專利名稱：：蛋白質(zhì)穩(wěn)定制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于穩(wěn)定骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP's)的制劑和方法，和涉及處理、存儲和重構(gòu)期間的密切相關(guān)的生長和分化因子(GDFs)。更特別的，本發(fā)明涉及由海藻糖和在凍干、儲存和重構(gòu)期間保護(hù)rhGDF-5的其它賦形劑組成的制劑，包括用作賦形劑以遞送rhGDF-5的各種底物。此外，本發(fā)明包括制備和使用這些制劑以治療各種肌骨骼缺陷和疾病的方法。
背景技術(shù)：
：生物分子具有三維結(jié)構(gòu)或構(gòu)型，并且其生物學(xué)活性和性質(zhì)依賴于這種結(jié)構(gòu)。這些生物分子的實(shí)例包括脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白質(zhì)。這些生物分子對生命必不可少，并且代表了各種醫(yī)學(xué)疾病和病癥的治療中的治療劑和靶體。蛋白質(zhì)代表了較寬種類的生物分子。不同種類的蛋白質(zhì)例如酶、生長因子、受體、抗體和信號分子的生物學(xué)活性取決于其構(gòu)型結(jié)構(gòu)。其它種類的蛋白主要為結(jié)構(gòu)性的，例如膠原和軟骨，其本身不具有生物學(xué)活性。使生物分子暴露于各種環(huán)境中，例如pH、溫度、溶劑、滲透度等的變化可能不可逆改變或變性生物分子的構(gòu)型狀態(tài)，使其生物學(xué)無活性。這些生物分子失活中涉及的某些機(jī)制包括聚集、氧化、各種類型的鍵裂解包括水解和脫酰胺，以及各種類型的鍵形成，包括交聯(lián)和其它共價(jià)鍵合，例如二硫鍵的重排。骨形態(tài)發(fā)生蛋白和密切相關(guān)的生長分化因子(單體和二聚形式)屬于TGF-P超家族蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白系中的成員，通過其誘導(dǎo)異位軟骨內(nèi)骨形成的能力而初始確認(rèn)(參見Cheng等人，"Osteogenicactivityofthefourteentypesofhumanbonemorphogenicproteins"J.BoneJointSurg.Am.85A:1544-52(2003))。部分這些蛋白質(zhì)具有其它命名(參見Lories等人，CytokineGrowthFactorRev16:287-98(2005))。這類中的所有成員具有共同的結(jié)構(gòu)特征，包括羧基末端的活性區(qū)域，以及成熟長度為約97-106個(gè)氨基酸。所有成員具有半胱氨酸殘基的高保守模式，其產(chǎn)生3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵和一個(gè)分子間二硫鍵。活性形式可為單個(gè)家族成員的二硫鍵連的同二聚體，或?yàn)閮煞N不同家族成員的雜二聚體。(參見MassagueAnnu.Rev.CellBiol.6:957(1990);Sampath等人。J.Biol.Chem.265:13198(1990);Ozkaynak等人。EMBOJ.9:2085-93(1990);Wharton等人，PNAS88:9214-18(1991);Celeste等人，PNAS87:9843-47(1990);Lyons等人，PNAS86:4554-58(1989)，美國專利US5,011,691和美國專利US5,266,683)。已經(jīng)證實(shí)多種糖能夠在溶液中穩(wěn)定生物分子并且對分離細(xì)胞和生物分子產(chǎn)生保護(hù)。這些化合物在多種物種中作為冷凍保護(hù)劑和滲透壓調(diào)節(jié)劑沿用已久。(參見YanceyJ.Exper.Biol.208:2819-30(2005))。在凍干藥物蛋白質(zhì)的發(fā)展過程中，糖(糖類和多元醇)通常加入到制劑中以改善蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性并延長存儲期限。關(guān)于糖穩(wěn)定作用的機(jī)理，存在兩種主要理論1)糖賦形劑用于稀釋固態(tài)的蛋白，由此降低蛋白質(zhì)相互作用并防止分子降解，例如聚合，和2)糖賦形劑提供玻璃狀基質(zhì)，由此使得蛋白質(zhì)流動(dòng)性和反應(yīng)性最小化。在這兩個(gè)機(jī)理中，關(guān)鍵的是糖保持在無定形、與蛋白質(zhì)接觸的狀態(tài)。各種環(huán)境因素例如增加的溫度和濕度可能誘導(dǎo)糖的結(jié)晶。因此，重要的是使得使用的條件和材料最優(yōu)化以適于考慮使用的具體生物分子和體系。凍干為通常用于保存生物分子的方法。通常認(rèn)為凍干比冷凍-融化或很大程度上取決于不同的生物分子和不同的條件，并且各方面研究人員已經(jīng)研究了不同的體系。水溶液的冷凍導(dǎo)致溶液濃度初始增加，并且對不穩(wěn)定的化合物來說比冷凍本身更具破壞力。可以加入例如糖、蛋白質(zhì)、聚合物、緩沖劑和表面活性劑的賦形劑以穩(wěn)定生物分子的活性，然而取決于體系，具有有限和不同程度的成功。Crowe等人描述了通過糖穩(wěn)定干燥磷脂雙層和蛋白質(zhì)(Biochem.J.242:1-10(1987)),并且在"Thetrehalosemythrevisited:Introductiontoasymposiumonstabilizationofcellsinthedrystate",Cryobiology43,89-105(2001)中公開了海藻糖穩(wěn)定細(xì)胞機(jī)制的最新理解。為了維持有活力和有用的凍干的蛋白質(zhì)，目前認(rèn)為存在兩種單獨(dú)和不同的需要1)蛋白質(zhì)在冷凍過程中必須保護(hù)，和2)蛋白質(zhì)必須在隨后的干燥和重構(gòu)期間保護(hù)。這些是不同的需要，沒有必要通過任何一種賦形劑或條件的設(shè)定來滿足。不同研究人員已經(jīng)報(bào)道了使用各種賦形劑來保護(hù)各種生物分子，例如Gloger等人(Intl.J.Pharm.260:59-68(2003))公開了使用低分子量右旋糖苷穩(wěn)定蛋白質(zhì)對aviscumine的凍干保護(hù)，并且表明緩沖體系和聚山梨醇酯80單獨(dú)適于在冷凍期間保護(hù)蛋白質(zhì)，然而在干燥期間需要右旋糖來保護(hù)蛋白質(zhì)；Goodnough等人(Appl.Env.Biol.58(10:3426-28(1992))研究了使用血清蛋白作為穩(wěn)定劑和各種其它賦形劑在凍千期間A型肉毒毒素的穩(wěn)定性，并且報(bào)道沒有賦形劑具有任何有益的作用，然而通過從凍干混合物中除去NaCl并且控制pH，活性毒素的復(fù)原顯著提高；Costantmo等人(J.Pharm.Sci.87(11):1412-20(1998))描述了各種糖對凍干的重組人生長激素穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)的影響，并且表明全部測試的賦形劑顯著改善了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；Ramos等人(Appl.Envir.Microbiol.63(10):4020-25(1997))表明2-0-卩-甘露糖基甘油酸酯在保護(hù)多種從各種來源分離的脫氫酶中有效，并且對于全部研究的酶，2-0-P-甘露糖基甘油酸酯賦予的保護(hù)與海藻糖相似或者優(yōu)于海藻糖，然而在保護(hù)由P.furiosis分離的谷氨酸脫氫酶時(shí)并不有效；Brus等人(J.Control.Rel.95:119-31(2004))研究了寡聚核苷酸-聚乙烯亞胺(PEI)絡(luò)合物進(jìn)行凍干的穩(wěn)定性，并且報(bào)道了這些絡(luò)合物沒有受益于例如蔗糖或海藻糖的糖類的加入，但質(zhì)體-PEI絡(luò)合物則的確受益于這些糖類的加入。根據(jù)不同方法在各種生物分子上的測定，這些研究人員報(bào)道了不同程度的成功。沒有研究人員曾經(jīng)報(bào)道對BMP的保護(hù)。因此，對于什么是賦形劑的最佳組合以對生物分子的凍干提供保護(hù)存在不一致的證據(jù)。沒有任何一種賦形劑的組合對全部生物分子都是最佳的，相反需要進(jìn)行有效程度的實(shí)驗(yàn)以得到所研究的生物分子的希望的結(jié)果。仍然需要藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合以在凍干、儲存和使用期間保護(hù)BMP。圖1表示實(shí)施例6所述的rhGDF-5的海藻糖制劑的DSC曲線。所述制劑為凍干海藻糖+GDF-5，其中實(shí)施例6-rhGDF-5濃度0.5毫克/瓶，賦形劑濃度50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。其中凍干制劑使用水重構(gòu)。最終濃度為0.33毫克/毫升蛋白質(zhì)+3.3%海藻糖。