油體蛋白、人造油體以及穩(wěn)定油體結(jié)構(gòu)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及油體蛋白、人造油體以及穩(wěn)定油體結(jié)構(gòu)的方法。更具體地,本申請(qǐng)涉及 突變油體蛋白、包含該突變油體蛋白的人造油體以及通過(guò)改變油體粒徑和/或設(shè)計(jì)油體蛋 白突變來(lái)改變油體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂類物質(zhì)是植物儲(chǔ)存能量的主要方式,而種子中的脂類物質(zhì)一般以三酰甘油 (TAG)的形式存在。種子中的TAG分子之間不是彼此聚合的,而是分散成許多小的穩(wěn)定的亞 細(xì)胞微滴,該微滴被稱為油體。
[0003] 油體有自身的結(jié)構(gòu)和特征,是種子中獨(dú)特的一類細(xì)胞器。油體內(nèi)部為液態(tài)TAG,夕卜 部是由一層磷脂分子及油體蛋白組成的半單位膜。油體的直徑范圍為〇. 5至2. 0ym,其成 分包括:(1) 92%至98%的中性脂類,其主要為T(mén)AG,約占95% ; (2) 1%至4%的磷脂(PL),其 主要為磷脂酰膽堿,約占PL的60%至70% ;和(3) 1%至4%的油體蛋白(如8〇111'.(:.1'狀11. Integralproteinsinplantoilbodies.ISRNBotany2012:173954),其中的憐脂分子可 以為磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸等化合物中的一種或多種,也 可以為包含上述磷脂分子的組合物,如復(fù)合磷脂(包括但不限于大豆磷脂),或卵磷脂。
[0004] 油體蛋白鑲嵌在油體表面,對(duì)維持油體的穩(wěn)定極為重要,能夠在空間上阻礙油體 單元之間相互聚合。不同植物來(lái)源的油體蛋白具有相同的結(jié)構(gòu)特性,即都具有3個(gè)基本的 結(jié)構(gòu)域。第一個(gè)結(jié)構(gòu)域是N端40至60個(gè)氨基酸組成的兩親性區(qū)域,其兼具親水性和親脂 性,分布于油體朝向胞漿的一側(cè)。第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是中間約50個(gè)氨基酸組成的高度疏水區(qū) 域。據(jù)推測(cè),該區(qū)域?yàn)樯烊隩AG基質(zhì)中的反式平行的¢-折疊結(jié)構(gòu),頂部具有由3個(gè)脯氨 酸和1個(gè)絲氨酸組成的"脯氨酸結(jié)",該脯氨酸結(jié)的氨基酸結(jié)構(gòu)為PX5SPX3P。這一區(qū)域,尤 其是"脯氨酸結(jié)",在不同來(lái)源的油體蛋白中高度保守,維持其特殊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),對(duì)油體蛋白 革巴向形成油體有重要意義(CijsJ.H.vanRooijenandMauriceM.Moloney.Structural RequirementsofOleosinDomainsforSubcellularTargetingtotheOilBodyPlant Physiol. 1995:109,1353-1361)。第三個(gè)結(jié)構(gòu)域是C端33至40個(gè)氨基酸組成的a-螺旋 結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域兼具親水和親脂性,其帶正電荷的基團(tuán)朝向PL層帶負(fù)電荷的部分,帶負(fù) 電荷的部分朝向油體表面(GitteI.Frandsenetal.Oilbodiesandtheirassociated proteins,oleosinandcaleosin.PhysiologiaPlantarum2001:112,301 - 307)。
[0005] 將目前利用細(xì)菌表達(dá)的油體蛋白或天然的油體蛋白、TAG和磷脂按照比例混合,體 外合成人造油體的技術(shù)已經(jīng)得到了很大的發(fā)展。人造油體表達(dá)系統(tǒng)可用于開(kāi)發(fā)、合成及純 化外源蛋白質(zhì),如醫(yī)藥、保健、營(yíng)養(yǎng)所需的蛋白質(zhì)等。將經(jīng)重組的油體蛋白與適當(dāng)比例的TAG 和磷脂混合,經(jīng)超聲波振動(dòng)即可形成人造油體。
[0006] 為了最大限度地提高人造油體的利用率,減少蛋白浪費(fèi),需要提高油體結(jié)構(gòu)的穩(wěn) 定性。
[0007]JasonT.C(JasonT.C.Tzen.Integralproteinsinplantoilbodies.ISRN Botany2012:173954)中指出,改變油與油體蛋白的比例,能夠改變油體粒徑;越少的油體蛋 白加入,油體的粒徑就越大。但該文章并沒(méi)有指出這種相關(guān)性的準(zhǔn)確的比例及范圍。蛋白 量加入到一定的時(shí)候,再增加蛋白量,反而會(huì)使整個(gè)體系的穩(wěn)定性發(fā)生變化,尤其粒徑會(huì)產(chǎn) 生非線性變化。
