專利名稱：重組豬α型干擾素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組豬α型干擾素(interferon，IFN)的研制方法及過(guò)程。系將帶有豬α型IFN基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并使其高效表達(dá)豬α型IFN，經(jīng)純化后加入適量豬血漿白蛋白穩(wěn)定劑凍干制成，用于治療豬病毒性腹瀉和流行性感冒等病毒性疾病。研制及檢定的標(biāo)準(zhǔn)均采用國(guó)家SFDA認(rèn)證的重組人α型IFN(中國(guó)生物制品規(guī)程中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)編2000版)作為參比并實(shí)施。

背景技術(shù)：
豬病毒性疾病是當(dāng)前嚴(yán)重制約豬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病。全年均有發(fā)生，如豬病毒性腹瀉、流行性感冒等。這些動(dòng)物一旦感染發(fā)病，則有起病急，臨床癥狀嚴(yán)重，極易傳播擴(kuò)散，以及病死率和死亡率均較高的特點(diǎn)，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失；更為重要的是，豬與人類密切接觸，某些動(dòng)物病毒性傳染病還給人類健康帶來(lái)潛在威脅。目前對(duì)豬病毒性疾病的預(yù)防和治療途徑主要是通過(guò)疫苗接種和使用抗生素。但由于養(yǎng)殖環(huán)境不完善，病毒變異以及機(jī)體抵抗力變化等原因，使傳統(tǒng)的預(yù)防和治療途徑受到了巨大挑戰(zhàn)，大部分抗生素類藥物以及傳統(tǒng)的口服抗病毒藥物，由于藥物殘留問(wèn)題，給人類健康帶來(lái)負(fù)面影響；而傳統(tǒng)的疫苗，由于它的高特異性及副作用，無(wú)法抵抗病毒變異和新型病毒的不斷出現(xiàn)給豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的巨大危害。因此，積極治療家禽、家畜病毒病將是人類最為關(guān)注的問(wèn)題。
IFN是一類病毒感染誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，1957年Issacs和Lindeman首先發(fā)現(xiàn)，它是一類多功能的細(xì)胞因子，與細(xì)胞受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種特異性蛋白質(zhì)和酶類，主要通過(guò)抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄和降解病毒RNA來(lái)抑制病毒的生長(zhǎng)繁殖及發(fā)揮抗腫瘤等的活性。按照IFN的產(chǎn)生細(xì)胞、生化特征及在機(jī)體免疫方面所發(fā)揮的作用不同，分為α、β、γ三類?，F(xiàn)已知，α型IFN在體內(nèi)可有選擇性地作用于病毒等感染細(xì)胞，通過(guò)抑制受染細(xì)胞內(nèi)的病毒蛋白質(zhì)的生物合成，發(fā)揮廣譜和高效抗病毒作用。但對(duì)正常宿主細(xì)胞無(wú)作用或作用微弱。豬IFN是一類能誘導(dǎo)豬細(xì)胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的細(xì)胞因子，主要用于豬流行性腹瀉和豬流行性感冒等病毒性疾病的防治，特別是和豬用其它細(xì)胞因子協(xié)同使用時(shí)，效果更佳。因此，IFN是當(dāng)今應(yīng)用前景廣闊的重要生物制劑之一。
目前，國(guó)內(nèi)最早應(yīng)用于獸醫(yī)臨床的是豬白細(xì)胞IFN，但采用血細(xì)胞分離的方法獲得的白細(xì)胞IFN成本較高，血源易被污染，很難進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。而采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組豬α型IFN除可避免上述弊端外，尚有純度高，成本低，可規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，具有廣闊的市場(chǎng)前景。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組豬α型干擾素的制備方法，是將豬α型IFN基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使其高效表達(dá)豬α型IFN，經(jīng)純化后除菌、分裝和凍干等工藝制成，是一種廣譜抗病毒制劑，主治豬病毒性腹瀉和流行性感冒等病毒性疾病。
本發(fā)明技術(shù)方案如下 重組豬α型干擾素的制備方法，其特征是進(jìn)行以下步驟 (1)、構(gòu)建克隆載體 目的基因?yàn)? TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA 特異性引物上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA 下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC 克隆載體pMD18-T simple vector (2)、構(gòu)建表達(dá)載體 表達(dá)載體pET-28a，或者pGEX-5X (3)、重組蛋白的表達(dá) 挑取載體構(gòu)建成功的重組表達(dá)菌進(jìn)行擴(kuò)增、放大培養(yǎng)，并加入誘導(dǎo)劑低溫誘導(dǎo)表達(dá)； (4)、鑒定重組蛋白 應(yīng)用抗α型干擾素參考血清做中和實(shí)驗(yàn)，證明型別無(wú)誤； (5)、純化重組蛋白，得到粗制品干擾素。