圖2表示實(shí)施例7所述的rhGDF-5的甘露醇制劑的DSC曲線。所迷制劑為凍干甘露醇糖+rhGDF-5，其中實(shí)施例7-rhGDF-5濃度0.5毫克/瓶，甘露醇濃度50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。其中凍干制劑使用水重構(gòu)。最終濃度為0.33毫克/毫升蛋白質(zhì)+3,3%甘露醇。圖3表示rhGDF-5天然蛋白質(zhì)的DSC曲線。其中0.01%TFA中GDF-5濃度1.04毫克/毫升，沒有賦形劑，相對于0.01%TFA滲析。其中10mM鹽酸中3.8毫克/毫升原料GDF-5相對于0.01%TFA滲析。最終蛋白質(zhì)濃度為1.04毫克/毫升。圖4表示實(shí)施例6所述的rhGDF-5的海藻糖制劑的偏振光顯微圖，其表明海藻糖的所需無定形狀態(tài)。其為凍干制劑實(shí)施例6,rhGDF-5濃度0.5毫克/瓶，海藻糖50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。圖5表示實(shí)施例7所述的rhGDF-5的甘露醇制劑的偏振光顯微圖，其表明甘露醇的非所需結(jié)晶狀態(tài)。其為凍干制劑實(shí)施例7，rhGDF-5濃度0.5毫克/瓶，甘露醇50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。圖6表示如實(shí)施例12所述在40°C/75%RH下6個(gè)月后rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸制劑的rpHPLC曲線。圖7表示如實(shí)施例12所迷在4(TC/75%RH下6個(gè)月后rhGDF-5/海藻糖/HCl制劑的rpHPLC曲線。圖8、9和10表示如實(shí)施例12所述在5°C、25。C和40。C在不同時(shí)間點(diǎn)儲存時(shí)各種測試緩沖液的蛋白質(zhì)回收百分率。其中圖8表示使用pH為3的不同緩沖液體系凍干的rhGDF-5在5r的穩(wěn)定性；圖9表示使用pH為3的不同緩沖液體系凍干的rhGDF-5在25。C儲存后的穩(wěn)定性；圖IO表示使用pH為3的不同緩沖液體系凍干的rhGDF-5在4(TC儲存后的穩(wěn)定性。圖11表示如實(shí)施例14所迷在pH3的甘氨酸緩沖液中使用5%或10%海藻糖在選定溫度凍千的不同濃度rhGDF-5的穩(wěn)定性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一般涉及在各種制劑和組合物中穩(wěn)定BMP，由此保持生物活性的至少60%并且改善儲藏條件要求，例如溫度和濕度。本發(fā)明包括主要含有海藻糖作為賦形劑的、用于含有BMP的凍干組合物的制劑以及其隨后的儲存和重構(gòu)，并且另外含有包括緩沖劑和表面活性劑的其它賦形劑。本發(fā)明人已經(jīng)令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，海藻糖在凍干期間和凍干之后足以保存BMP的生物學(xué)活性并且優(yōu)于其它賦形劑。在多種其它生物分子的穩(wěn)定中，若非BMP存在較大差異，對于得到保護(hù)的量，在各種糖之間存在很少的差異。這種發(fā)現(xiàn)提供了在患者中治療各種肌骨骼缺陷的組合物，而沒有加入賦形劑的不良反應(yīng)。本發(fā)明人還令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，例如抗壞血酸和谷胱甘肽的抗氧化劑的加入并沒有提高使用海藻糖凍干的BMP的穩(wěn)定性，而是降低了通過海藻糖得到的穩(wěn)定性。本發(fā)明的一個(gè)目的是使用足以穩(wěn)定凍干的BMP的量的海藻糖，由此BMP在再水化作用時(shí)保持至少60%的生物學(xué)活性，所述再水化的液體產(chǎn)物易于被外科醫(yī)生處理。本發(fā)明另一目的是使用足以穩(wěn)定凍干的BMP的量的海藻糖、至少一種BMP和其它賦形劑，所述其它賦形劑選自緩沖劑、表面活性劑以及其混合物，由此BMP在再水化作用時(shí)保持至少60%的生物學(xué)活性，所述再水化的液體產(chǎn)物易于被外科醫(yī)生處理。本發(fā)明另一目的是使用足以穩(wěn)定凍干的BMP的量的海藻糖、至少一種BMP和粉碎的(morselized)膠原纖維以提供組合物，以及制備含有BMP的凍干的生物相容的可流動(dòng)材料的方法，該材料穩(wěn)定并且在再水化作用時(shí)保持至少60%的生物學(xué)活性，由此所述再水化的產(chǎn)品易于被外科醫(yī)生處理。本發(fā)明另一目的是使用足以穩(wěn)定凍干的BMP的量的海藻糖、至少一種BMP和生物相容的基質(zhì)以提供組合物，以及制備含有BMP的凍千的生物相容的基質(zhì)的方法，該基質(zhì)穩(wěn)定并且在再水化作用時(shí)保持至少60%的生物學(xué)活性，由此所述再水化的產(chǎn)品易于被外科醫(yī)生處理。示例性的生物相容的基質(zhì)包括膠原、礦物化膠原、磷酸鈣的鹽、含有鈣的陶瓷、各種來源的骨骼包括自生、外源和異體的骨骼，以及聚合物，包括聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、PLA-PGA共聚物、聚碳酸酯、聚己酸內(nèi)酯以及其混合物。本發(fā)明另一目的是使用足以穩(wěn)定凍干的BMP的量的海藻糖、至少一種BMP、生物相容的基質(zhì)和其它賦形劑，所述其它賦形劑選自緩沖劑、表面活性劑以及其混合物，以提供組合物和制備含有BMP的凍干的生物相容的基質(zhì)的方法，該基質(zhì)穩(wěn)定并且在再水化作用時(shí)保持至少60%的生物學(xué)活性，由此所述再水化的產(chǎn)品易于被外科醫(yī)生處理。本發(fā)明另一目的是使用足以穩(wěn)定凍干的BMP的量的一種或多種凍干保護(hù)劑和至少一種BMP以提供組合物和制備凍干的BMP的方法，其中凍干保護(hù)劑選自海藻糖、低分子量右旋糖、環(huán)糊精、聚乙二醇、聚乙二醇酯以及其混合物，由此BMP在再水化作用時(shí)保持至少60%的生物學(xué)活性，所述再水化的產(chǎn)品易于被外科醫(yī)生處理。本發(fā)明另一目的是使用一種或多種凍千保護(hù)劑、至少一種BMP和膠原以提供組合物和制備含有BMP的凍千的生物相容的膠原基質(zhì)的方法，其中凍干保護(hù)劑選自海藻糖、低分子量右旋糖、環(huán)糊精、聚乙二醇、聚乙二醇酯以及其混合物，該基質(zhì)穩(wěn)定并且在再水化作用時(shí)保持至少60%的生物學(xué)活性，由此所述再水化有展延性的產(chǎn)品易于被外科醫(yī)生處理。本發(fā)明另一目的是使用一種或多種凍千保護(hù)劑、至少一種BMP和粉碎化膠原纖維以提供組合物和制備含有BMP的凍干的生物相容的可流動(dòng)材料的方法，其中凍干保護(hù)劑選自海藻糖、低分子量右旋糖、環(huán)糊精、聚乙二醇、聚乙二醇酯以及其混合物，該材料穩(wěn)定并且在再水化作用時(shí)保持至少60%的生物學(xué)活性，由此所述再水化的產(chǎn)品易于被外科醫(yī)生處理。本發(fā)明的還一目的在于使用由至少一種凍干保護(hù)劑和至少一種BMP的凍干混合物組成的組合物治療患者的方法。通過直接將重構(gòu)的BMP溶液施加到患者的解剖學(xué)區(qū)域，例如施加到骨折、骨縫、骨空隙、推間盤、軟骨缺陷、腱、韌帶等區(qū)域，或者將重構(gòu)的BMP溶液施加到要植入患者的裝置，例如人造連接骨(bone-contacting)植入物，如人造髖、膝、肩、推間盤等等，腱錨(tendonanchor)、韋刃帶錨(ligamentanchor)、縫合線、卡釘(staple)等等，骨置換罩(bonereplacementcage)、自體骨碎片、同種異體骨碎片、異種骨碎片、去礦質(zhì)骨碎片等等，這些組合物用于治療各種肌骨骼缺陷，以促進(jìn)愈合過程。水溶液或干燥固體形式的BMP不穩(wěn)定，需要冷藏到-2(TC以下以保持蛋白質(zhì)的生物活性。由于BMP易于聚集、二硫鍵重排、脫酰胺和氧化，需要一種制劑來保存和保護(hù)凍干的BMP的生物學(xué)活性。凍干的BMP產(chǎn)品需要具有改善的穩(wěn)定性和儲存。仍然需要用于使用水溶液重構(gòu)的凍千的BMP產(chǎn)品，用于注射到例如推間盤、非關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)軟骨的軟組織中以促進(jìn)這些組織的再生。仍然需要凍千的BMP產(chǎn)品，其以醫(yī)師使用的合適的BMP濃度提供在可植入生物相容的支架上，由此最小化或消除多種與處置有關(guān)的危險(xiǎn)，包括污染、不合適的劑量以及泄漏，包括廢料，以及引入到不希望的手術(shù)位置。需要凍干的BMP產(chǎn)品，其可以在易于施加到手術(shù)位置的生物相容的可流動(dòng)材料中重構(gòu)。由于BMP的發(fā)現(xiàn)，一直在進(jìn)行大量的研究活動(dòng)以發(fā)現(xiàn)用于治療各種肌骨骼缺陷和病癥的治療應(yīng)用中合適的組合物。