[0008]Chi-ChungPengCChi-ChungPengetal,Minimizingthecentralhydrophobic domaininoleosinfortheconstitutionofartificialoilbodies.JAgricFood Chem. 2007:11,:5604-10.)中利用定點(diǎn)突變,通過(guò)截?cái)嗷蛐蛄衼?lái)改變油體蛋白的結(jié)構(gòu),以 求在功能不變的情況下縮短基因序列。但是,突變后的花生油體蛋白并沒(méi)有出現(xiàn)優(yōu)于未突 變的蛋白的性能。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 本領(lǐng)域亟需一種能夠提高油體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的方法,從而提高人造油體的利用率, 減少蛋白浪費(fèi)。
[0010] 在第一方面,提供了一種突變油體蛋白,其脯氨酸結(jié)的第7位點(diǎn)的絲氨酸(S)替換 為脯氨酸(P)。
[0011] 在第二方面,提供了一種人造油體,其包含第一方面的突變油體蛋白。
[0012] 在第三方面,提供了一種控制人造油體的粒徑的方法,包括將油體蛋白、油脂以 及磷脂混合,優(yōu)選地,所述油體蛋白占混合物的總摩爾比2%-58%,2. 5%-50%,3%-13%或 4. 53-12. 41%,
[0013] 可選擇地,油脂占混合物的總摩爾比22%-97. 9%,37. 7-95%,86-92%,或 87. 27-91. 01% ;
[0014] 可選擇地,磷脂占混合物的總摩爾比為0. 1%-20%,或0. 1%-12. 3%,0. 2%-1%,或 0. 31-0. 32% ;
[0015] 優(yōu)選的,所述油體蛋白、油脂、磷脂的摩爾比例為:(2-58) : (22-97. 9) : (0. 1-20), 優(yōu)選為(2. 5-50) : (37. 7-95) : (0? 1-12. 3),優(yōu)選為(3-13) : (86-92) : (0? 2-1),更優(yōu)選為(4. 53-12. 41) : (87. 27-91. 01) : (0. 31-0. 32) 〇
[0016] 在第四方面,提供了一種提高人造油體的穩(wěn)定性的方法,包括將第一方面的突變 花生油體蛋白與油脂和任選的磷脂混合。
[0017] 本公開(kāi)通過(guò)在體外構(gòu)建人造油體,得到了人造油體結(jié)構(gòu)粒徑變化的線性范圍,使 人造油體結(jié)構(gòu)在一個(gè)可控范圍內(nèi),從而起到穩(wěn)定人造油體結(jié)構(gòu)的作用。
[0018] 本公開(kāi)還將油體蛋白進(jìn)行了定向突變,將脯氨酸結(jié)上的絲氨酸突變?yōu)楦彼?,?此將人造油體結(jié)構(gòu)維持更持久,從而能夠提高油體蛋白的性能,減少蛋白的浪費(fèi)。
[0019] 在第五方面,提供了一種人造油體,其粒徑范圍為4.41ilm至1.85ilm。在一些實(shí) 施方案中所述人造油體通過(guò)本申請(qǐng)第三方面或第四方面所述的方法控制油體粒徑和/或 提高油體穩(wěn)定性而制備的。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1示出不同油體蛋白的電泳圖,其中,泳道1 :芝麻油體蛋白0.ImMIPTG誘導(dǎo)3h 上清;泳道2 :芝麻油體蛋白0.ImMIPTG誘導(dǎo)3h沉淀;泳道3 :花生油體蛋白0. 5mMIPTG 誘導(dǎo)3h上清;泳道4 :花生油體蛋白0.5mMIPTG誘導(dǎo)3h沉淀;泳道5:大豆油體蛋白0.ImM IPTG20度過(guò)夜誘導(dǎo)上清;泳道6:大豆油體蛋白0.ImMIPTG20°C過(guò)夜誘導(dǎo)沉淀;泳道7 :棕 櫚油體蛋白〇.5mMIPTG誘導(dǎo)3h上清;泳道8 :棕櫚油體蛋白0. 5mMIPTG誘導(dǎo)3h沉淀;泳 道9:0. 5mMIPTG誘導(dǎo)空質(zhì)粒PET28a;M為分子量標(biāo)記。箭頭指向目的蛋白條帶。
[0021] 圖2示出大腸桿菌表達(dá)出來(lái)的160iig和320iig芝麻、花生和大豆油體蛋白與 200yg的磷脂以及15mg的五類油脂混合得到的人造油體直徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn),只有花生油與花 生油體形成的人造油體,對(duì)蛋白量的變化最敏感:蛋白量增加一倍,油體粒徑減小了一半左 右。
[0022] 圖3示出人造油體的粒徑測(cè)試結(jié)果。在花生油體蛋白添加量在80iig到240iig 的范圍內(nèi),隨著蛋白量的增加,粒徑呈線性縮小,蛋白添加量320yg時(shí),人造油體的粒徑略 有增加,但在蛋白添加量為480iig時(shí),人造油體的粒徑進(jìn)一步縮小。
[0023] 圖4示出花生油體蛋白添加量與人造油體的粒徑的線性關(guān)系。
[0024] 圖5示出花生油體蛋白添加量在80iig到240iig(4%到12%的摩爾百分比)的范 圍內(nèi)與人造油體的粒徑的線性關(guān)系。
[0025] 圖6出人造油體的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果。在蛋白添加量在80iig、120iig、160iig、 200iig和240iig(4%到12%的摩爾百分比)的范圍內(nèi),隨著蛋白量的增加,其結(jié)構(gòu)乳化特 性更好。
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