檢樣品的制備
采用試劑盒提取法制備待檢樣品基因組DNA
檢測菌種B型肉毒梭狀芽孢桿菌{Clostridium botuIinum B)來源于中國醫(yī)學細菌保藏管理中心，編號CMCC64304。使用北京天根生物工程公司生產的細菌基因組提取試劑盒提取樣品基因組DNA。
[0015]步驟三，進行環(huán)介導恒溫擴增反應
(1)取2μ L待檢樣品DNA溶液，加入19 μ L反應液1、3 μ L反應液2、I μ L 8U/μ L BstDNA聚合酶，反應體系總體積25 μ L ;
(2)將配置好的反應體系在65°C下擴增反應50-70min后取出待檢。
[0016]步驟四，分析判斷反應結果
在反應產物中加入I μ L顯色劑，混勻，靜置2min，肉眼觀察顏色變化，反應液顏色變?yōu)榫G色，說明待檢菌株為B型肉毒梭狀芽孢桿菌。
[0017]實施例2 陰性對照步驟一，引物的設計、合成試劑盒的組裝本實施例確定用于檢測的弓I物序列同實施例1。
[0018]在此基礎上設計用于B型肉毒梭狀芽孢桿菌環(huán)介導恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，該試劑盒包括以下試劑:
(1)反應液1:10mmol/L脫氧核苷三磷酸(dNTP)、10XThermoPol Buffer反應緩沖液、150mmol/L硫酸鎂(MgS04)、5mol/L甜菜堿和滅菌雙蒸水(ddH20)；
(2)反應液2:10ymol/L 外引物 I (F3)、10 μ mol/L 外引物 2 (Β3)、40 μ mol/L 內引物I (FIP)和 40 μ mol/L 內引物 2 (BIP)；
(3)8U/y L Bst DNA 聚合酶；
(4)顯色劑:質量濃度為10%的SYBRGreen I熒光染料；
上述環(huán)介導恒溫基因擴增快速檢測試劑盒中反應液I折合每樣品19yL，其組成為:10mmol/L 脫氧核苷三磷酸(dNTP) 4 μ L、10X ThermoPol Buffer 反應緩沖液 2.5 μ L、150mmol/L硫酸鎂(MgSO4) I μ L、5mol/L甜菜堿5 μ L和滅菌雙蒸水(ddH20)6.5 μ L ;反應液2折合每樣品3 μ L，其組成為:10 μ mol/L外引物I (F3)0.5 μ L、10 μ mol/L外引物2 (B3)
0.5 μ L、40 μ mol/L 內弓丨物 I (FIP) I μ L 和 40 μ mol/L 內弓丨物 2 (BIP)IyL0
[0019]步驟二，待檢樣品的制備
采用試劑盒提取法制備待檢樣品基因組DNA
使用北京天根生物工程公司生產的細菌基因組提取試劑盒提取A型肉毒梭狀芽孢桿菌、E型肉毒梭狀芽胞桿菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和腸炎沙門氏菌等7種細菌的基因組DNA。
[0020]步驟三，進行環(huán)介導恒溫擴增反應
(1)取2μ L待檢樣品DNA溶液，加入19 μ L反應液1、3 μ L反應液2、I μ L 8U/μ L BstDNA聚合酶，反應體系總體積25 μ L ;
(2)將配置好的反應體系在65°C下擴增反應50-70min后取出待檢。
[0021]步驟三，分析判斷反應結果
在反應產物中加入I μ L顯色劑，混勻，靜置2min，肉眼觀察顏色變化，若反應液顯現(xiàn)綠色即為陽性，橙色則為陰性。
[0022]如圖1所示，編號為1-8的反應管分別對應A型肉毒梭狀芽孢桿菌、B型肉毒梭狀芽孢桿菌、E型肉毒梭狀芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和腸炎沙門氏菌。
[0023]所述的實施例1與實施例2中各陰性對照組比較，實施例1中產生陽性擴增結果，如圖1中2號反應管，而不攜帶如/7?/Β基因的實施例2陰性對照菌株沒有產生陽性擴增結果，如圖1中I號、3-8號反應管，從而證明本試劑盒及檢測方法具有較強的特異性，對不攜帶bon.基因的其他菌株不會產生假陽性結果。
[0024]SEQUENCE LISTING〈110〉河南師范大學
〈120〉B型肉毒梭狀芽孢桿菌環(huán)介導恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法 〈160〉 4
<170> PatentIn vers1n 3.3 〈210〉 I 〈211〉 19 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 I
gtgttccact cgaagagtt19
〈210〉 2
〈211〉 21