當(dāng)前存在含有BMP的以凍干的固體出售的產(chǎn)品，其必須重構(gòu)為液體并且在使用時(shí)由醫(yī)師施加到要被植入的支架或者外科治療位置。當(dāng)前rhBMP-2制劑使用蔗糖NF、甘氨酸USP、L-谷氨酸FCC、氯化鈉USP和聚山梨醇酯80NF作為賦形劑，并且可在室溫下(15-25°C)儲存。當(dāng)前OP-l制劑單獨(dú)使用牛膠原，并且必須在2-8。C儲存。關(guān)于重構(gòu)BMP穩(wěn)定性的賦形劑的效力，還沒有公開的報(bào)道。他人已經(jīng)試圖通過使用甘露醇、蔗糖以及其混合物，通過將BMP包埋在例如PLGA的聚合母體中，通過加入例如蛋氨酸的抗氧化劑，通過加入例如組氨酸、精氨酸、環(huán)糊精和牛血清白蛋白的其它賦形劑，和加入例如吐溫80的表面活性劑，或者其組合，在凍干期間增強(qiáng)BMP的穩(wěn)定性。這些努力已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了不同程度的有限度的成功。美國專利US5,318,898和5,516,654公開了使用硫酸葡聚糖在培養(yǎng)基中制備BMP的改進(jìn)方法，然而沒有闡述產(chǎn)生益處的機(jī)制并且沒有公開穩(wěn)定蛋白質(zhì)的任何其它有用的賦形劑。Yim等人在美國專利US5,385,887中^Hf了凍干組合物和用于遞送BMP的制劑，所述組合物包括BMP、糖、甘氨酸和谷氨酸。雖然Yim等人/>開了通過W-20石威性磷酸酶測試證明的凍干制劑保持了生物學(xué)活性，然而其沒有公開任一制劑與其它制劑相比顯示任何定量益處的對比數(shù)據(jù)。這些發(fā)明人沒有討論或確認(rèn)海藻糖在BMP的凍干中相對于蔗糖的優(yōu)越性。本發(fā)明提供了組合物以及制備和使用BMP穩(wěn)定制劑的方法，其可用于凍干、儲存和用水溶液重構(gòu)以由其治療患者。本發(fā)明根據(jù)以下說明性實(shí)施方案描述如下，并且使用rhGDF-5作為示范性BMP。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將能夠理解，本發(fā)明可以在多種不同應(yīng)用和實(shí)施方案中實(shí)現(xiàn)，'本發(fā)明二^面提供了一種組合物，和制備^后用于骨和軟骨缺陷的外科治療中穩(wěn)定的凍干的BMP的方法。正如此處所預(yù)想的那樣，這種組合物包括至少一種BMP和足以穩(wěn)定BMP量的海藻糖。通過將重構(gòu)的BMP溶液直接施加到患者的解剖區(qū)域，例如施加到骨折、骨縫、骨空隙、推間盤、外科用于融合的稚間盤間隙、軟骨缺陷、腱、韌帶等區(qū)域，或者施加到要植入到患者與骨或軟骨接觸的材料中，例如人造髖、人造膝、人造肩、人造推間盤、腱錨、韌帶錨、縫合線、卡釘(staple)、骨罩、自體骨碎片、同種異體骨碎片、異種骨碎片、去礦質(zhì)骨碎片等等，這些組合物用于治療各種肌骨骼缺陷。此處使用的術(shù)語"形態(tài)發(fā)生"、"骨骼形態(tài)發(fā)生"、"骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)"、"BMP"、"成骨蛋白質(zhì)"、"成骨因子"、"生長&分化因子"和"GDF"包括rhGDF-5代表的一類蛋白。然而本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將能夠理解，rhGDF-5僅僅作為能夠用作BMP的實(shí)際組織形態(tài)發(fā)生素的典型TGF-p系亞組，并且并不意圖限制說明。術(shù)語"冷凍保護(hù)劑"用來表示能夠在冷凍期間穩(wěn)定生物分子的分子，并且在當(dāng)前上下文中等同于術(shù)語"凍干保護(hù)劑"，其指的是能夠在凍干期間穩(wěn)定生物分子的分子。此處使用的術(shù)語"粉碎化(morselized)"指的是通過切割、砍碎、切斷、研磨、粉碎或者其它降低例如膠原的生物相容基質(zhì)的量的尺寸、由此單個(gè)顆粒或纖維的總尺寸降低的方法得到產(chǎn)品，并且"粉碎化(morselization)"指的是上述方法。此處使用的術(shù)語"賦形劑"指的是添加到至少一種BMP中的至少一種其它化合物，其中所述其它化合物選自氨基酸、蛋白質(zhì)、緩沖劑、表面活性劑以及其混合物。已知rhGDF-5在pH4.5至pH10.5范圍的中性pH內(nèi)具有較差的溶解度。因此難以在此pH范圍內(nèi)配制和制備rhGDF-5產(chǎn)品。因此本發(fā)明人設(shè)計(jì)一種研究以評價(jià)rhGDF-5在pH3和pH4緩沖液中的溶解度，選擇形成蛋白質(zhì)制劑的合適的pH范圍是關(guān)鍵的。研究結(jié)果如實(shí)施例11所述。rhGDF-5的溶解度不僅取決于緩沖液的pH,還取決于緩沖溶液的離子強(qiáng)度。在pH為4時(shí)，約10毫克/毫升的rhGDF-5溶液在5和10mM石克酸鈉緩沖液中混濁，然而在50和100mM石克酸鈉緩沖液中rhGDF-5形成更大的顆粒并且最終沉淀出來。在另一研究中(數(shù)據(jù)沒有顯示)，當(dāng)rhGDF-5以3.5毫克/毫升的濃度在pH為3.5和pH為4的5mM硫酸鹽緩沖液中配制時(shí)，溶液仍然混濁。蛋白質(zhì)的溶解度通常在過度飽和/沉淀的溶液離心后測量蛋白質(zhì)濃度確定。然而某些混濁的蛋白質(zhì)溶液難以離心或過濾。即便是在混濁溶液進(jìn)行離心或過濾(0.22微米)以除去不溶性顆粒后，由于顆粒如此細(xì)小濾液仍然看起來混濁，這通常不成功，并且有時(shí)蛋白質(zhì)常常粘在過濾器表面，因而濾液損失了大部分蛋白質(zhì)。因此當(dāng)rhGDF-5以3.5毫克/毫升或10毫克/毫升濃度在pH為3.5或pH為4的緩沖液中配制時(shí)難以得到透明溶液。當(dāng)rhGDF-5以10毫克/毫升濃度在5mM、10mM和25mM磷酸鈉溶液中在pH為3.0配制時(shí)，蛋白質(zhì)溶液透明；然而當(dāng)rhGDF-5以10毫克/毫升在更高離子強(qiáng)度的溶液例如50mM和100mM磷酸鈉中配制時(shí)，rhGDF-5溶液混濁。因此在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，rhGDF-5應(yīng)當(dāng)在低離子強(qiáng)度緩沖液中在約3.0的pH配制。在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可通過凍干至少一種BMP和足以穩(wěn)定BMP量的海藻糖的混合物制備，對于含有產(chǎn)品的生物相容的基質(zhì)，海藻糖與BMP的干重比例為每1毫克BMP約1毫克至約500毫克海藻糖，更優(yōu)選每1毫克BMP約5毫克至約200毫克海藻糖。海藻糖的加入為凍干制劑中的蛋白質(zhì)提供改善的溶解度和穩(wěn)定性。凍干根據(jù)本領(lǐng)域通常已知的方法進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物可通過凍干至少一種BMP、足以穩(wěn)定BMP量的海藻糖和緩沖液的含水混合物制備。緩沖劑的加入為凍干制劑中的蛋白質(zhì)提供改善的溶解度和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域已知的生物相容的緩沖劑包括甘氨酸；乙酸鈉、鉀或鈣鹽；檸檬酸鈉、鉀或鈣鹽；乳酸鈉、鉀或鈣鹽；磷酸鈉或鉀鹽，包括磷酸二氫鹽、磷酸氫鹽、磷酸鹽以及其混合物。緩沖劑另外可以具有加入到組合物中起填充劑作用的甘氨酸。甘氨酸將以每1毫克BMP約0.04毫克至約200毫克甘氨酸的比例加入，更優(yōu)選以每0.04毫克BMP約1亳克至約80毫克甘氨酸的比例加入。與單獨(dú)具有海藻糖的組合物相比，緩沖劑和填充劑的加入為蛋白質(zhì)提供稍微更優(yōu)越的穩(wěn)定性，pH控制在約2.0至約5.0pH單位，更優(yōu)選約2.5至約4.5pH單位。在可供選擇的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法可通過凍干至少一種BMP、足以穩(wěn)定BMP量的海藻糖、緩沖劑和選自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20以及其混合物的表面活性劑的含水混合物制備。表面活性劑將以每1毫克BMP約0.001毫克至約0.2毫克的濃度加入。通過改變?nèi)芙舛群蛢龈商匦裕砻婊钚詣┑募尤霝榈鞍踪|(zhì)另外提供穩(wěn)定性。凍千根據(jù)本領(lǐng)域通常已知的方法進(jìn)行。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，穩(wěn)定的凍干BMP的組合物和方法包括至少一種BMP、足以穩(wěn)定至少一種BMP的量的凍千的海藻糖，以及至少一種其它賦形劑，所述其它賦形劑選自緩沖劑和表面活性劑。與具有海藻糖作為單獨(dú)的賦形劑的組合物相比，這種緩沖劑和表面活性劑的加入為凍干的BMP提供增加的改善的穩(wěn)定性。