一種人IgG4型抗體及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗體及其制備方法與應用，具體涉及一種人IgG4型抗體及其制 備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 機體對自身抗原發(fā)生免疫反應而導致自身組織損傷所引起的疾病稱之為自身 免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic Lupus Erythematosus, SLE)、類風濕關節(jié)炎 (Rheumatoid Arthritis, RA)等，其致病機制主要是由于各種原因誘發(fā)的自身抗原暴露和 釋放，進而被免疫系統(tǒng)的抗原提呈細胞（如樹突狀細胞、巨噬細胞等）識別，提呈給T細 胞，并使之活化，而活化后的T細胞和B細胞相互作用，并促進B細胞的增值、活化及分泌 自身抗體。自身抗體和自身抗原結合，沉積在組織中（如腎臟、皮膚等），進而誘發(fā)補體 活化等級聯(lián)反應，造成組織損傷，這是自身免疫性疾病的核心發(fā)病機制。目前，生物制劑 在自身免疫性疾病中的應用相當廣泛，主要革E標是B和T淋巴細胞（Drug Development Research. 2011，72 (7): 585-597 ;Nat Clin Pract Neurol. 2008, 4 (10): 557-567)以及致炎 性信號分子（如IL-6, TNF-a等）發(fā)揮作用，而靶向自身抗原的生物制劑極少。其主要原 因是自身抗原種類較多，且不同的自身免疫性疾病，其自身抗原的種類也不同，這就為靶向 自身抗原的治療策略增加了難度。
[0003] 機體被外源性抗原致敏后，當再次受到相同抗原刺激時表現(xiàn)出敏感性的增高或反 應性的增強是過敏性疾?。ˋllergic diseases)的發(fā)病特點。決定此類疾病臨床和病理表 現(xiàn)的兩個關鍵因素為：免疫應答的類型和激發(fā)超敏反應抗原的性質及定位。超敏反應可分 為4型，將Ig介導的超敏反應分為I型、II型和III型，而將淋巴細胞介導的超敏反應稱為 IV型。過敏反應的發(fā)生須具備三個條件：第一過敏原的存在；第二致敏機體；第三上述兩者 密切接觸，三者缺一不可。目前，過敏性疾病中應用的生物制劑主要針對IgE，如奧馬佐單抗 (Omalizumab)，祀向過敏原的生物制劑卻極少。其主要原因是過敏原種類較多，且不同的地 區(qū)，不同時間，其過敏原的種類也可能不同，這就為靶向過敏原的治療策略增加了難度。
[0004] 人類抗體根據(jù)其結構的不同，分為五種，即IgG、lgA、lgM、IgD和lgE。其中IgG是 血清中主要的抗體成分，約占血清抗體的80%，其40~50%分布于血清中，其余分布在組 織中，而且IgG的半衰期最長，可達20~23天。根據(jù)IgG分子中的Y鏈抗原性的差異，人 IgG有四個亞型：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。IgG4在正常人體內(nèi)含量極低（4%~6% ) (Eur J Immunol, 1996,26(7) : 1511-1518)，且其鉸鏈區(qū)的氨基酸組成和結構與其他IgG亞型明顯 不同，該區(qū)位于Fab和兩條重鏈C末端（CH2和CH3)之間，這決定了 IgG4分子對Clq和Fey 受體的結合力較低，且不能激活補體的經(jīng)典激活途徑（Exp Med. 1991，173(4) : 1025-1028)。 但IgG4對靶抗原的親和力和其他亞型沒有差異，進而具有封閉抗原表位進而抑制其它亞 型的抗體（如IgGl、IgG2、IgG3和IgE等）免疫復合物的形成；由于不能激活補體的經(jīng)典 激活途徑，從而可避免免疫復合物激活補體造成的組織損傷，也能抑制過敏原-IgE型抗體 免疫復合物活化嗜堿性粒細胞和肥大細胞造成的組織損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術的缺陷而提供一種具有個體或同種疾病特 征的人IgG4型抗體及其制備方法與應用，本發(fā)明的人IgG4型抗體可抑制能與血清補體結 合的免疫復合物的形成。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為：一種人IgG4型抗體的制備方法，包 括以下步驟：
[0007] (1)制備血漿或血清或者漿細胞培養(yǎng)的上清液：采集同種疾病患者的外周血，離 心，制得血漿或血清；或者在同種疾病患者的外周血中加入抗凝劑后，離心分離，獲得外周 血單個核細胞，再采用免疫磁珠分離制得B細胞，最后在體外誘導B細胞為衆(zhòng)細胞，并獲得 漿細胞培養(yǎng)的上清液；