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 2
catattctgg gcaaaacttc a21
〈210〉 3
〈211〉 43
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 3
ttcgctccac ttctcctgga caaacattgc tagtgtaact gtt43
〈210〉 4
〈211〉 43
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 4
acctgggcca gttttaaatg aaaattatac ccccgaagcc ttc43
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理，主要特征和優(yōu)點，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明的范圍。
【主權項】
1.一種B型肉毒梭狀芽孢桿菌環(huán)介導恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，其特征在于包括以下試劑: (1)反應液1:10mmol/L脫氧核苷三磷酸、1XThermoPol Buffer反應緩沖液、150mmol/L硫酸鎂、5mol/L甜菜堿和滅菌雙蒸水； (2)反應液2:10ymol/L外引物UlOymol/L外引物2、40ymol/L內引物I和40ymol/L內引物2，引物序列如下: 外引物 1:GTGTTCCACTCGAAGAGTT 外引物 2:CATATTCTGGGCAAAACTTCA內引物 1:TTCGCTCCACTTCTCCTGGACAAACATTGCTAGTGTAACTGTT內引物 2:ACCTGGGCCAGTTTTAAATGAAAATTATACCCCCGAAGCCTTC ； (3)8U/y L Bst DNA 聚合酶； (4)顯色劑:質量濃度為10%的SYBRGreen I熒光染料； 上述環(huán)介導恒溫基因擴增快速檢測試劑盒中反應液I折合每樣品19yL，其組成為:.10mmol /I,脫氧核苷三憐酸 4 μ L、10 X ThermoPol Buffer 反應緩沖液 2.5 μ L、1 SOmmoI /I,硫酸鎂I μ L、5mol/L甜菜堿5 μ L和滅菌雙蒸水6.5 μ L ;反應液2折合每樣品3 μ L，其組成為:10ymol/L 外引物 I 0.5 μ L、10 μ mol/L 外引物 2 0.5 μ L、40 μ mol/L 內引物 I I μ L 和40ymol/L 內引物 2 I μ L。
2.—種權利要求1所述的B型肉毒梭狀芽孢桿菌環(huán)介導恒溫基因擴增快速檢測方法，其特征在于包括如下步驟: 步驟一、提取待檢樣品的基因組DNA ； 步驟二、環(huán)介導恒溫擴增反應，取2 μ L待檢樣品DNA溶液，加入19 μ L反應液1、3 μ L反應液2和I μ L 8U/ μ L Bst DNA聚合酶，反應體系總體積25 μ L，將配置好的反應體系在.65 °C下擴增反應50-70min后取出待檢； 步驟三、分析判斷反應結果，在反應產物中加入I μ L顯色劑，混勻，靜置2min，若反應液顯現(xiàn)綠色即為陽性，橙色則為陰性。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種B型肉毒梭狀芽孢桿菌環(huán)介導恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法，其中試劑盒借助生物信息平臺進行大規(guī)?；蚪M分析，根據(jù)B型肉毒梭狀芽孢桿菌的產毒素基因設計了四條特異性引物，結合LAMP技術，針對B型肉毒梭狀芽孢桿菌建立了快速靈敏準確的檢測方法，并構建用于該方法的快速檢測試劑盒。使用本發(fā)明的快速檢測試劑盒和檢測方法，在反應后可通過肉眼觀察鑒定，無需電泳等其他任何分析步驟，具有檢測時間短、特異性強、儀器設備要求低、操作簡便等優(yōu)點，可用于食品、臨床及環(huán)境等樣品的安全快速檢測。
【IPC分類】C12Q1-68, C12Q1-04, C12R1-145
【公開號】CN104561263
【申請?zhí)枴緾N201410676213
【發(fā)明人】姜曉冰, 于濤, 李麗, 周春娥, 張來蘋, 周丹蕾, 張瑞生
【申請人】河南師范大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年11月24日