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法可通過在凍干BMP/膠原混合物之前將至少一種BMP和至少一種賦形劑的溶液沉積在凍干膠原上制備。膠原可任選被交聯(lián)或礦物化，或者既交聯(lián)又礦物化，例如通過已爭為Healos的材料提供并且公開在美國專利US5,972,385、5,866,165、5,776,193、5,455,231和5,231,169中。該實(shí)施方案中提供的組合物特別可用于治療整形外科領(lǐng)域的醫(yī)學(xué)病癥，并且提供柔性可延伸的材料,醫(yī)師可容易地將其置于手術(shù)位置以生成骨、軟骨或腱。BMP/膠原混合物可使用水溶液重構(gòu)，包括無菌水、鹽水和骨髓吸出物，并且直接施加在患者的缺陷部位，例如骨折、骨縫隙、骨空隙和通過手術(shù)為脊柱融合術(shù)準(zhǔn)備的推間盤間隙。此外，BMP/膠原混合物可用于填充骨碎片之間的空隙以及在脊柱融合術(shù)期間放入推間盤間隙中的植入物中，放入具有損傷或失去的軟骨的區(qū)域中，例如斷裂或損傷的腱、斷裂或損傷的韌帶、關(guān)節(jié)軟骨中的軟骨缺陷，以及關(guān)節(jié)軟骨中的亞軟骨缺陷。在另一實(shí)施方案中，片艮據(jù)本發(fā)明的組合物和方法可如下應(yīng)用通過制備至少一種BMP和至少一種賦形劑的凍干混合物、使用水、鹽水或骨髓吸出物重構(gòu)該凍干BMP混合物，并且在手術(shù)移植BMP/膠原混合物之前將該重構(gòu)的BMP溶液置于凍干膠原之上。"交原可任選纟皮交聯(lián)或礦物化，或者既交聯(lián)又礦物化，例如通過已知為Healos⑧的材辟十提供。該實(shí)施方案中提供的組合物和方法特別可用于治療整形外科領(lǐng)域的醫(yī)學(xué)病癥，并且提供柔性可延伸的材料，醫(yī)師可容易地將其置于手術(shù)位置以生成骨、軟骨或腱。BMP/膠原混合物可直接施加到患者的缺陷部位，例如骨折、骨縫隙、骨空隙和通過手術(shù)為脊柱融合術(shù)準(zhǔn)備的推間盤間隙、填充骨碎片之間的空隙以及在脊柱融合術(shù)期間放入推間盤間隙中的植入物中，放入具有損傷或失去的軟骨的區(qū)域中，例如斷裂或損傷的腱、斷裂或損傷的韌帶、關(guān)節(jié)軟骨中的軟骨缺陷，以及關(guān)節(jié)軟骨中的亞軟骨缺陷。由于具有BMP作為分離組分和來自膠原材料的容器，該實(shí)施方案中提供的組合物和方法由于易于儲存和制備也特別有用。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法可通過在凍干BMP/粉碎化膠原混合物之前將至少一種BMP和至少一種賦形劑的溶液沉積在凍干的粉碎化膠原上制備。粉碎化膠原可任選被交聯(lián)或礦物化，或者既交聯(lián)又礦物化。這種粉碎化提供直徑約25微米長約110微米的較小膠原纖維，其得到適于注射到手術(shù)位置的可流動(dòng)組合物。這種組合物的重構(gòu)可使用例如無菌水、鹽水或骨髓吸出物的水溶液和膠原凝膠的混合物進(jìn)行，膠原凝膠控制重構(gòu)產(chǎn)品的粘度。膠原凝膠含有約0.1%至約30%重量/重量的膠原，更優(yōu)選約0.3%至約3.0%重量/重量的膠原，膠原凝膠的粘度優(yōu)選為約10厘泊(cp)至約400厘泊，并且更優(yōu)選約70厘泊至約100厘泊。膠原凝膠的pH優(yōu)選約4.0pH單位至約8.0pH單位。這種組合物用于治療各種肌骨骼疾病，包括但不限于骨折、骨縫隙、骨空隙和通過手術(shù)為脊柱融合術(shù)準(zhǔn)備的推間盤間隙、填充骨碎片之間的空隙以及在脊柱融合術(shù)期間;改入稚間盤間隙中的才直入物中，具有損傷或失去的軟骨的區(qū)域，例如斷裂或損傷的腱、斷裂或損傷的韌帶、關(guān)節(jié)軟骨中的軟骨缺陷，以及關(guān)節(jié)軟骨中的亞軟骨缺陷。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法可如下使用，通過制備至少一種BMP和至少一種賦形劑的凍干混合物、使用水或鹽水重構(gòu)該凍干BMP混合物，并將該重構(gòu)的BMP溶液注入到推間盤。該實(shí)施方案中提供的組合物和方法特別用于治療稚間盤。具體實(shí)施方式實(shí)施例在以下實(shí)施例中，4吏用以下實(shí)-驗(yàn)方法為了進(jìn)行RP-HPLC純度研究，使用10mM鹽酸將重構(gòu)rhGDF-5試樣稀釋到0.1毫克/毫升的濃度，并且在5(TC和0.3毫升/分鐘的流速在Vydac218TP52柱上進(jìn)行反相HPLC。rhGDF-5使用0.15%三氟乙酸中的乙腈的梯度洗脫，使用UV在214納米檢測。對于圓二色光譜(CD)研究，圓二色光語在AVIVModel60DS圓二色光譜旋光分光計(jì)上進(jìn)行。使用相應(yīng)賦形劑的基線空白對照劑的掃描從樣品掃描中減去。該掃描使用平均殘基分子量(值為l5)歸一化并將其插入到方程式中=/[濃度(毫克/毫升)x光程]的值在每個(gè)波長計(jì)算以得到平均殘基橢圓率。最終，次級結(jié)構(gòu)的估算使用程序PROSECv.2.1確定(1987年AVIVAssociates取得版;k)。差示掃描量熱(DSC)在MicroCalVP-DSC儀上進(jìn)行。掃描速率為6(TC/小時(shí)。溫度范圍為5-10(TC。儀器基線掃描(空白對照組數(shù)據(jù))從試樣熱掃描中減去。蛋白質(zhì)濃度為0.33毫克/毫升。偏振光顯微術(shù)(PLM)用于結(jié)晶度評價(jià)。痕量固體試樣從處于相對濕度為1%的干空氣包中的小瓶中取出。將固體試樣分布在玻璃載片上并將一滴二氧化硅油滴加在固體試樣上。然后載片使用裝有索尼CCD-IRIS/RGB彩色攝像機(jī)和偏振光附件的蔡司(zeiss)光學(xué)顯微鏡研究。FlashBusFBG軟件用于捕捉圖像。原料rhGDF-5在-80。C以10mM鹽酸中3.8毫克/毫升的濃度從Bi叩harm得到。在用于制劑之前，冷凍的原料蛋白質(zhì)在2-8。C解凍整夜。實(shí)施例h具有rhGDF-5(0.5毫克/毫升，5毫升/條)和海藻糖50毫克/毫升的Healos⑧條(非無菌)。每個(gè)條具有2.5毫克rhGDF-5和250毫克海藻糖。海藻糖溶液的制備25.48克二水合海藻糖仔細(xì)稱重并轉(zhuǎn)移到無菌聚丙烯瓶中，在室溫下向其中加入350毫升純凈水并緩慢攪拌直到得到透明溶液。向該透明溶液中逐滴加入0.1N鹽酸以將pH調(diào)節(jié)為3.9，然后使用純凈水調(diào)節(jié)體積以得到400毫升最終體積。測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為4.2。將溶液通過0.22微米過濾器過濾并直接使用以稀釋蛋白質(zhì)溶液。使用海藻糖溶液稀釋rhGDF-5溶液將22.39毫升rhGDF-5溶液小心轉(zhuǎn)入到聚丙烯〗統(tǒng)中，小心向其中加入海藻糖溶液以將體積調(diào)節(jié)至150毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為2.5。將溶液在室溫下攪拌15分鐘。得到UV消光系數(shù)以精確計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)UV讀數(shù)，加入更多海藻糖溶液以在170毫升得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為2.7;UV讀數(shù)指示0.499毫克/毫升的蛋白質(zhì)含量。rhGDF-5/海藻糖溶液通過0.22微米過濾器過濾并且直接施加到Healos⑧條上。使用無菌移液管將2.5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液等同施加在條的兩點(diǎn)上，每個(gè)條上總共有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。這些條插入在2厘米x2厘米小PETG托盤中，并且將小托盤插入到大PETG托盤中并凍干。每個(gè)大托盤容納24個(gè)條。表la:每個(gè)條具有海藻糖(250毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的Healos⑧在25。C的穩(wěn)定性(實(shí)施例1)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表lb:每個(gè)條具有海藻糖(250毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的Healos⑧在2-8。C的穩(wěn)、定性(實(shí)施例1)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例2:具有rhGDF-5(0:5毫克/毫升,5毫升/條)和甘露醇50毫克/毫升的Healos⑧條(非無菌)。每個(gè)條具有2.5毫克rhGDF-5和毫克甘露醇。甘露醇溶液的制備23.03克甘露醇仔細(xì)稱重并轉(zhuǎn)移到無菌聚丙烯瓶中，在室溫下向其中加入350毫升純凈水并緩慢攪拌直到得到透明溶液。