所述的重組豬α型干擾素的制備方法，其特征在于具體步驟為 (1)、構(gòu)建克隆載體 目的基因 TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA 特異性引物序列上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA 下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC 用特異性引物PCR擴(kuò)增豬α型干擾素的目的基因后，將目的基因克隆于pMD18-T simple vector至并轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌涂LB培養(yǎng)基平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，取白色樣的克隆菌進(jìn)行目的基因PCR驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)行雙酶切鑒定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將PCR和雙酶切均陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行目的基因測(cè)序； (2)、構(gòu)建表達(dá)載體 鑒定后選擇與目的基因一致的克隆菌進(jìn)行雙酶切后，與表達(dá)載體pET-28a或者pGEX-5X進(jìn)行連接，并相應(yīng)轉(zhuǎn)化至BL-21大腸桿菌，分別進(jìn)行培養(yǎng)，鑒定出表達(dá)載體構(gòu)建成功的重組表達(dá)菌； (3)、重組蛋白的表達(dá) 分別挑取與pET-28a或者pGEX-5X表達(dá)載體連接的重組表達(dá)菌進(jìn)行小量擴(kuò)增、放大培養(yǎng)，加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG，低溫誘導(dǎo)表達(dá)，收集細(xì)菌； (4)、鑒定重組蛋白 應(yīng)用抗α型干擾素參考血清做中和實(shí)驗(yàn)，證明型別無(wú)誤； (5)、純化重組蛋白，得到粗制品干擾素。
所述的重組豬α型干擾素的制備方法，其特征在于更為詳細(xì)的步驟為 (1)、構(gòu)建克隆載體 豬α型IFN的目的基因?yàn)? TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA 特異性引物序列上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA 下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC 用特異性引物PCR擴(kuò)增豬α型IFN的目的基因后，將目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector至并轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌涂LB培養(yǎng)基平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，取白色樣的克隆菌進(jìn)行目的基因PCR驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)行雙酶切鑒定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將PCR和雙酶切均陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行目的基因測(cè)序； (2)、構(gòu)建表達(dá)載體 鑒定后選擇與目的基因一致的克隆菌進(jìn)行雙酶切后，與表達(dá)載體pET-28a或者pGEX-5X進(jìn)行連接，并相應(yīng)轉(zhuǎn)化至BL-21大腸桿菌，分別涂布于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板或者含氨芐青的LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)過(guò)夜，取前述平板上生長(zhǎng)的菌落經(jīng)PCR鑒定目的基因，陽(yáng)性克隆菌質(zhì)粒行雙酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性者表示表達(dá)載體構(gòu)建成功； (3)、重組蛋白的表達(dá) 分別挑取與pET-28a或者pGEX-5X表達(dá)載體連接的重組表達(dá)菌于含卡那霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基或者含氨芐青100μg/ml的LB培養(yǎng)基中少量擴(kuò)增，后分別在含卡那霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基或者含氨芐青100μg/ml的LB培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)或發(fā)酵3h后，至細(xì)菌到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，測(cè)細(xì)菌在600nm OD值在0.6-0.8時(shí)，加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG，32℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)，終濃度200μg/ml，收集細(xì)菌； (4)、鑒定重組蛋白 應(yīng)用抗α型IFN參考血清做中和實(shí)驗(yàn)，證明型別無(wú)誤； (5)、純化重組蛋白，得到粗制品IFN。
