專利名稱：一種畜禽飼料添加劑酪酪肽卵黃抗體粉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物活性肽卵黃抗體粉的制備方法，尤其是涉及一種畜禽誘食劑酪酪肽卵黃抗體粉的制備方法。
背景技術(shù)：
酪酪肽(PYY)作為一類胃腸道衍生激素，不僅能使機(jī)體產(chǎn)生飽感、減少攝食和體重，而且還影響消化道生理與功能，作用機(jī)制復(fù)雜，涉及范圍廣泛，成為受人關(guān)注的新型食欲調(diào)控因子(歐榮娣，陳永輝，沈維軍等.酪酪肽生理功能及其在哺乳母豬養(yǎng)殖中的應(yīng)用前景[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2010，22 (5):1142-1146.)。禁食和自由采食的嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)的PYY濃度在攝食前下降而攝食后增加的現(xiàn)象說明，PYY是一個(gè)調(diào)節(jié)攝食的飽感信號(hào)。動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)均證實(shí)外周注射ΡΥΥ3_36可產(chǎn)生厭食作用，且攝食減少量與ΡΥΥ3_36的注射量呈劑量反應(yīng)關(guān)系，長期注射可使動(dòng)物體重增重減少(Maria A., Papadimitriou, Alicja A.,et al.Peptide YY3—36_induced inhibition of food intake in female monkeys.BrainResearch.2007,1175:60-65.)。肥胖病人空腹血漿PYY水平較低，攝入相同的試驗(yàn)餐后，肥胖對(duì)象的PYY釋放低于正常對(duì)照，提示內(nèi)源性PYY不足引起的攝食過量與肥胖密切相關(guān)，補(bǔ)充外源性ΡΥΥ3_36可能成為治療肥胖的有效方法。研究表明，PYY及其受體對(duì)攝食具有調(diào)節(jié)作用，能使機(jī)體產(chǎn)生飽感，減少攝食。PYY能自由通過血腦屏障，與受體結(jié)合，將激素信號(hào)轉(zhuǎn)換為神經(jīng)信號(hào)，激活前黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原/苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物(P0MC/CART)神經(jīng)元的表達(dá)，促進(jìn)阿片黑皮質(zhì)素的分泌，同時(shí)還能抑制神經(jīng)肽Y/刺鼠色蛋白相關(guān)蛋白(NPY/AGRP)神經(jīng)元活動(dòng)，減少NPY和AGRP的分泌，從而使機(jī)體產(chǎn)生飽感，抑制采食(MartinN Μ，Small C J，Sajedi A, et al.Pre-obese and obese agouti mice are sensitive to theanorectic effects of peptide YY(3-36)but resistant to ghrelin.1nt JObes RelatMetab Disord.2004,28:886-893.)。理論上，通過外源注射對(duì)抑制攝食有影響的激素的抗體到血液中中和體內(nèi)的某種激素，即采用抗原抗體中和的免疫技術(shù)能降低這種激素作為抑制攝食信號(hào)的能力，或者通過添加某種激素受體拮抗劑減弱激素信號(hào)從外周神經(jīng)系統(tǒng)傳到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力，就能降低這種激素的飽感作用，促進(jìn)動(dòng)物采食。部分研究者在上世紀(jì)50年代就已經(jīng)認(rèn)識(shí)到利用激素的抗體改變動(dòng)物生產(chǎn)性能的可能性?？贵w作為介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子，是B細(xì)胞接受抗原刺激后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白，主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原特異性的結(jié)合，顯示免疫功能。由于抗體半衰期較長，避免了蛋白質(zhì)類激素在體內(nèi)容易降解而難以在實(shí)際運(yùn)用的不便。但是由于被中和的物質(zhì)通常是內(nèi)源性的，在體內(nèi)不具有免疫原性，所以必須與一個(gè)適當(dāng)?shù)拿庖咝暂d體(一種大分子的內(nèi)源性蛋白)進(jìn)行交聯(lián)，目前常用的有牛血清蛋白(BSA)，人血清蛋白(HSA)等。