05~0?lmol/L，pH值為8. 2~8. 4。
[0017] 作為本發(fā)明所述人IgG4型抗體的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟（2)和所述 步驟（3)中，PBS的濃度均為0.01~0.05mol/L，且PBS中含有0.5mol/LNaCl;所述步驟（2) 中，緩沖溶液4為0.05-0.2111〇1/11'1^8-11(：1，緩沖溶液8為0.05-0.15111〇1/1617-11(：1 ;所述 步驟（3)中，緩沖溶液C為0. 05-0. 15mol/LGly-HCl，緩沖溶液C的洗脫體積為5~10個(gè) 柱床體積，緩沖溶液D為0. 5-lmol/LTris-HCl，PBS洗柱的體積為5~10個(gè)柱床體積。
[0018] 同時(shí)，本發(fā)明還提供了由上述方法制備得到的人IgG4型抗體及所述人IgG4型抗 體在抑制能與血清補(bǔ)體結(jié)合的免疫復(fù)合物的形成中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明采集患同種疾病的人（包括同一個(gè)體或者患同種疾 病的群體）的外周血來(lái)制備血漿或血清或者漿細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，并通過(guò)親和層析柱進(jìn)行 分離，獲得了具有個(gè)體或者同種疾病特征人IgG4型抗體。由于采用親和層析柱進(jìn)行分離， 分離效果好，特異性高，純化后制得的IgG4型抗體純度高。
[0020] 本發(fā)明制備的人IgG4型抗體對(duì)靶抗原的親和力和其他亞型的抗體（如IgGl、 IgG2、IgG3、IgE)沒(méi)有差異，但不能激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑；該人IgG4型抗體不僅能封閉抗原， 進(jìn)而抑制其它亞型免疫復(fù)合物（如IgGl、IgG2、IgG3和IgE型抗體與自身抗原或過(guò)敏原形 成的免疫復(fù)合物）的形成，還可避免激活補(bǔ)體，或抑制嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的活化造 成的組織損傷，在自身免疫性疾病和過(guò)敏性疾病的治療中起到保護(hù)作用。
[0021] 本發(fā)明對(duì)臨床上現(xiàn)行的治療方法也有一定的借鑒意義，包括：①臨床上現(xiàn)用免疫 吸附治療疾病（如自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等）時(shí)，對(duì)免疫球蛋 白的吸附去除應(yīng)具有選擇性，應(yīng)避免將具有封閉自身抗原，進(jìn)而起到保護(hù)作用的IgG4型抗 體吸附去除；②給（同一個(gè)體或同種類(lèi)型疾病）患者（如自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡 和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等）注射免疫球蛋白時(shí)，通過(guò)本發(fā)明所獲得的IgG4型抗體，有望起到封 閉自身抗原，阻斷致病性免疫復(fù)合物（包括1861、1 §62、1§63、1§11和1§￡等）的形成，起到 保護(hù)性的治療作用；③本發(fā)明可制備IgG4型抗體，具有易獲取、不具有免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，是 一種可防治免疫復(fù)合物所致疾?。òㄗ陨砻庖咝约膊『瓦^(guò)敏性疾病等）的生物制劑。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例6所述上層血漿中免疫復(fù)合物含量測(cè)定的結(jié)果圖；
[0023] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例7所述上層血漿中免疫復(fù)合物含量測(cè)定的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 為更好地說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明 作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] 本發(fā)明人IgG4型抗體的制備方法的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述人IgG4型抗體的 制備方法包括以下步驟：
[0027] (1)制備血漿：采集系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)患者的外周血，加入抗凝劑后離心，制 得血漿；
[0028] (2)制備親和層析柱：以溴化氫活化瓊脂糖凝膠，溶脹并抽干活化后的瓊脂糖凝 膠，向其中加入含有抗人IgG4抗體的NaHC0 3溶液，瓊脂糖凝膠與抗人IgG4抗體發(fā)生偶聯(lián) 反應(yīng)；再以pH值為8. 0、濃度為0. 05mol/L的Tris-HCl封閉處理偶聯(lián)了抗人IgG4抗體的 瓊脂糖凝膠，裝柱；最后，依次用Gly-HCl和PBS洗柱，得到以偶聯(lián)了抗人IgG4抗體的瓊脂 糖凝膠為固定相的親和層析柱，保存?zhèn)溆茫黄渲?，Gly-HCl的pH值為2. 5、濃度為0. 15mol/ L，PBS 的 pH 值為 7. 4、濃度為 0? 03mol/L，且 PBS 中含有 0? 5mol/LNaCl ;