[0008] (2)制備親和層析柱：以溴化氫活化瓊脂糖凝膠，溶脹并抽干活化后的瓊脂糖凝 膠，向其中加入含有抗人IgG4抗體的NaHC0 3溶液，瓊脂糖凝膠與抗人IgG4抗體發(fā)生偶聯(lián) 反應；再以pH值為7. 8~8. 0的緩沖溶液A封閉處理偶聯(lián)了抗人IgG4抗體的瓊脂糖凝膠， 裝柱；最后，依次用pH值為2. 5~3. 0的緩沖溶液B、pH值為7. 2~7. 6的PBS洗柱，得到 以偶聯(lián)了抗人IgG4抗體的瓊脂糖凝膠為固定相的親和層析柱，保存?zhèn)溆茫?br>[0009] (3)純化人IgG4型抗體：將步驟（1)制得的血漿或血清，或者漿細胞培養(yǎng)的上清 液加入步驟（2)制得的親和層析柱中，以pH值為7. 2~7. 6的PBS洗柱，再用pH值為2. 5~ 3. 0的緩沖溶液C洗脫人IgG4型抗體，收集洗脫液，并向其中加入pH值為8. 8~9. 0的緩 沖溶液D將洗脫液中和至pH值為7. 2~7. 4,濃縮中和后所得的溶液進行并進行定量。
[0010] 本發(fā)明采集同種疾病患者（包括同一個體或者患同種疾病的群體）的外周血來制 備血漿或血清，或者漿細胞培養(yǎng)的上清液，并通過親和層析柱進行分離，獲得了具有個體或 者同種疾病特征人IgG4型抗體。其中，本發(fā)明在體外誘導B細胞為漿細胞，可分泌具有個 體或者同種疾病特征的抗體譜，能在體外獲取大量的人IgG4型抗體；本發(fā)明以血漿或血清 制備人IgG4型抗體，制備方法簡單，可滿足對少量人IgG4型抗體的需求。
[0011] 本發(fā)明采用親和層析柱進行分離，分離效果好，特異性高，純化后制得的IgG4型 抗體純度高。
[0012] 作為本發(fā)明所述人IgG4型抗體的制備方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟（1)中，抗 凝劑為￡01八_1( 2或肝素；在同種疾病患者的外周血中加入抗凝劑后，優(yōu)選用淋巴細胞分離液 進行離心分離，獲得外周血單個核細胞；采用免疫磁珠分離制得B細胞時，優(yōu)選免疫磁珠負 選法。
[0013] 作為本發(fā)明所述人IgG4型抗體的制備方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟（1) 中，體外誘導B細胞為漿細胞，并獲得漿細胞培養(yǎng)的上清液的方法包括下述步驟：將 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)完全培養(yǎng)液置于溫度為 37°C、含有 5%二氧 化碳的培養(yǎng)箱中，并將制得的B細胞轉化為漿細胞后于DMEM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)3周，培養(yǎng) 過程中每2~4天更換一次培養(yǎng)液，收集每次更換的培養(yǎng)液上清，即得漿細胞培養(yǎng)的上清 液；其中，所述DMEM完全培養(yǎng)液中含有質量百分比為5~10%的胎牛血清，并加入了細胞 因子和濃度為2~20 yg/mL的美洲商陸絲裂原（PWM);所述細胞因子由下述濃度的組分組 成：20-100ng/mL 白細胞介素-2 (IL-2)、20-200ng/mL 白細胞介素-10 (IL-10)、100-500ng/ 1^〇)401、50-2001^/1111白細胞介素-4(11-4)、50-200叩/1111白細胞介素-13(11-13)和10-100ng/mL白細胞介素-5(IL-5)。
[0014] 作為本發(fā)明所述人IgG4型抗體的制備方法的優(yōu)選實施方式，所述DMEM完全培養(yǎng) 液中還加入下述濃度的抗體：1〇~l〇〇ng/mlanti-IFN-y、10~100ng/mlanti-IL-12、 10-100ng/mlanti-IL-17和10-100ng/mlanti-TGF-0 〇
[0015] 作為本發(fā)明所述人IgG4型抗體的制備方法的優(yōu)選實施方式，所述將制得的B細胞 轉化為漿細胞的方法為：采用永生化技術手段處理制得的B細胞，將B細胞轉化為永生化的 漿細胞。作為本發(fā)明所述人IgG4型抗體的制備方法的更優(yōu)選實施方式，所述永生化技術手 段為通過EB病毒、SV40病毒轉染或者通過構建含端粒酶催化亞基的表達載體轉染。制備 永生化的漿細胞，可獲得大量的IgG4型抗體。
[0016] 作為本發(fā)明所述人IgG4型抗體的制備方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟（2)中， 似110) 3溶液的濃度為0?