測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為7.2;逐滴加入0.1N鹽酸以將pH調(diào)解為3.8;然后使用純凈水調(diào)節(jié)體積以得到400毫升最終體積。測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為3.9。將溶液通過0.22微米過濾器過濾并直接使用以稀釋蛋白質(zhì)溶液。使用甘露醇溶液稀釋rhGDF-5溶液將22.37毫升rhGDF-5溶液小心轉(zhuǎn)入到聚丙烯并瓦中，小心向其中加入甘露醇溶液以將體積調(diào)節(jié)至150毫升。測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為2.7。將溶液在室溫下攪拌l5分鐘。得到UV消光系數(shù)以精確計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)UV讀數(shù)，加入更多甘露醇溶液以在170毫升得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為2.8;UV讀數(shù)指示0,493毫克/毫升的蛋白質(zhì)含量。rhGDF-5/甘露醇溶液通過0.22微米過濾器過濾并且直接施加到Healos⑧條上。使用無菌移液管將2.5毫升rhGDF-5/甘露醇溶液等同施加在條的兩點(diǎn)上，每個(gè)條上總共有5毫升rhGDF-5/甘露醇溶液。這些條插入在2厘米x5厘米小PETG托盤中，并且將小托盤插入到大PETG托盤中并凍干。每個(gè)大托盤容納24個(gè)條。表2a:每個(gè)條具有甘露醇(250毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的Healos⑧在25。C的穩(wěn)定性(實(shí)施例2)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2b:每個(gè)條具有甘露醇("0毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的Healos⑧在2-8。C的穩(wěn)定性(實(shí)施例2)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例3:具有rhGDF-5(0.5毫克/毫升，5毫升/條)和海藻糖100毫克/毫升的Healos⑧條(無菌)。每個(gè)條具有2.5毫克rhGDF-5和500毫克海藻糖。海藻糖溶液的制備25.49克二水合海藻糖仔細(xì)稱重并轉(zhuǎn)移到無菌聚丙烯瓶中，在室溫下向其中加入190毫升純凈水并緩慢攪拌直到得到透明溶液。測量透明海藻糖溶液的pH并發(fā)現(xiàn)pH為6.2。沒有向溶液中加入鹽酸以調(diào)節(jié)pH。使用純凈水調(diào)節(jié)體積以得到200毫升最終體積。測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為6.3。將溶液直接用于稀釋蛋白質(zhì)溶液。使用海藻糖溶液稀釋rhGDF-5溶液將23.03毫升rhGDF國5溶液小心轉(zhuǎn)入到聚丙烯瓶中，小心向其中加入海藻糖溶液以將體積調(diào)節(jié)至170毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為3.0。將溶液在室溫下攪拌15分鐘。得到UV消光系數(shù)以精確計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)UV讀數(shù)，加入更多海藻糖溶液以在175毫升得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為3.0;UV讀數(shù)指示0.518毫克/毫升的蛋白質(zhì)含量。rhGDF-5/海藻糖溶液通過0.22微米過濾器過濾并且直接施加到無菌Healos⑧條上。使用無菌移液管將2.5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液等同施加在條的兩點(diǎn)上，每個(gè)條上總共有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。這些條置于鋼托盤中，并且將其小心包裝在無菌雙重袋中，并在無菌條件下進(jìn)行凍干。表3a:每個(gè)條具有海藻糖(500毫克)/rhGDF_5(2.5毫克)的Healos在2-8。C的穩(wěn)定性(實(shí)施例3)__<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例4:具有低劑量rhGDF-5(5毫升/條，0.5毫克/毫升)、海藻糖40毫克/毫升和甘氨酸10毫克/毫升的Healos⑧條(無菌)。每個(gè)條具有2.5毫克rhGDF-5、220毫克海藻糖和50毫克甘氨酸。海藻糖/甘氨酸溶液的制備17.84克二水合海藻糖和4.03克甘氨酸仔細(xì)稱重并轉(zhuǎn)移到無菌聚丙烯瓶中，在室溫下向其中加入300毫升純凈水并緩慢攪拌直到得到透明溶液。測量pH并發(fā)現(xiàn)pH為5.5。沒有加入鹽酸，使用純凈水將體積調(diào)節(jié)至350毫升。測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為5.5。使用海藻糖/甘氨酸溶液稀釋rhGDF-5溶液將39.47毫升rhGDF-5溶液小心轉(zhuǎn)入到聚丙烯瓶中，小心向其中加入海藻糖/甘氨酸溶液以將體積調(diào)節(jié)至295毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為4.1。將溶液在室溫下攪拌15分鐘。得到UV消光系數(shù)以精確計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)UV讀數(shù)，加入更多海藻糖溶液以在300毫升溶液得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為4.1;UV讀數(shù)指示0.507毫克/毫升的蛋白質(zhì)含量。溶液通過0.22微米過濾器過濾，并且溶液直接用于施加到無菌Healos⑧條上。使用無菌移液管將2.5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液等同施加在條的兩點(diǎn)上，每個(gè)條上總共有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。這些條置于鋼托盤中，并且將其小心包裝在無菌雙重袋中，并在無菌條件下進(jìn)行凍干。表4a:每個(gè)條具有海藻糖(200毫克)/rhGDF-5(2.5毫克)/甘氨酸(50毫克)的Healos⑧在2-8。C的穩(wěn)定性(實(shí)施例4)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表4b:每個(gè)條具有海藻糖(200毫克)/rhGDF-5(2.5毫克)/甘氨酸(50毫克)的Healos⑧在25°C的穩(wěn)定性(實(shí)施例4)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例5:具有rhGDF-5(0.5毫克/毫升，2.5毫克/條)、海藻糖40毫克/毫升、甘氨酸10毫克/毫升和聚山梨醇酯0.1毫克/毫升的Healos條(無菌)。每個(gè)條具有2.5毫克rhGDF-5、220毫克海藻糖、50毫克甘氨酸和0.5毫克聚山梨醇酯80。聚山梨醇酯80溶液的制備23.03毫克聚山梨醇酯80稱重到50毫升無菌一次性試管中，向其中加入25毫升純凈水并旋轉(zhuǎn)2分鐘以得到均勻溶液。海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液的制備10.19克二水合海藻糖和2.303克甘氨酸仔細(xì)稱重并轉(zhuǎn)移到無菌聚丙烯并瓦中，向其中加入25毫升上面得到的聚山梨醇酯80溶液。將聚山梨醇酯試管用25毫升純凈水清洗2次，并將清洗液轉(zhuǎn)入到海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液。向海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液中另外加入純凈水達(dá)到190毫升的總體積。將溶液攪拌2分鐘以得到透明溶液。測量溶液的pH并且發(fā)現(xiàn)pH為5.6;使用純凈水將體積調(diào)節(jié)至200毫升。測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為5.5。使用海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液稀釋rhGDF-5溶液將23.03毫升rhGDF-5溶液小心轉(zhuǎn)入到聚丙烯燒瓶中，小心向其中加入海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液以將體積調(diào)節(jié)至170毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為4.1。