當(dāng)這種物質(zhì)與載體交聯(lián)后，就要選擇佐劑(維持免疫原性穩(wěn)定釋放并可延長免疫反應(yīng)時(shí)間)來刺激中和循環(huán)物質(zhì)的免疫應(yīng)答，確保免疫產(chǎn)物包含部分針對(duì)靶物質(zhì)的高特異性抗體，發(fā)揮中和體內(nèi)靶物質(zhì)的生物學(xué)作用。免疫調(diào)控技術(shù)利用免疫學(xué)抗原抗體中和反應(yīng)原理實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能的調(diào)控。實(shí)質(zhì)上是通過給予動(dòng)物某種物質(zhì)(影響動(dòng)物生產(chǎn)性能)的外源性抗原或抗體，在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生免疫中和反應(yīng)，消除或減弱內(nèi)源性該種物質(zhì)水平，導(dǎo)致該種物質(zhì)正常的生理效應(yīng)消失或減弱，從而達(dá)到調(diào)控動(dòng)物生產(chǎn)性能的目的。為解決動(dòng)物生產(chǎn)過程中，各種逆境不利條件下導(dǎo)致的采食量低下和生長受阻問題，本發(fā)明利用被動(dòng)免疫技術(shù)，以PYY制備的抗原免疫蛋雞后，利用其所產(chǎn)雞蛋制備成卵黃抗體凍干粉，實(shí)現(xiàn)了既有效利用PYY抗體的生物學(xué)誘食作用，也能部分補(bǔ)充卵黃蛋白，同時(shí)滿足了安全綠色的現(xiàn)代飼料添加劑的需求，成為一種非常有吸引力的生物技術(shù)產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題:本發(fā)明的原理是以PYY和牛血清蛋白偶聯(lián)制備的完全抗原為基礎(chǔ)，通過科學(xué)合理地制定蛋雞免疫程序，在所產(chǎn)雞蛋中提取蛋黃并冷凍干燥后制備成凍干粉，生產(chǎn)條件簡(jiǎn)單，無需特殊昂貴設(shè)備。所以，本發(fā)明的目的是提供一種低成本、高效價(jià)、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，對(duì)畜禽采食量有明顯改善效果的飼料添加劑PYY卵黃抗體的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用PYY、戊二醛、牛血清蛋白、費(fèi)氏不完全佐劑等為原料。其特征包括下列步驟:(I)PYY完全抗原的制備:準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的PYY溶解于裝有PBS溶液的IOOmL燒杯中，稱為A液；準(zhǔn)確稱取4倍PYY質(zhì)量的牛血清蛋白(BSA)同樣溶解于裝有PBS溶液，稱為B液的IOOmL燒杯中。A、B液PBS溶液均滿足一定要求(IOmL0.01M, pH = 7.4)，然后將A液緩慢滴加到B液中，放人磁力攪拌器轉(zhuǎn)子，在攪拌條件下用移液管逐滴加入100 μ L濃度為25%戊二醛溶液，密封燒杯，外層用錫箔紙包裹避光，室溫下反應(yīng)24小時(shí)后，將偶聯(lián)物反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移到透析袋中，4°C下用PBS溶液透析24小時(shí)，中間換液兩次。(2)包被抗原制備:包被抗原制備方法與PYY-BSA完全抗原的制備方法相同，以血藍(lán)蛋白(KLH)為載體蛋白，以戊二醛為交聯(lián)劑制備包被抗原PYY-KLH。(3)免疫程序:選擇300日齡的健康產(chǎn)蛋母雞，按照胸肌多點(diǎn)注射(一般4-6點(diǎn))的方式進(jìn)行免疫，初次免疫抗原劑量為200 μ g/只,初次免疫后每隔15天加強(qiáng)免疫一次,共加強(qiáng)免疫3次，加強(qiáng)免疫抗原劑量均為100 μ g/只。初次免疫時(shí)在抗原中加入等量的弗氏完全佐劑,加強(qiáng)免疫時(shí)則加入等量的弗式不完全佐劑。初次和加強(qiáng)免疫注射劑量均為0.5mL。(4)抗PYY卵黃抗體制備①卵黃樣品前處理:雞蛋打破后，除去卵白和卵黃膜，用注射器取0.3m L卵黃液于離心管中，按照卵黃液:PBS:氯仿=1: I: 2的比例分別加入PBS緩沖液和氯仿，強(qiáng)力振蕩后，室溫靜置lh，然后3500r/min離心15min，取上清液，于_20°C保存待測(cè)。②卵黃粉制備:初次免疫后每周收集雞蛋I次，抗體效價(jià)即達(dá)到1: 1600的第4周開始收集雞蛋，效價(jià)達(dá)到1: 4096 —周后的第7周結(jié)束收集，將所采集的雞蛋無菌分離卵黃，利用冷凍干燥機(jī)制成卵黃粉。③抗體效價(jià)檢測(cè):用間接酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定卵黃中抗體效價(jià)，在酶標(biāo)儀上以450nm波長測(cè)定OD值，從而確定卵黃中PYY的抗體效價(jià)(以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍則為陽性。即待測(cè)卵黃在一定稀釋倍數(shù)下吸光度/陰性卵黃在相同稀釋倍數(shù)下吸光度> 2.1定為陽性)。表IELISA測(cè)得混合卵黃粉抗體效價(jià)
