油體蛋白、人造油體以及穩(wěn)定油體結(jié)構(gòu)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及油體蛋白、人造油體以及穩(wěn)定油體結(jié)構(gòu)的方法。更具體地，本申請(qǐng)涉及 突變油體蛋白、包含該突變油體蛋白的人造油體以及通過(guò)改變油體粒徑和/或設(shè)計(jì)油體蛋 白突變來(lái)改變油體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂類物質(zhì)是植物儲(chǔ)存能量的主要方式，而種子中的脂類物質(zhì)一般以三酰甘油 (TAG)的形式存在。種子中的TAG分子之間不是彼此聚合的，而是分散成許多小的穩(wěn)定的亞 細(xì)胞微滴，該微滴被稱為油體。
[0003] 油體有自身的結(jié)構(gòu)和特征，是種子中獨(dú)特的一類細(xì)胞器。油體內(nèi)部為液態(tài)TAG，夕卜 部是由一層磷脂分子及油體蛋白組成的半單位膜。油體的直徑范圍為〇. 5至2. 0ym，其成 分包括：（1) 92%至98%的中性脂類，其主要為T(mén)AG，約占95% ; (2) 1%至4%的磷脂（PL)，其 主要為磷脂酰膽堿，約占PL的60%至70% ;和（3) 1%至4%的油體蛋白（如8〇111'.(：.1'狀11. Integralproteinsinplantoilbodies.ISRNBotany2012:173954)，其中的憐脂分子可 以為磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸等化合物中的一種或多種，也 可以為包含上述磷脂分子的組合物，如復(fù)合磷脂(包括但不限于大豆磷脂)，或卵磷脂。
[0004] 油體蛋白鑲嵌在油體表面，對(duì)維持油體的穩(wěn)定極為重要，能夠在空間上阻礙油體 單元之間相互聚合。不同植物來(lái)源的油體蛋白具有相同的結(jié)構(gòu)特性，即都具有3個(gè)基本的 結(jié)構(gòu)域。第一個(gè)結(jié)構(gòu)域是N端40至60個(gè)氨基酸組成的兩親性區(qū)域，其兼具親水性和親脂 性，分布于油體朝向胞漿的一側(cè)。第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是中間約50個(gè)氨基酸組成的高度疏水區(qū) 域。據(jù)推測(cè)，該區(qū)域?yàn)樯烊隩AG基質(zhì)中的反式平行的￠-折疊結(jié)構(gòu)，頂部具有由3個(gè)脯氨 酸和1個(gè)絲氨酸組成的"脯氨酸結(jié)"，該脯氨酸結(jié)的氨基酸結(jié)構(gòu)為PX5SPX3P。這一區(qū)域，尤 其是"脯氨酸結(jié)"，在不同來(lái)源的油體蛋白中高度保守，維持其特殊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，對(duì)油體蛋白 革巴向形成油體有重要意義（CijsJ.H.vanRooijenandMauriceM.Moloney.Structural RequirementsofOleosinDomainsforSubcellularTargetingtotheOilBodyPlant Physiol. 1995:109,1353-1361)。第三個(gè)結(jié)構(gòu)域是C端33至40個(gè)氨基酸組成的a-螺旋 結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域兼具親水和親脂性，其帶正電荷的基團(tuán)朝向PL層帶負(fù)電荷的部分，帶負(fù) 電荷的部分朝向油體表面（GitteI.Frandsenetal.Oilbodiesandtheirassociated proteins,oleosinandcaleosin.PhysiologiaPlantarum2001:112,301 - 307)。
[0005] 將目前利用細(xì)菌表達(dá)的油體蛋白或天然的油體蛋白、TAG和磷脂按照比例混合，體 外合成人造油體的技術(shù)已經(jīng)得到了很大的發(fā)展。人造油體表達(dá)系統(tǒng)可用于開(kāi)發(fā)、合成及純 化外源蛋白質(zhì)，如醫(yī)藥、保健、營(yíng)養(yǎng)所需的蛋白質(zhì)等。將經(jīng)重組的油體蛋白與適當(dāng)比例的TAG 和磷脂混合，經(jīng)超聲波振動(dòng)即可形成人造油體。
[0006] 為了最大限度地提高人造油體的利用率，減少蛋白浪費(fèi)，需要提高油體結(jié)構(gòu)的穩(wěn) 定性。
[0007]JasonT.C(JasonT.C.Tzen.Integralproteinsinplantoilbodies.ISRN Botany2012:173954)中指出，改變油與油體蛋白的比例，能夠改變油體粒徑；越少的油體蛋 白加入，油體的粒徑就越大。但該文章并沒(méi)有指出這種相關(guān)性的準(zhǔn)確的比例及范圍。蛋白 量加入到一定的時(shí)候，再增加蛋白量，反而會(huì)使整個(gè)體系的穩(wěn)定性發(fā)生變化，尤其粒徑會(huì)產(chǎn) 生非線性變化。