所述的重組豬α型干擾素的制備方法，其特征在于鑒定重組蛋白將目的基因的重組質(zhì)粒pET-28a/IFN和pGEX-5X/IFN轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，大腸桿菌pET-28a/IFN菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍(lán)染色顯示，與空菌相比，在25KD左右有一條濃染的新增蛋白條帶；大腸桿菌pGEX-5X/IFN菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍(lán)染色顯示，與空菌相比，在45KD左右有一條濃染的新增蛋白條帶。經(jīng)Western blotting鑒定，此兩種菌體蛋白均能與抗α型IFN參考血清發(fā)生強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。
所述的重組豬α型干擾素的制備方法，其特征在于純化重組蛋白是指用超聲破碎重組蛋白后，得到上清中的可溶性重組蛋白，再經(jīng)AKTATMexplorer蛋白純化儀親和層析精純蛋白。
所述的重組豬α型干擾素的制備方法，其特征在于純化重組蛋白，得到粗制品IFN的具體步驟為收集菌液，4℃12000r/min離心5min，棄上清，留沉淀，-20℃與室溫反復(fù)凍融沉淀3次后將沉淀混勻在9倍體積PBS液中，4℃孵育5min，超聲裂解得到重組蛋白，功率400W，工作3秒，間隔3秒，超聲6min，重復(fù)3-4次，可作革蘭染色觀察細(xì)菌裂解情況，12000r/min離心10min，收獲上清。
所述的重組豬α型干擾素的制備方法，其特征在于AKTATMexplorer蛋白純化儀親和層析精純蛋白，測(cè)定IFN效價(jià)及比活性，比活性≥1×106國(guó)際單位/mg蛋白為合格；無(wú)菌分裝，-70℃保存。
本發(fā)明制備的重組豬α型干擾素，經(jīng)分離純化后，制成凍干粉針劑，加2ml無(wú)菌雙蒸水后，能迅速溶解為均勻懸濁液，規(guī)格為IFN含量≥2萬(wàn)單位/瓶，2～8℃可長(zhǎng)期保存，室溫(≤25℃)可保存兩年。使用時(shí)要輕輕搖勻后方可進(jìn)行肌肉注射，仔豬5000～1萬(wàn)單位/只/天；成年豬2萬(wàn)～4萬(wàn)單位/只/天，每日注射一次，一個(gè)療程3～5次。
在治療已發(fā)病豬的同時(shí)，應(yīng)及時(shí)隔離未發(fā)病豬，并給予等量相應(yīng)藥物預(yù)防注射，使用本發(fā)明制備的重組豬α型IFN時(shí)，應(yīng)注意環(huán)境的消毒等綜合預(yù)防措施，防治再感染或疫病的復(fù)發(fā)。

具體實(shí)施例方式 重組豬α型IFN制備工藝流程 1.構(gòu)建克隆載體 豬α型IFN目的基因?yàn)? TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA特異性引物序列上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA 下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC 用特異性引物PCR擴(kuò)增豬α型IFN目的基因后，將目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector至并轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌涂LB培養(yǎng)基平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，取白色樣的克隆菌進(jìn)行目的基因PCR驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)行雙酶切鑒定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將PCR和雙酶切均陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行目的基因測(cè)序。
2.構(gòu)建表達(dá)載體 選擇目的基因經(jīng)測(cè)序后與Genebank一致的克隆載體進(jìn)行雙酶切后與分別與表達(dá)載體pET-28a或pGEX-5X進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至BL-21大腸桿菌，分別涂布于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板或含氨芐青的LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)過(guò)夜。取LB平板上生長(zhǎng)的菌落經(jīng)PCR鑒定目的基因，陽(yáng)性克隆菌質(zhì)粒行雙酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性者表示表達(dá)載體構(gòu)建成功。