將溶液在室溫下攪拌15分鐘。得到UV消光系數(shù)以精確計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)UV讀數(shù)，加入更多海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液以在175毫升溶液得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為4.1;UV讀數(shù)指示0.510毫克/毫升的蛋白質(zhì)濃度。通過0.22微米過濾器過濾的溶液直接使用，在無菌條件下在層流罩中施加到無菌Healos⑧條上。使用無菌移液管將2.5毫升rhGDF-S/海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液等同施加在條的兩點(diǎn)上，每個(gè)條上總共有5毫升rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液。這些條置于鋼托盤中，并且將其小心包裝在無菌雙重袋中，并在無菌條件下進(jìn)行凍干。表5a:每個(gè)條具有海藻糖U00毫克)/rhGDF-5(2.5毫克)/甘氨酸(50毫克)/聚山梨醇酯80(0.5毫克)的Healos⑧在2-8。C的穩(wěn)定性(實(shí)施例5)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)施例6:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)的凍干小瓶產(chǎn)品海藻糖溶液的制備無菌聚丙烯瓶加入12.16克二水合海藻糖并安裝磁力攪拌棒，在室溫下向其中加入190毫升純凈水。將溶液在室溫下攪拌直到海藻糖徹底溶解。測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為6.5。向透明海藻糖溶液中逐滴加入0.1N鹽酸以將pH調(diào)節(jié)至5.8。將溶液體積用純凈水調(diào)節(jié)至200毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為5.5。將溶液通過0.22微米過濾器過濾并直接用于稀釋蛋白質(zhì)溶液。使用海藻糖溶液稀釋rhGDF-5溶液將14.47毫升rhGDF-5溶液小心轉(zhuǎn)入到聚丙烯燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)燒瓶的同時(shí)向其中緩慢加入海藻糖溶液至100毫升的最終體積。溶液在室溫下偶爾旋轉(zhuǎn)15分鐘；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為3.0。根據(jù)UV讀數(shù)，加入更多海藻糖溶液以在110毫升得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為3.1;UV讀數(shù)指示0.510毫克/毫升的蛋白質(zhì)濃度。將溶液通過0.22孩i米過濾器過濾并且直接加入到小并瓦中。填充小瓶1.1毫升rhGDF-5/海藻糖溶液手動(dòng)加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，并且每個(gè)小瓶在進(jìn)入凍干器前部分用塞子封閉。凍干后將塞子壓緊并折邊。以白色至灰白色結(jié)塊(cake)得到產(chǎn)品。表6a:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小并瓦在2-8匸的穩(wěn)定性(實(shí)施侈6)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表6b:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小瓶在25r的穩(wěn)定性(實(shí)施例6)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)施例7:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加甘露醇(50毫克/毫升)的凍干小并瓦產(chǎn)品甘露醇溶液的制備無菌聚丙烯瓶加入11.52克甘露醇并安裝磁力攪拌棒，在室溫下向其中加入185毫升純凈水。將混合物在室溫下攪拌10分鐘直到甘露醇徹底溶解。測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為6.6。向透明溶液中逐滴加入0.1N鹽酸以將pH調(diào)節(jié)至5.5。將溶液體積用純凈水調(diào)節(jié)至200毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為5.7。將溶液通過0.22孩么米過濾器過濾并直接用于稀釋蛋白質(zhì)溶液。使用甘露醇溶液稀釋rhGDF-5溶液向聚丙烯燒〗f瓦中小心轉(zhuǎn)入14.48毫升rhGDF-5溶液；向其中小心加入甘露醇溶液至100毫升的體積。溶液在室溫下旋轉(zhuǎn)15分鐘；得到UV消光系數(shù)以精確計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)UV讀數(shù)，加入更多甘露醇溶液以在110毫升溶液中得到所需蛋白質(zhì)濃度0.5毫克/毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為3.1;UV讀數(shù)指示0.498毫克/毫升的蛋白質(zhì)濃度。將溶液通過0.22微米過濾器過濾并且直接加入到小瓶中。填充小瓶1.1毫升甘露醇/rhGDF-5溶液手動(dòng)加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，并且每個(gè)小瓶在進(jìn)入凍干器前部分用塞子封閉。凍干后將塞子壓緊并折邊。以白色至灰白色結(jié)塊得到產(chǎn)品。表7a:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加甘露醇(50毫克/毫升)小瓶在2-纊C的穩(wěn)定性(實(shí)施例7)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>表7b:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加甘露醇(50毫克/毫升)小瓶在25C的穩(wěn)定性(實(shí)施例7)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實(shí)施例8:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)在pH為3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液中的凍干小瓶產(chǎn)品海藻糖溶液的制備無菌聚丙烯瓶加入12.16克二水合海藻糖并安裝磁力攪拌棒，在室溫下向其中加入200毫升pH為3.0的5mM甘氨酸-鹽酸緩沖液。將溶液在室溫下攪拌直到海藻糖徹底溶解。海藻糖/甘氨酸溶液的pH為3.1。將溶液通過0.22微米過濾器過濾并直接用于稀釋蛋白質(zhì)溶液。使用海藻糖溶液稀釋rhGDF-5溶液原料rhGDF-5溶液使用分子量為3000的截?cái)啾∧ぴ?-8匸相對于5mM甘氨酸-鹽酸緩沖液滲析。滲析后溶液略微濃縮至3.8毫克/毫升。將14.47毫升rhGDF-5溶液小心轉(zhuǎn)入到聚丙烯燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)燒瓶的同時(shí)向其中緩慢加入海藻糖-甘氨酸溶液至100毫升的最終體積。溶液在室溫下偶爾旋轉(zhuǎn)15分鐘；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為3.0。根據(jù)UV讀數(shù)，加入更多海藻糖-甘氨酸溶液以在U0毫升溶液中得到所需蛋白質(zhì)濃度0.5毫克/毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為3.0;UV讀數(shù)指示0.507毫克/毫升的蛋白質(zhì)濃度。將溶液通過0.22微米過濾器過濾并且直接加入到小瓶中。填充小瓶1.1毫升rhGDF-5/海藻糖溶液手動(dòng)加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，并且每個(gè)小瓶在進(jìn)入凍干器前部分用塞子封閉。凍干后將塞子壓緊并折邊。以白色至灰白色結(jié)塊得到產(chǎn)品。