[0008]Chi-ChungPengCChi-ChungPengetal,Minimizingthecentralhydrophobic domaininoleosinfortheconstitutionofartificialoilbodies.JAgricFood Chem. 2007:11，：5604-10.)中利用定點(diǎn)突變，通過(guò)截?cái)嗷蛐蛄衼?lái)改變油體蛋白的結(jié)構(gòu)，以 求在功能不變的情況下縮短基因序列。但是，突變后的花生油體蛋白并沒(méi)有出現(xiàn)優(yōu)于未突 變的蛋白的性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本領(lǐng)域亟需一種能夠提高油體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的方法，從而提高人造油體的利用率， 減少蛋白浪費(fèi)。
[0010] 在第一方面，提供了一種突變油體蛋白，其脯氨酸結(jié)的第7位點(diǎn)的絲氨酸（S)替換 為脯氨酸(P)。
[0011] 在第二方面，提供了一種人造油體，其包含第一方面的突變油體蛋白。
[0012] 在第三方面，提供了一種控制人造油體的粒徑的方法，包括將油體蛋白、油脂以 及磷脂混合，優(yōu)選地，所述油體蛋白占混合物的總摩爾比2%-58%，2. 5%-50%，3%-13%或 4. 53-12. 41%,
[0013] 可選擇地，油脂占混合物的總摩爾比22%-97. 9%，37. 7-95%，86-92%，或 87. 27-91. 01% ；
[0014] 可選擇地，磷脂占混合物的總摩爾比為0. 1%-20%，或0. 1%-12. 3%，0. 2%-1%，或 0. 31-0. 32% ；
[0015] 優(yōu)選的，所述油體蛋白、油脂、磷脂的摩爾比例為：（2-58) : (22-97. 9) : (0. 1-20)， 優(yōu)選為（2. 5-50) : (37. 7-95) : (0? 1-12. 3)，優(yōu)選為（3-13) : (86-92) : (0? 2-1)，更優(yōu)選為（4. 53-12. 41) : (87. 27-91. 01) : (0. 31-0. 32) 〇
[0016] 在第四方面，提供了一種提高人造油體的穩(wěn)定性的方法，包括將第一方面的突變 花生油體蛋白與油脂和任選的磷脂混合。
[0017] 本公開(kāi)通過(guò)在體外構(gòu)建人造油體，得到了人造油體結(jié)構(gòu)粒徑變化的線性范圍，使 人造油體結(jié)構(gòu)在一個(gè)可控范圍內(nèi)，從而起到穩(wěn)定人造油體結(jié)構(gòu)的作用。
[0018] 本公開(kāi)還將油體蛋白進(jìn)行了定向突變，將脯氨酸結(jié)上的絲氨酸突變?yōu)楦彼?，?此將人造油體結(jié)構(gòu)維持更持久，從而能夠提高油體蛋白的性能，減少蛋白的浪費(fèi)。
[0019] 在第五方面，提供了一種人造油體，其粒徑范圍為4.41ilm至1.85ilm。在一些實(shí) 施方案中所述人造油體通過(guò)本申請(qǐng)第三方面或第四方面所述的方法控制油體粒徑和/或 提高油體穩(wěn)定性而制備的。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1示出不同油體蛋白的電泳圖，其中，泳道1 :芝麻油體蛋白0.ImMIPTG誘導(dǎo)3h 上清；泳道2 :芝麻油體蛋白0.ImMIPTG誘導(dǎo)3h沉淀；泳道3 :花生油體蛋白0. 5mMIPTG 誘導(dǎo)3h上清；泳道4 :花生油體蛋白0.5mMIPTG誘導(dǎo)3h沉淀；泳道5:大豆油體蛋白0.ImM IPTG20度過(guò)夜誘導(dǎo)上清；泳道6:大豆油體蛋白0.ImMIPTG20°C過(guò)夜誘導(dǎo)沉淀；泳道7 :棕 櫚油體蛋白〇.5mMIPTG誘導(dǎo)3h上清；泳道8 :棕櫚油體蛋白0. 5mMIPTG誘導(dǎo)3h沉淀；泳 道9:0. 5mMIPTG誘導(dǎo)空質(zhì)粒PET28a;M為分子量標(biāo)記。箭頭指向目的蛋白條帶。
[0021] 圖2示出大腸桿菌表達(dá)出來(lái)的160iig和320iig芝麻、花生和大豆油體蛋白與 200yg的磷脂以及15mg的五類油脂混合得到的人造油體直徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有花生油與花 生油體形成的人造油體，對(duì)蛋白量的變化最敏感：蛋白量增加一倍，油體粒徑減小了一半左 右。
[0022] 圖3示出人造油體的粒徑測(cè)試結(jié)果。在花生油體蛋白添加量在80iig到240iig 的范圍內(nèi)，隨著蛋白量的增加，粒徑呈線性縮小，蛋白添加量320yg時(shí)，人造油體的粒徑略 有增加，但在蛋白添加量為480iig時(shí)，人造油體的粒徑進(jìn)一步縮小。
[0023] 圖4示出花生油體蛋白添加量與人造油體的粒徑的線性關(guān)系。
[0024] 圖5示出花生油體蛋白添加量在80iig到240iig(4%到12%的摩爾百分比)的范 圍內(nèi)與人造油體的粒徑的線性關(guān)系。
[0025] 圖6出人造油體的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果。在蛋白添加量在80iig、120iig、160iig、 200iig和240iig(4%到12%的摩爾百分比）的范圍內(nèi)，隨著蛋白量的增加，其結(jié)構(gòu)乳化特 性更好。
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