guān) 技術(shù)的日益成熟，臨床研宄已經(jīng)在許多國家開展。作為種子細(xì)胞，臨床上主要用于治療機(jī) 體無法自然修復(fù)的組織細(xì)胞和器官損傷的多種難治性疾病；作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，治療免疫 排斥和自身免疫性疾病。
[0004] 目前，我們能夠從骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊水、臍 帶血中分離和制備間充質(zhì)干細(xì)胞，用得最多的是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。但骨髓來源的 間充質(zhì)干細(xì)胞存在以下問題：隨著年齡的老化，干細(xì)胞數(shù)目顯著降低、增殖分化能力大幅度 衰退；制備過程不容易質(zhì)控；移植給異體可能引起免疫反應(yīng)；取材時(shí)對(duì)患者有損傷，患者有 骨髓疾病時(shí)不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。這都限制了骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞臨床應(yīng)用，使得尋找骨髓以外其他可替代的間充質(zhì)干細(xì)胞來源成為一個(gè)重要的問題。
[0005] 目前在胎盤、臍帶、臍血等組織中已成功分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，這種組織來源的間 充質(zhì)干細(xì)胞不僅保持了間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，而且還具備如下優(yōu)點(diǎn)：①胎盤和臍帶 中的干/祖細(xì)胞更原始，有更強(qiáng)的增殖分化能力。②免疫細(xì)胞較為幼稚，功能活性低，不會(huì) 觸發(fā)免疫反應(yīng)及引起移植物抗宿主病。③干細(xì)胞易于分離，純度高，無腫瘤細(xì)胞污染。④擴(kuò) 增時(shí)培養(yǎng)體系能統(tǒng)一，便于質(zhì)控。⑤可制成種子細(xì)胞冷凍，多次使用，冷凍后細(xì)胞損失小。⑥ 潛伏性病毒和病原微生物的感染及傳播幾率比較低。⑦采集時(shí)對(duì)產(chǎn)婦及新生兒無任何危害 及損傷。⑧采集方便，易于保存和運(yùn)輸，倫理學(xué)爭議少。這種胎盤和臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì) 胞有可能成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代物，并具有更大的應(yīng)用潛能。
[0006] 迄今的研宄表明，臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞不但能夠成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理 想替代物，而且具有更大的應(yīng)用潛能。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)多種胚胎干細(xì)胞的特有分子 標(biāo)志，具有分化潛力大、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制、易于 工業(yè)化制備等特征，因此有可能成為最具臨床應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞。目前賽馬項(xiàng)目十分 盛行，而一匹賽馬的價(jià)格驚人，而馬又時(shí)常在賽馬活動(dòng)中受傷，廠家受傷部位為骨關(guān)節(jié)、肌 肉等。這種情況下，用馬臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植就可能治愈賽馬的疾患，挽救賽馬的運(yùn)動(dòng)生 涯。
[0007]目前人臍血MSC的分離、培養(yǎng)方法主要為用淋巴細(xì)胞分離液Ficoll從臍血中分離 出單個(gè)核細(xì)胞，之后再用干細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，所獲得貼壁細(xì)胞即為MSC。但該方法所得 MSC增殖緩慢，數(shù)量較少。目前尚無從馬臍血分離培養(yǎng)MSC的相關(guān)專利報(bào)道。此外由于臍 血中MSC數(shù)量稀少，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，臍血中的MSC含量為每10 6單個(gè)核細(xì)胞含有0. 5~1個(gè) MSC，僅為骨髓的1/10。現(xiàn)有的方法所得MSC增殖緩慢，數(shù)量較少，且培養(yǎng)成功率低，并不是 所有的臍血均能用該方法分離培養(yǎng)獲得MSC。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是從馬臍血中分離出MSC，并改良臍血MSC的培養(yǎng)條件，進(jìn)行體外大 規(guī)模擴(kuò)增培養(yǎng)，為應(yīng)用馬臍血MSC治療馬疾患創(chuàng)造條件。
[0009] 本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0010] 一種馬臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，在MDM培養(yǎng)基中添加馬血清、粒細(xì)胞-巨噬 細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM_CSF)和人 干細(xì)胞生長因子（stem cell factor，SCF)，其中馬血清的體積百分?jǐn)?shù)為1~50% ;GM-CSF 的質(zhì)量濃度為1~l〇〇ng/ml ;SCF的質(zhì)量濃度為1~100ng/ml，余量為MDM培養(yǎng)基。
[0011] 優(yōu)選，所述馬血清的體積百分?jǐn)?shù)為10% ;GM-CSF的質(zhì)量濃度為10ng/ml ;SCF的質(zhì) 量濃度為l〇ng/ml，余量為MDM培養(yǎng)基。
[0012] 所述頂DM培養(yǎng)基為Gibco,貨號(hào)：31980030。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述的馬臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0014] 具體可以應(yīng)用在馬臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，包括以下步驟：
[0015] (1)單個(gè)核細(xì)胞的分離：將添加抗凝劑的臍血用生理鹽水或細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋后， 采用密度梯度離心法得到單個(gè)核細(xì)胞；
[0016] (2)MSC的培養(yǎng)：將單個(gè)核細(xì)胞用所述的馬臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0017] 優(yōu)選，所述抗凝劑為枸櫞酸鈉。
[0018] 優(yōu)選，所述細(xì)胞培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基；所述稀釋比例為1:1~1:5。
[0019] 優(yōu)選，所述密度梯度離心法是采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，100g~1000g離心 10~50min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，再用RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，100g~1000g離心1~ 20min〇
[0020] 優(yōu)選，將單個(gè)核細(xì)胞用馬臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)是將單個(gè)核細(xì)胞用 所述的馬臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基重懸后，以1~10X10 5/ml的細(xì)胞密度接種于馬臍血 間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基中，在37°C、5% C02條件下培養(yǎng)。
[0021] 優(yōu)選，所述培養(yǎng)到達(dá)第6天時(shí)，去除舊培養(yǎng)基，添加所述的馬臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的 培養(yǎng)基，此后，每三天更換培養(yǎng)基一次。
[0022] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0023] 1.從馬臍血中分離、培養(yǎng)MSC，目前尚無相關(guān)專利報(bào)道。
[0024] 2.培養(yǎng)臍血MSC時(shí)，添加GM-CSF、SCF，可有效提高臍血MSC的擴(kuò)增效率。現(xiàn)有的 擴(kuò)增培養(yǎng)臍血MSC方法未添加GM-CSF、SCF。
[0025] 3.本發(fā)明采