[0029] (3)純化人IgG4型抗體：將步驟⑴制得的血漿加入步驟⑵制得的親和層析柱 中，先用pH值為7. 4的PBS洗柱，PBS的濃度為0. 03mol/L，且PBS中含有0. 5mol/L NaCl， PBS的洗脫體積為8個(gè)柱床體積；再用pH值為2. 5、濃度為0. 15mol/L的Gly-HCl洗脫人 IgG4型抗體，洗脫體積為8個(gè)柱床體積；收集洗脫液，并向其中加入pH值為9. 0、濃度為 0. 5mol/L的Tris-HCl將洗脫液中和至pH值為7. 2~7. 4,濃縮中和后所得的溶液進(jìn)行并 進(jìn)行定量。
[0030] 實(shí)施例2
[0031] 本發(fā)明人IgG4型抗體的制備方法的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述人IgG4型抗體的 制備方法包括以下步驟：
[0032] (1)制備血清：采集雞卵清白蛋白過(guò)敏患者的外周血，37°C靜置30分鐘，離心，制 得血清；
[0033] (2)制備親和層析柱：以溴化氫活化瓊脂糖凝膠，溶脹并抽干活化后的瓊脂糖凝 膠，向其中加入含有抗人IgG4抗體的NaHC0 3溶液，瓊脂糖凝膠與抗人IgG4抗體發(fā)生偶聯(lián) 反應(yīng)；再以pH值為7. 8、濃度為0. 2mol/L的Tris-HCl封閉處理偶聯(lián)了抗人IgG4抗體的瓊 脂糖凝膠，裝柱；最后，依次用Gly-HCl和PBS洗柱，得到以偶聯(lián)了抗人IgG4抗體的瓊脂糖 凝膠為固定相的親和層析柱，保存?zhèn)溆?；其中，Gly-HCl的pH值為3. 0、濃度為0. 05mol/L， PBS 的 pH 值為 7. 2、濃度為 0? 05mol/L，且 PBS 中含有 0? 5mol/L NaCl ;
[0034] (3)純化人IgG4型抗體：將步驟⑴制得的血清加入步驟⑵制得的親和層析柱 中，先用pH值為7. 2的PBS洗柱，PBS的濃度為0. 01mol/L，且PBS中含有0. 5mol/L NaCl， PBS的洗脫體積為10個(gè)柱床體積；再用pH值為3. 0、濃度為0. 05mol/L的Gly-HCl洗脫人 IgG4型抗體，洗脫體積為10個(gè)柱床體積；收集洗脫液，并向其中加入pH值為8. 8、濃度為 lmol/L的Tris-HCl將洗脫液中和至pH值為7. 2~7. 4,濃縮中和后所得的溶液進(jìn)行并進(jìn) 行定量。
[0035] 實(shí)施例3
[0036] 本發(fā)明人IgG4型抗體的制備方法的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述人IgG4型抗體的 制備方法包括以下步驟：
[0037] (1)制備人B細(xì)胞：采集系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)患者的外周血，加入EDTA_K 2抗凝， 并用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行離心分離，獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞；再采用商品化的B細(xì)胞正選 (陽(yáng)選）或負(fù)選（陰選）試劑盒（Miltenyi Biotec，STEMCELL Technologies公司可提供） 分離純化B細(xì)胞；
[0038] (2)體外誘導(dǎo)B細(xì)胞為漿細(xì)胞并培養(yǎng)漿細(xì)胞：將DMEM完全培養(yǎng)液置于溫度為 37°C、含有5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，通過(guò)EB病毒或SV40病毒轉(zhuǎn)染將步驟（1)所得的B細(xì) 胞轉(zhuǎn)化為永生化的漿細(xì)胞，并將制得的漿細(xì)胞于所述DMEM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)3周，培養(yǎng)過(guò) 程中每2~4天更換一次培養(yǎng)液，收集每次更換的培養(yǎng)液上清，即得漿細(xì)胞培養(yǎng)的上清液； 其中，所述DMEM完全培養(yǎng)液中含有質(zhì)量百分比為10%的胎牛血清，并加入了細(xì)胞因子和濃 度為2 y g/mL的美洲商陸絲裂原；所述細(xì)胞因子由下述濃度的組分組成：100ng/mL白細(xì)胞 介素-2、20ng/mL 白細(xì)胞介素-10、100ng/mL CD40L、200ng/mL 白細(xì)胞介素-4、200ng/mL 白 細(xì)胞介素-13和100ng/mL白細(xì)胞介素-5 ;
[0039] (3)制備親和層析柱：以溴化氫活化瓊脂糖凝膠，溶脹并抽干活化后的瓊脂糖凝 膠，向其中加入含有抗人IgG4抗體的NaHC0 3溶液，瓊脂糖凝膠與抗人IgG4抗體發(fā)生偶聯(lián) 反應(yīng)；再以pH值為7. 9、濃度為0. 12mol/L的Tris-HCl封閉處理偶聯(lián)了抗人IgG4抗體的 瓊脂糖凝膠，裝柱；最后，依次用Gly-HCl和PBS洗柱，得到以偶聯(lián)了抗人IgG4抗體的瓊脂 糖凝膠為固定相的親和層析柱，保存?zhèn)溆茫黄渲?，Gly-HCl的pH值為2. 8、濃度為0. lOmol/ L，PBS 的 pH 值為 7. 6