一種小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)蛋白TaMAG1166及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)蛋白 TaMAG1166及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥赤霉病是由禾谷鐮刀菌（FusariumgraminearumSchwabe)引起的一種世界范 圍內(nèi)的病害。該病害導(dǎo)致小麥產(chǎn)量大幅度降低并嚴(yán)重影響小麥的品質(zhì)。雖然可以通過(guò)生物 防治和化學(xué)防治的方法來(lái)控制該病害，但利用生物技術(shù)來(lái)培育抗赤霉病品種才是最經(jīng)濟(jì)有 效的方法。
[0003] 水解羥基肉桂酰輔酶A醋類(lèi)蛋白（Hydroxycinnamoyl CoA quinatetransferase, HQT)，能夠控制主要酷類(lèi)復(fù)合物如木質(zhì)素及綠原酸等的生物合成和 流轉(zhuǎn)（Hoffmann et al. (2003)。綠原酸是在植物苯丙烷類(lèi)代謝過(guò)程中，咖啡酸和奎尼酸脂 化而產(chǎn)生的酚類(lèi)化合物，其大量積聚能夠提高酚化物的水平，在植物中扮演抗氧化劑的角 色。綠原酸對(duì)病原真菌，病毒都有毒性，可以抑制多種病原菌的繁殖。木質(zhì)素是苯丙氨酸衍 生的芳香族亞基聚合體，木質(zhì)素的大量合成可以引起細(xì)胞木質(zhì)化程度的提高，阻止大分子 物質(zhì)的入侵，因此，在植物中，木質(zhì)素的存在可以作為微生物侵襲的阻障，增強(qiáng)植物細(xì)胞壁 抗真菌穿透的能力。本發(fā)明的TaMAG1166蛋白是來(lái)源于小麥的水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi) 蛋白，在本發(fā)明提出之前，關(guān)于水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)相關(guān)蛋白及其編碼基因在小麥 抗赤霉病方面的應(yīng)用目前尚未有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種小麥水解羥基肉桂酰輔酶A 酯類(lèi)蛋白TaMAG1166。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供該小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)蛋白TaMAG1166的編 碼基因。
[0006] 本發(fā)明的又一目的是提供編碼基因的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 一種小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)蛋白TaMAG1166,氨基酸序列如SEQ ID N0:2 所示。該蛋白包含443個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為6. 51。
[0009] 所述的小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)蛋白TaMAG1166編碼基因。
[0010] 所述的權(quán)利要求1所述的小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)蛋白TaMAGl 166編碼基 因，優(yōu)選核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0011] 含有小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)蛋白TaMAG1166編碼基因的重組表達(dá)載體。
[0012] 所述的重組表達(dá)載體，優(yōu)選出發(fā)載體為任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中超 量表達(dá)的載體。
[0013] 所述的重組表達(dá)載體，進(jìn)一步優(yōu)選將所述的含小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)蛋 白TaMAG1166編碼基因插入PBI121表達(dá)載體Xbal酶切位點(diǎn)所得。
[0014] 含有本發(fā)明所述基因的微生物細(xì)胞。
[0015]本發(fā)明所述的小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)蛋白TaMAG1166在品種改良中的應(yīng) 用；優(yōu)選所述的基因在提高小麥抗赤霉病中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體在品種改良中的應(yīng)用；優(yōu)選在提高小麥抗赤霉病中的 應(yīng)用。
[0017] 利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中超量表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的小 麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)蛋白基因TaMAGl 166導(dǎo)入植物細(xì)胞，可獲得改變植物赤霉病 抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞進(jìn)行篩選， 可以對(duì)載體進(jìn)行加工，如加入抗生素標(biāo)記基因（如：潮霉素、卡那霉素和慶大霉素），加入抗 生素標(biāo)記基因之后的載體用于轉(zhuǎn)化，可以在轉(zhuǎn)化后的植物培養(yǎng)基中加入抗生素，抑制非轉(zhuǎn) 基因細(xì)胞系和植株的生長(zhǎng)，有助于快速和有效的獲得轉(zhuǎn)基因植株。為了便于觀察外源基因 的表達(dá)，可以在載體中啟動(dòng)子和外源基因之間加入報(bào)告基因（⑶S基因、GFP和熒火蟲(chóng)熒光 素酶報(bào)告基因），構(gòu)建報(bào)告基因和外源基因融合表達(dá)的載體，該載體用于遺傳轉(zhuǎn)化，可以通 過(guò)觀察報(bào)告基因的表達(dá)與否和表達(dá)量高低，推測(cè)外源基因在植物體內(nèi)表達(dá)情況。為了轉(zhuǎn)基 因植物釋放的安全性，也可以構(gòu)建載體時(shí)不攜帶任何篩選標(biāo)記基因，而在苗期進(jìn)行PCR檢 測(cè)。含有本發(fā)明的TaMAG1166表達(dá)載體可通過(guò)使用基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道， 電擊，顯微注射，Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)?；蛑参锊《镜瘸Ｒ?guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并 將轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞培育成完整的植株。被轉(zhuǎn)化的植株材料既可以是雙子葉植物，也可以 是單子葉植物，如：水稻、棉花、小麥、大豆、煙草、擬南芥、大麥、高粱、玉米、黃瓜、番茄、楊 樹(shù)、草坪草、苜蓿等。
[0018] 有益效果：
[0019] 本發(fā)明提供了一種新的小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)蛋白TaMAG1166及其 編碼基因。通過(guò)基因工程的方法將本發(fā)明提供的小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)蛋白 TaMAG1166編碼基因轉(zhuǎn)入小麥中，可以提高小麥的赤霉病抗性。由于該基因是糧食作物小 麥本身存在的內(nèi)源基因，因此，該基因的超量表達(dá)不會(huì)影響植物的食品安全性，可在作物 育種中應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1轉(zhuǎn)基因小麥的PCR檢測(cè)。
[0021] 其中B、C為不同的轉(zhuǎn)基因株系，揚(yáng)麥158表示進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)時(shí)的受體材料，為 進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化的常用基因型，陽(yáng)性對(duì)照為攜帶有小麥水解羥基肉桂酰輔酶A酯類(lèi)蛋白 TaMAGl 166編碼基因的表達(dá)載體。
[0022] 圖2轉(zhuǎn)基因小麥的赤霉病抗性的離體葉片鑒定
[0023] 其中A為轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)受體材料揚(yáng)麥158的葉片，B為攜帶有小麥水解羥基肉桂酰 輔酶A酯類(lèi)蛋白TaMAGl 166基因植株的葉片。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解， 實(shí)施例所描述的僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0025] 實(shí)施例1 :TaMAG1166蛋白的獲得。
[0026] 在抗赤霉病材料望水白開(kāi)花期，將赤霉菌孢子液用噴霧器噴灑到穗部，所用孢子 液為江蘇省范圍內(nèi)強(qiáng)致病力赤霉菌菌株F4、F15、F17及F34的分生孢子混合液，接種后立 即將穗子套上塑料袋，保持濕度，以保證赤霉菌發(fā)病。在接種后6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí) 后分別取麥穗，同時(shí)用水接種做為對(duì)照，取材后立即用液氮冷凍。取700mg凍存的麥穗，加 入70 11^的？￥?于液氮中磨成粉末，加入51^10%三氯醋酸/丙酮振蕩混勻、-201：沉淀1小 時(shí)；4°C 15,000g離心15min，沉淀重新懸浮于5mL冷丙酮中，-