表8:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小瓶在pH為3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液中的穩(wěn)定性(實(shí)施例8)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實(shí)施例9:rhGDF-5(0,5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)在pH為3.0的磷酸鹽緩沖液中的凍干小瓶產(chǎn)品海藻糖溶液的制備無菌聚丙烯瓶加入12.16克二水合海藻糖并安裝磁力攪拌棒，在室溫下向其中加入200毫升pH為3.0的5mM磷酸鹽緩沖液。將溶液在室溫下攪拌直到海藻糖徹底溶解。海藻糖/磷酸鹽緩沖液溶液的pH為3.0。將溶液通過0.22微米過濾器過濾并直接用于稀釋蛋白質(zhì)溶液。使用海藻糖溶液稀釋rhGDF-5溶液原料rhGDF-5溶液使用分子量為3000的截?cái)啾∧ぴ?-8°C相對于磷酸鹽緩沖液滲析。滲析后溶液略^f敖濃縮至3.8毫克/毫升。將14.47毫升rhGDF-5溶液小心轉(zhuǎn)入到聚丙烯燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)燒瓶的同時(shí)向其中緩慢加入海藻糖/磷酸鹽緩沖液至100毫升的最終體積。溶液在室溫下偶爾旋轉(zhuǎn)15分鐘；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為3.0。根據(jù)UV讀數(shù)，加入更多海藻糖/磷酸鹽緩沖液以在110毫升得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為3.0;UV讀數(shù)指示0.50毫克/毫升的蛋白質(zhì)濃度。將溶液通過0.22微米過濾器過濾并且直接加入到小瓶中。填充小瓶1.1毫升rhGDF-5/海藻糖溶液手動(dòng)加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，并且每個(gè)小瓶在進(jìn)入凍干器前部分用塞子封閉。凍干后將塞子壓緊并折邊。以白色至灰白色結(jié)塊得到產(chǎn)品。表9:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小瓶在pH為3.0的磷酸鹽緩沖液中的穩(wěn)定性(實(shí)施例9)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實(shí)施例10:具有2.5毫克rhGDF-5和250毫克海藻糖的粉碎化膠原圓柱體海藻糖溶液的制備9.56克二水合海藻糖仔細(xì)稱重并加入到無菌聚丙烯瓶中，在室溫下向其中加入145毫升純凈水并緩慢攪拌直到得到透明溶液。測量該透明溶液的pH并且發(fā)現(xiàn)其為5.3。使用純凈水調(diào)節(jié)體積以得到150毫升的最終體積。測量溶液的pH并且發(fā)現(xiàn)其為5.3。該溶液直接用于稀釋蛋白質(zhì)溶液。使用海藻糖溶液稀釋rhGDF-5溶液將16.45毫升rhGDF-5溶液小心轉(zhuǎn)入到聚丙烯燒ife中，向其中小心加入海藻糖溶液以將體積調(diào)節(jié)至120毫升；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為2.9。溶液在室溫下攪拌15分鐘。得到UV消光系數(shù)以精確計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)UV讀數(shù)，加入更多海藻糖溶液以在125毫升溶液中得到0.5毫克/毫升的所需蛋白質(zhì)濃度；測量pH并且發(fā)現(xiàn)pH為2.9;UV讀數(shù)指示0.498毫克/毫升的蛋白質(zhì)濃度。使用rhGDF-5/海藻糖溶液配制粉碎化膠原圓柱體溶液通過0.22微米過濾器過濾，并直接使用所得溶液分布在預(yù)先形成的壓緊在Teflon模具中的粉碎化膠原圓柱體上。在凍干之前每個(gè)圓柱體配有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。表10:每個(gè)圓柱體中具有rhGDF-5(2.5毫克)和海藻糖("0毫克)的粉碎化膠原圓柱體在2-8'C的穩(wěn)定性(實(shí)施例10)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>已經(jīng)研發(fā)了制備具有賦形劑和可溶膠原凝膠的可流動(dòng)粉碎化膠原/rhGDF-5的不同實(shí)例，并且對每個(gè)實(shí)例評價(jià)了其性能、穩(wěn)定性和是否易于制備。粉碎化膠原實(shí)施例1-凍千為干燥形式的粉碎化膠原圓柱體&rhGDF-5-潤濕形式的膠原凝膠保持分離-兩者分別在2-8X:保持在分開的注射器中-兩者在注射前混合。4分碎化膠原實(shí)施例2-以濕潤形式混合在一起的粉碎化膠原圓柱體&rhGDF-5&膠原凝膠(沒有凍干)-全部以濕潤形式在2-8°C放在一個(gè)注射器中；即可使用粉碎化膠原實(shí)施例3-凍干為干燥形式的粉碎化膠原圓柱體&rhGDF-5&膠原凝膠-全部以千燥形式在2-8。C放在一個(gè)注射器中-在注射之前用水再水化。粉碎化膠原實(shí)施例4-粉碎化膠原圓柱體&膠原凝膠以糊狀物在一起-rhGDF-5以千燥形式單獨(dú)放置-兩者在2-8匸分別放在不同注射器中-兩者在注射之前混合。粉碎化膠原實(shí)施例5-粉碎化膠原圓柱體&膠原凝膠以千燥形式放在一起-rhGDF-5以干燥形式單獨(dú);改置-兩者在2-8。C分別放在不同注射器中-使用無菌水或骨髓吸出物重構(gòu)rhGDF-5-在注射之前千燥的粉碎化膠原和膠原與重構(gòu)的rhGDF-5溶液混合。在有例如甘露醇、蔗糖和海藻糖的幾種賦形劑并且存在或不存在緩沖劑和抗氧化劑的條件下，rhGDF-5的穩(wěn)定性通過以下方法評價(jià)RP-HPLC、差示掃描量熱(DSC)、圓二色光譜(CD)、偏振光顯微術(shù)(PLM)以及生物測定。幾種含有蔗糖的rhGDF-5凍干制劑在儲存期間顯示出不希望的黃色和玻璃狀結(jié)塊結(jié)構(gòu)，因而是沒有希望的。凍干rhGDF-5制劑的熔融性能使用DSC研究。DSC數(shù)據(jù)表明海藻糖和甘露醇基制劑顯著改善了原料rhGDF-5的熱穩(wěn)定性。圖1、2和3表示rhGDF-5的海藻糖制劑和甘露醇制劑的DSC曲線與原料rhGDF-5的DSC曲線的比較。原料rhGDF-5表現(xiàn)兩個(gè)主要轉(zhuǎn)變一個(gè)接近4(TC并且另一個(gè)接近85°C。高溫轉(zhuǎn)變可能表示蛋白質(zhì)的熱展開。值得注意的是，第一吸熱轉(zhuǎn)變的溶解溫度(Tm)在賦形劑的存在下增加7-14。C。單獨(dú)考慮時(shí)，該研究表明海藻糖和甘露醇可同樣有效地作為穩(wěn)定劑。海藻糖/rhGDF-5制劑的PLM(偏振光顯微術(shù))如圖4所示。樣品沒有顯示主要的雙折射現(xiàn)象。因此該體系為無定形，其對治療應(yīng)用來說理想的。圖5表示儲存一段時(shí)間后甘露醇/rhGDF-5制劑的PLM。在樣品中觀察到許多晶體，表明甘露醇在儲存期間已經(jīng)結(jié)晶。結(jié)果表明海藻糖為rhGDF-5更好的凍干保護(hù)劑。遠(yuǎn)UVCD光譜表明海藻糖基制劑具有與天然原料蛋白質(zhì)可比的次級結(jié)構(gòu)分布。具有各種賦形劑的凍干rhGDF-5通過RP-HPLC的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究清楚地表明，以50毫克/毫升或100毫克/毫升濃度存在海藻糖的rhGDF-5,不管存在還是不存在緩沖劑并且有還是沒有聚山梨醇酯，在2-8匸和15-25。C的儲存條件下一致產(chǎn)生改善的穩(wěn)定性，然而甘露醇在類似存儲條件下不能提供相同的穩(wěn)定性水平。凍干結(jié)塊制劑的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究清楚地表明，由在室溫和2-8。C儲存條件下，主峰顯著降低同時(shí)聚集物峰值增加可證明，甘露醇沒有穩(wěn)定蛋白質(zhì)。由于能夠產(chǎn)生免疫反應(yīng)和副作用，聚集物為蛋白質(zhì)制劑中最不希望的物質(zhì)。相比之下，如實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究中所證實(shí)，特別是在2-8匸的儲存條件下通過抑制聚集物的形成和保護(hù)主峰，海藻糖很好地穩(wěn)定了蛋白質(zhì)。因此在穩(wěn)定制劑中的rhGDF-5時(shí)，海藻糖比甘露醇更好。實(shí)時(shí)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)還表明，具有磷酸鹽或甘氨酸作為緩沖液以控制pH的rhGDF-5/海藻糖制劑比沒有緩沖液的rhGDF-5/海藻糖制劑更好。實(shí)時(shí)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表明，rhGDF-5海藻糖/甘氨酸制劑的理想儲存是在2-8°C,并且在25。