3.重組蛋白的表達(dá) 分別挑取與pET-28a或pGEX-5X表達(dá)載體連接的重組表達(dá)菌于含卡那霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基或含氨芐青100μg/ml的LB培養(yǎng)基中少量擴(kuò)增，后分別在兩種LB培養(yǎng)基(含卡那霉素100μg/ml或含氨芐青100μg/ml)中放大培養(yǎng)或發(fā)酵3h后，測(cè)OD值在0.6-0.8時(shí)，加入IPTG，32℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)(終濃度200μg/ml)5h，收集細(xì)菌。
為了以后大規(guī)模的重組豬α型IFN，需在發(fā)酵罐中進(jìn)行表達(dá)培養(yǎng)。本發(fā)明同時(shí)研究了中試發(fā)酵工藝，優(yōu)化后的表達(dá)水平達(dá)到50mg/L。
4.粗制品IFN的制備 收集細(xì)菌，-20℃與室溫反復(fù)凍融沉淀3次，4℃超聲裂解細(xì)菌沉淀，功率400W，工作3S，間隔3S，超聲6min，重復(fù)3-4次，離心12000r/min離心15min獲得上清。
5.粗制品IFN純化 5.1AKTATMexplorer蛋白純化儀親和層析精純蛋白。
5.1.1親和層析將粗制蛋白過(guò)濾處理后過(guò)GST親和層析柱，用Elution buffer(50mMTris-Cl 40mM還原性谷胱甘肽pH 8.0)梯度洗脫，收集IFN峰。
5.1.2脫鹽、緩沖液置換將第一步純化的IFN過(guò)脫鹽柱，用緩沖液(50mMTris-ClpH6.5)置換，準(zhǔn)備下一步離子交換層析。
5.1.3離子交換層析分別用Loading buffer(50mMTris-Cl pH6.5)平衡好柱體，上樣后用Elution buffer(50mMTris-Cl 1M NaCl pH6.5)梯度洗脫，收集IFN峰。
5.1.4分子篩層析離子交換層析收集到的IFN過(guò)分子篩層析柱，Elution buffer(50mMNa2HPO4 0.15MNaCl Ph7.0)收集IFN峰。
5.1.5結(jié)果分析每一步純化后用SDS-page及westen檢測(cè)蛋白純度，Lowry法蛋白定量，計(jì)算每一步純化得率。
5.2測(cè)定IFN效價(jià)及比活性，比活性≥1×106國(guó)際單位/mg蛋白為合格； 5.3無(wú)菌分裝，-70℃保存。
6.純化后豬α型IFN的鑒定 6.1蛋白定量檢測(cè)用Lowry法，以中國(guó)藥品生物制品檢定所的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。
6.2SDS-PAGE電泳檢測(cè)，與空菌相比，兩種重組菌分別在25KD和45KD左右有一條濃染的新增蛋白條帶。
6.3高效液相色譜分析純化后重組豬αIFN的純度，純化后豬αIFN＞95％。
6.4免疫印跡試驗(yàn)純化后的樣品能與抗α型IFN參考血清發(fā)生強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。
7.純化后重組豬αIFN效價(jià)及比活性的測(cè)定 7.1IFN效價(jià)測(cè)定純化后重組豬αIFN在WISH細(xì)胞上能夠抑制100TCID50的VSV病毒的增殖。
7.1.1在96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上用DMEM營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)WISH細(xì)胞，置5％CO2培養(yǎng)箱37℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)。
7.1.2用不同劑量的豬αIFN進(jìn)行處理。
7.1.3 24小時(shí)后吸棄，再分別接種100TCID50的VSV病毒。
7.1.4結(jié)果表明獲得的重組豬α型IFN對(duì)VSV引起的細(xì)胞病變具有明顯的抑制作用。未經(jīng)處理的細(xì)胞接種病毒后均出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落、崩解等病變。而獲得的兩種重組豬αIFN處理后的細(xì)胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察七天，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變，測(cè)得效價(jià)＞107IU/ml。
7.2比活性測(cè)定方法將純化后的重組豬α型IFN半成品蛋白定量檢測(cè)后，以國(guó)際上通用的WISH/VZV系統(tǒng)測(cè)定比活＞1×107IU/mg。
8.取上清液用蔡氏濾器加壓過(guò)濾，收集無(wú)菌濾液，取樣進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn)。經(jīng)檢測(cè)合格后，加入終濃度含5％脫脂奶粉、5％GS(葡萄糖)和10％豬血漿白蛋白作為凍干保護(hù)劑混勻后，置于凍干機(jī)凍干。