權(quán)利要求
1.一種畜禽飼料添加劑酪酪肽(PYY)卵黃抗體粉的制備方法，步驟包括: (1)PYY完全抗原的制備及鑒定:將PYY與牛血清蛋白偶聯(lián)，制成PYY-BSA偶聯(lián)復(fù)合物(PYY完全抗原)，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)偶聯(lián)情況。
(2)PYY-BSA偶聯(lián)復(fù)合物對(duì)蛋雞的免疫程序及其卵黃抗體制備:將(I)制得的PYY-BSA偶聯(lián)復(fù)合物和弗氏佐劑混勻，充分乳化，制成油乳苗，免疫蛋雞，收集雞蛋，并將含PYY特異性抗體的卵黃液冷凍干燥制成PYY卵黃抗體粉。
2.權(quán)利要求(I)中所述的PYY-BSA偶聯(lián)復(fù)合物的制備，其步驟包括:準(zhǔn)確稱取4mgPYY溶解于裝有IOml0.0lM PBS (pH = 7.4)溶液的IOOml燒杯中，稱為A液；準(zhǔn)確稱取16mg牛血清蛋白(BSA)溶解于裝有IOml0.0lM PBS (pH = 7.4)溶液的IOOml燒杯中，稱為B液。然后將A液緩慢滴加到B液中，放人磁力攪拌器轉(zhuǎn)子，在攪拌條件下用移液管逐滴加入IOOul濃度為25%戊二醛溶液，密封燒杯，外層用錫箔紙包裹避光，室溫下反應(yīng)24小時(shí)。將偶聯(lián)物反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移到透析袋中，4°C下用PBS (pH值7.4)透析24小時(shí)，中間換液兩次。將制備好的完全抗原分裝，_20°C保存?zhèn)溆?。采用SDS-PAGE凝膠電泳方法檢測(cè)偶聯(lián)程度:取少量凍干復(fù)合物，溶于Ph = 7.40.005M PBS，在制好的濃縮膠上，一次每空加入5uL上述物質(zhì)，開始SDS-PAGE凝膠電泳。
3.權(quán)利要求(2)中所述的PYY-BSA偶聯(lián)復(fù)合物與弗氏佐劑混合制備的PYY油乳苗對(duì)蛋雞的免疫程序及利用所產(chǎn)雞蛋提取制備PYY卵黃抗體過程，其步驟包括:選擇300日齡的健康產(chǎn)蛋母雞，按照胸肌多點(diǎn)注射(一般4-6點(diǎn))的方式進(jìn)行免疫，初次免疫抗原劑量為200ug/只，初次免疫后每隔15天加強(qiáng)免疫一次，共加強(qiáng)免疫3次，加強(qiáng)免疫抗原劑量均為IOOug/只。初次免疫時(shí)在抗原中加入等量的弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫時(shí)則加入等量的弗式不完全佐劑。初次和加強(qiáng)免疫注射劑量均為0.5ml。免疫后經(jīng)ELISA檢測(cè)卵黃抗體效價(jià)，呈陽性時(shí)收集雞蛋直至呈陰性時(shí)停止收集，無菌分離卵黃，利用冷凍干燥機(jī)制成卵黃粉。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種畜禽飼料添加劑酪酪肽卵黃抗體粉及其制備方法，該方法生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，使用方便，對(duì)提高動(dòng)物采食量效果明顯，其制備主要包括下列步驟酪酪肽完全抗原的制備、酪酪肽免疫油乳苗的制備和酪酪肽對(duì)蛋雞特異性免疫及其卵黃抗體粉的制備。本發(fā)明方法所制備的酪酪肽卵黃抗體效價(jià)高，維持時(shí)間長，耐保存，安全無毒無污染，符合資源節(jié)約與環(huán)境友好的可持續(xù)性畜牧業(yè)發(fā)展需求。因此，本發(fā)明所制得的酪酪肽卵黃抗體是一種可有效增加食欲，提高采食量，促進(jìn)動(dòng)物生長的安全綠色飼料添加劑產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C07K16/26GK103168924SQ20131005177
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者范志勇, 田啟宇, 李玉蓮, 吳信, 龍次民 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)