9.重組豬α型IFN在豬腎細(xì)胞中抑制豬細(xì)小病毒中的應(yīng)用 9.1在96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上用DMEM營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)豬腎細(xì)胞(PK-15)，置5％CO2培養(yǎng)箱37℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)。
9.2用不同劑量的重組豬α型IFN作用細(xì)胞。
9.3 24小時(shí)后吸棄，再分別接種100TCID50的豬細(xì)小病毒懸液。
9.4結(jié)果表明獲得的重組豬α型IFN對(duì)豬細(xì)小病毒引起的細(xì)胞病變具有明顯的抑制作用。未經(jīng)處理的細(xì)胞接種病毒后均出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落、崩解等病變。而獲得的重組豬α型IFN處理后的細(xì)胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察七天，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變。
10.重組豬α型IFN安全性實(shí)驗(yàn) 10.1豚鼠檢驗(yàn) 用體重350～400g的健康豚鼠3只，各腹側(cè)皮下注射重組豬α型IFN 2ml，觀察10日，均健活。
10.2小白鼠檢驗(yàn) 用體重18～20g的小白鼠5只，各尾靜脈注射重組豬α型IFN 0.5ml，觀察7日，均健活。
10.3乳鼠檢驗(yàn) 用2日齡乳鼠1窩(至少5只，帶母鼠飼養(yǎng))，每只背部皮下注射0.1ml，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，觀察7日，均全部健活。
10.4豬檢驗(yàn) 用經(jīng)中和試驗(yàn)方法檢測(cè)無(wú)豬瘟母源抗體的健康易感斷奶仔豬4頭(注射前觀察5～7日，每日上、下午各測(cè)體溫1次，挑選體溫、精神、食欲正常者使用)。每頭肌肉注射成品6ml，接種后每日上、下午各測(cè)體溫觀察1次，觀察21日。體溫、精神、食欲與注射本品前相比沒有明顯變化；或體溫升高超過(guò)0.5℃，但不超過(guò)1℃，稽留不超過(guò)2日；或減食不超過(guò)1日。檢驗(yàn)結(jié)果，樣品均合格。
11.重組豬α型IFN效力檢驗(yàn) 用仔豬檢驗(yàn) 按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》規(guī)定，選擇的試驗(yàn)用仔豬為健康易感21日齡的斷奶仔豬，每批IFN各注射8只。試驗(yàn)時(shí)，各肌肉注射IFN 2萬(wàn)U/只，連續(xù)3天(共約6萬(wàn)U/只)。在首次用藥后24h，經(jīng)口喂食豬細(xì)小病毒懸液(血凝效價(jià)≥1∶1280；TCID50≥1.0×10-9/ml)0.1ml(200TCID50)。同時(shí)同樣設(shè)病毒對(duì)照組和正常對(duì)照組。攻毒后12h，IFN保護(hù)組和正常對(duì)照組試驗(yàn)仔豬一切行為正常，而病毒對(duì)照組仔豬則出現(xiàn)臨床癥狀。觀察96h后剖殺，IFN保護(hù)組和正常對(duì)照組腸道組織無(wú)明顯病理改變，病毒分離陰性；而病毒對(duì)照組則出現(xiàn)明顯腸道組織病理改變，病毒分離陽(yáng)性。
12.臨床試用效果 研制的IFN在安徽省合肥市、明光市以及五河縣等多家養(yǎng)豬場(chǎng)(戶)試用，結(jié)果證明，重組IFN對(duì)治療豬病毒性腹瀉有效率為86.5％，治愈率為67.9％；治療豬細(xì)小病毒病有率為88.53％，治愈率為69.93％，質(zhì)量?jī)?yōu)于市場(chǎng)現(xiàn)有產(chǎn)品。
<110>王明麗
<120>重組豬α型干擾素的制備方法
<160>1
<210>1
<211>501
<212>DNA
<213>豬(Sus scrofa)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(501)
<400>1
tcactccttc ttcctgagtc tgtcttgcag gtttgtggag gaagagaagg ctctcatgac 60
ttctgccctg acgatctccc aggcacaggg gctgtagctc ttctcttgca gatagagggt 120
gagtctgtgg aagtatttcc tcacagccag gatggagtcc tcctccagca ggggggtccc 180
ttccagcccg gcctcctgca tgacacaggc ttccaggtcc ctgagctgct gatccagtcc 240
agtgcagaac tggtgcagga ggctctcatc ccaggcagca gccgagccct ctgtgctgaa 300
gagctggaag gtctgctgga gcatctcatg caccagagcc atggcttgag ccttctggac 360
ctggttgccc cccaaggcct cttgggggaa tccaaagtcc cttctgtggt ccaggcagga 420
gaagggggag attctcctca tttgtgccag gagcctcagg gccctggtgt gagccaggct 480
gtgggtctga ggcaggtcgc a 50權(quán)利要求
1、重組豬α型干擾素的制備方法，其特征是進(jìn)行以下步驟
(1)、構(gòu)建克隆載體
目的基因?yàn)?br> TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA
特異性引物上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA
下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC
克隆載體pMD18-T simple vector
(2)、構(gòu)建表達(dá)載體
表達(dá)載體pET-28a，或者pGEX-5X
(3)、重組蛋白的表達(dá)
挑取載體構(gòu)建成功的重組表達(dá)菌進(jìn)行擴(kuò)增、放大培養(yǎng)，并加入誘導(dǎo)劑低溫誘導(dǎo)表達(dá)；
(4)、鑒定重組蛋白
應(yīng)用抗α型干擾素參考血清做中和實(shí)驗(yàn)，證明型別無(wú)誤；
(5)、純化重組蛋白，得到粗制品干擾素。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬α型干擾素的制備方法，其特征在于具體步驟為
(1)、構(gòu)建克隆載體
目的基因
TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA
特異性引物序列上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA
下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC
用特異性引物PCR擴(kuò)增豬α型干擾素的目的基因后，將目的基因克隆于pMD18-T simple vector至并轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌涂LB培養(yǎng)基平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，取白色樣的克隆菌進(jìn)行目的基因PCR驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)行雙酶切鑒定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將PCR和雙酶切均陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行目的基因測(cè)序；
(2)、構(gòu)建表達(dá)載體
鑒定后選擇與目的基因一致的克隆菌進(jìn)行雙酶切后，與表達(dá)載體pET-28a或者pGEX-5X進(jìn)行連接，并相應(yīng)轉(zhuǎn)化至BL-21大腸桿菌，分別進(jìn)行培養(yǎng)，鑒定出表達(dá)載體構(gòu)建成功的重組表達(dá)菌；
(3)、重組蛋白的表達(dá)
分別挑取與pET-28a或者pGEX-5X表達(dá)載體連接的重組表達(dá)菌進(jìn)行小量擴(kuò)增、放大培養(yǎng)，加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG，低溫誘導(dǎo)表達(dá)，收集細(xì)菌；
(4)、鑒定重組蛋白
應(yīng)用抗α型干擾素參考血清做中和實(shí)驗(yàn)，證明型別無(wú)誤；
(5)、純化重組蛋白，得到粗制品干擾素。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬α型干擾素的制備方法，其特征在于更為詳細(xì)的步驟為
(1)、構(gòu)建克隆載體
豬α型IFN的目的基因?yàn)?br> TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA
特異性引物序列上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA
下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC
用特異性引物PCR擴(kuò)增豬α型IFN的目的基因后，將目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector至并轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌涂LB培養(yǎng)基平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，取白色樣的克隆菌進(jìn)行目的基因PCR驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)行雙酶切鑒定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將PCR和雙酶切均陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行目的基因測(cè)序；
(2)、構(gòu)建表達(dá)載體
鑒定后選擇與目的基因一致的克隆菌進(jìn)行雙酶切后，與表達(dá)載體pET-28a或者pGEX-5X進(jìn)行連接，并相應(yīng)轉(zhuǎn)化至BL-21大腸桿菌，分別涂布于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板或者含氨芐青的LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)過(guò)夜，取前述平板上生長(zhǎng)的菌落經(jīng)PCR鑒定目的基因，陽(yáng)性克隆菌質(zhì)粒行雙酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性者表示表達(dá)載體構(gòu)建成功；
(3)、重組蛋白的表達(dá)
分別挑取與pET-28a或者pGEX-5X表達(dá)載體連接的重組表達(dá)菌于含卡那霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基或者含氨芐青100μg/ml的LB培養(yǎng)基中少量擴(kuò)增，后分別在含卡那霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基或者含氨芐青100μg/ml的LB培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)或發(fā)酵3h后，至細(xì)菌到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，測(cè)細(xì)菌在600nm OD值在0.6-0.8時(shí)，加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG，32℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)，終濃度200μg/ml，收集細(xì)菌；
(4)、鑒定重組蛋白
應(yīng)用抗α型IFN參考血清做中和實(shí)驗(yàn)，證明型別無(wú)誤；
(5)、純化重組蛋白，得到粗制品IFN。
4、根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的重組豬α型干擾素的制備方法，其特征在于鑒定重組蛋白將目的基因的重組質(zhì)粒pET-28a/IFN和pGEX-5X/IFN轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，大腸桿菌pET-28a/IFN菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍(lán)染色顯示，與空菌相比，在25KD左右有一條濃染的新增蛋白條帶；大腸桿菌pGEX-5X/IFN菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍(lán)染色顯示，與空菌相比，在45KD左右有一條濃染的新增蛋白條帶。經(jīng)Western blotting鑒定，此兩種菌體蛋白均能與抗α型IFN參考血清發(fā)生強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。
5、根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的重組豬α型干擾素的制備方法，其特征在于純化重組蛋白是指用超聲破碎重組蛋白后，得到上清中的可溶性重組蛋白，再經(jīng)AKTATMexplorer蛋白純化儀親和層析精純蛋白。
6、根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的重組豬α型干擾素的制備方法，其特征在于純化重組蛋白，得到粗制品IFN的具體步驟為收集菌液，4℃12000r/min離心5min，棄上清，留沉淀，-20℃與室溫反復(fù)凍融沉淀3次后將沉淀混勻在9倍體積PBS液中，4℃孵育5min，超聲裂解得到重組蛋白，功率400W，工作3秒，間隔3秒，超聲6min，重復(fù)3-4次，可作革蘭染色觀察細(xì)菌裂解情況，12000r/min離心10min，收獲上清。
7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組豬α型干擾素的制備方法，其特征在于AKTATMexplorer蛋白純化儀親和層析精純蛋白，測(cè)定IFN效價(jià)及比活性，比活性≥1×106國(guó)際單位/mg蛋白為合格；無(wú)菌分裝，-70℃保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組豬α型干擾素的制備方法，系將特異性引物PCR擴(kuò)增豬α型IFN的目的基因，與表達(dá)載體pET-28a和與表達(dá)載體pGEX-5X進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使其高效表達(dá)豬α型干擾素，經(jīng)高度純化后除菌、分裝和凍干等工藝制成重組豬α型IFN凍干粉針劑。本發(fā)明經(jīng)過(guò)安全性實(shí)驗(yàn)、IFN效力檢驗(yàn)、臨床試用，表明其對(duì)豬病毒性腹瀉和流行性感冒等有明顯的治療效果，且在安全性和治愈率上優(yōu)于同類產(chǎn)品。本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)凍干后易運(yùn)送和保藏。重組豬α型干擾素注射豬機(jī)體后，具有療效好、安全可靠和無(wú)毒副作用等特點(diǎn)可用于治療豬病毒性腹瀉和流行性感冒等疾病，是一種新型高效安全無(wú)殘留的廣譜抗病毒制劑。
文檔編號(hào)C07K1/14GK101289666SQ200810020180
公開日2008年10月22日 申請(qǐng)日期2008年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者王明麗 申請(qǐng)人:王明麗