C儲存也合適。除了海藻糖基rhGDF-5制劑有利的生化和生理數(shù)據(jù)外，這些制劑還在石咸性-疇酸酶生物測定中顯示效力。物理化學(xué)分析方法、體外測試方法以及實(shí)時(shí)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)顯示海藻糖在凍干獨(dú)立產(chǎn)品中，以及用于治療各種肌骨骼病癥的膠原基組合產(chǎn)品中，在穩(wěn)定rhGDF-5中作為優(yōu)越賦形劑的前途o實(shí)施例11:rhGDF-5在不同離子強(qiáng)度溶液和兩種pH緩沖液(pH3和pH4)中的溶解度磷酸鈉緩沖劑的不同離子強(qiáng)度的溶液用于該研究。原料蛋白質(zhì)溶液濃縮至約10毫克/毫升并且使用5、10、25、50和100mM磷酸鹽緩沖液在pH3或pH4滲析。滲析后，；險(xiǎn)查樣品透明度并在UV-Vis分光光度計(jì)上分析蛋白質(zhì)濃度。詳細(xì)步驟如下所述。緩沖液制備pH為3的100mM磷酸鹽緩沖液13.5毫升濃磷酸(14.8M)溶液轉(zhuǎn)入到2000毫升燒杯，向其中加入去離子水以達(dá)到1900毫升刻度。將溶液使用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3并轉(zhuǎn)入2000毫升量筒。加入水補(bǔ)充到2000毫升。然后倒回?zé)⒊浞只旌?。pH為3的50mM磷酸鹽緩沖液6.76毫升濃磷酸(14.8M)溶液轉(zhuǎn)入到2000毫升燒杯，向其中加入去離子水以達(dá)到1900毫升刻度。將溶液使用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3并轉(zhuǎn)入2000毫升量筒。加入水補(bǔ)充到2000毫升。然后倒回?zé)⒊浞只旌稀H為3的25mM磷酸鹽緩沖液3.39毫升濃磷酸(14.8M)溶液轉(zhuǎn)入到2000毫升燒杯，向其中加入去離子水以達(dá)到1900毫升刻度。將溶液使用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3并轉(zhuǎn)入2000毫升量筒。加入水補(bǔ)充到2000毫升。然后倒回?zé)⒊浞只旌稀H為3的10mM-粦酸鹽緩沖液1.35毫升濃磷酸(14.8M)溶液轉(zhuǎn)入到2000毫升燒杯，向其中加入去離子水以達(dá)到1900毫升刻度。將溶液使用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3并轉(zhuǎn)入2000毫升量筒。加入水補(bǔ)充到2000毫升。然后倒回?zé)⒊浞只旌?。pH為3的5mM磷酸鹽緩沖液0.676毫升濃磷酸(14.8M)溶液轉(zhuǎn)入到2000毫升燒杯，向其中加入去離子水以達(dá)到1900毫升刻度。將溶液使用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3并轉(zhuǎn)入2000毫升量筒。加入水補(bǔ)充到2000毫升。然后倒回?zé)⒊浞只旌?。樣品制備原料蛋白質(zhì)rhGDF-5(Lot#2142131)在2-8。C解凍。原料蛋白質(zhì)溶液(24毫升，3.8毫克/毫升)使用離心過濾裝置(PallLifeScience,Cat#OD010C37,10KMWCO)濃縮至約6毫升的體積。約0.9毫升濃縮的rhGDF-5溶液轉(zhuǎn)入到各個(gè)滲析過濾片(cassette)中(Pierce,Cat#66380)并相對于磷酸鹽緩沖液在室溫下滲析整夜。濃縮的rhGDF-5溶液小心從滲析過濾片中移出并放入小玻璃管中以#全查溶液透明度。如分析方法部分所述，蛋白質(zhì)濃度在UV-Vis分光光度計(jì)上確定。在pH為4的溶解度通過向pH為3的緩沖液中加入更多的氫氧化鈉溶液由pH為3的緩沖液制備pH為4.0的緩沖液。蛋白質(zhì)溶液相對于pH為4的緩沖液在室溫下滲析整夜。分析樣品的溶液透明度和蛋白質(zhì)濃度。分析方法對小玻璃管中的溶液樣品檢查透明度和顆粒。樣品小瓶使用垂直光線對著黑色背景檢查。試樣的透明度與作為對照的純凈水樣品比較。每個(gè)溶液樣品的pH直接使用校準(zhǔn)pH計(jì)測量。結(jié)果10毫克/毫升rhGDF-5溶液溶解度研究的結(jié)果表明，在5、10和25mM較低離子強(qiáng)度的磷酸鈉緩沖液中得到透明溶液，顯示良好的溶解度，然而在50和100mM較高離子強(qiáng)度的磷酸鈉緩沖液中得到混濁溶液，顯示較差的溶解度。在pH為4時(shí)，5和10mM磷酸鈉緩沖液得到混濁溶液，顯示較差的溶解度。25、50和lOOmM的磷酸鈉緩沖液在離心后得到透明溶液，然而具有接近零的蛋白質(zhì)回收率，表明蛋白質(zhì)已經(jīng)沉淀。因此，接近pH為3的低離子強(qiáng)度緩沖液將優(yōu)于在較高pH的高離子強(qiáng)度緩沖液。實(shí)施例12:rhGDF-5在具有5%海藻糖的各種緩沖液中在不同溫度下的穩(wěn)定性在此研究中，測試了各種緩沖液在保護(hù)5%海藻糖溶液中0.7毫克/毫升rhGDF-5在冷凍干燥期間和在5X:儲存時(shí)的影響。測試的緩沖液為pH為3的5mM甘氨酸-鹽酸、pH為3的5mM;壽酸鈉、pH為3的5mM斗寧檬酸鈉、pH為3的10mM乳酸鈉、水中的0.0"/。TFA、1mM鹽酸，以及不存在海藻糖的rhGDF-5在1mM鹽酸中的對照溶液。緩沖液如下制備pH為3的5mM甘氨酸緩沖液2000毫升燒杯中加入0.75克甘氨酸(分子量75.05克)和1900毫升去離子水；在攪拌下將該溶液使用鹽酸溶液滴定至pH為3。加入水補(bǔ)充至2000毫升并充分混合。pH為3的5mM檸檬酸緩沖液2000毫升燒杯中加入2.11克一水合檸檬酸(分子量210.14克)和1900毫升去離子水；將該溶液用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3。加入水補(bǔ)充至2000毫升并將溶液充分混合。pH為3的5mM磷酸鹽緩沖液將0.676毫升磷酸溶液(14.8M)轉(zhuǎn)入到含有1900毫升去離子水的2000毫升燒杯中；將該溶液用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3。加入水補(bǔ)充至2000毫升并將溶液充分混合。pH為3的10mM乳酸鹽緩沖液2000毫升燒杯中加入1.81克乳酸(分子量90.08)和1900毫升去離子水；將所得溶液用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3。加入水補(bǔ)充至2000毫升并將溶液充分混合。1mM鹽酸溶液1毫升2N鹽酸溶液轉(zhuǎn)入到含有1900毫升去離子水的2000毫升燒杯中。通過加入更多去離子水將溶液的最終體積調(diào)節(jié)至2000毫升。0.01yjFA溶液0.2毫升TFA溶液轉(zhuǎn)入到含有1900亳升去離子水的2000毫升燒杯中。通過加入更多去離子水將溶液的最終體積調(diào)節(jié)至2000毫升并將溶液充分混合。制劑制備原料蛋白質(zhì)rhGDF-5(Lot#2142131)在2-8。C解凍。原料蛋白質(zhì)溶液(55毫升，3.8毫克/毫升)使用離心過濾裝置(PallLifeScience,Cat#OD010C37,10KMWCO)濃縮至約10毫升的體積。約1.4毫升濃縮的rhGDF-5溶液轉(zhuǎn)入到各個(gè)滲析過濾片(cassette)中(Pierce,Cat#66380)過濾片相對于測試緩沖液在2-8。C滲析整夜。rhGDF-5溶液小心/人滲析過濾片中除去并轉(zhuǎn)入到小玻璃并瓦中。溶液的蛋白質(zhì)濃度使用UV-VlS分光光度計(jì)測量。蛋白質(zhì)以約0.7毫克/毫升和5%(重量/體積)的海藻糖配制在測試緩沖液中，并通過0.22微米過濾器過濾。溶液在凍千之前在2-8i:儲存。裝填和凍干每個(gè)配制溶液以1毫升/瓶裝填進(jìn)3毫升玻璃瓶中(WestPharmaceuticalServices,Cat#68000316)。3皮璃并瓦用塞子(WestPharmaceuticalServices,Cat#99150630)部分封閉并轉(zhuǎn)入凍干器(FTSSystem,LyoStarII)中。熱電偶置于空白對照劑瓶中以監(jiān)測凍干過程。作為對照，還測試了沒有海藻糖的另一制劑。將200微升lmM鹽酸溶液中濃度為4.5毫克/毫升的rhGDF-5轉(zhuǎn)入到每個(gè)玻璃瓶并凍干。分析方法凍干結(jié)塊的完整性檢查凍干樣品中凍干結(jié)塊裂縫、收縮和崩解的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)。重構(gòu)時(shí)間1毫升去離子水加入到每個(gè)凍干樣品中并輕輕混合。記錄重構(gòu)時(shí)間。溶液透明度4見覺外觀對小玻璃并瓦中的溶液樣品檢查透明度和顆粒。樣品瓶/使用垂直光線對著黑暗背景檢查。將測試樣品的透明度與作為對照的純水樣品比較。.pH方法每個(gè)溶液樣品的pH直接使用校準(zhǔn)pH計(jì)測量。UV光譜蛋白質(zhì)濃度使用UV-Vis分光光度計(jì)確定。rhGDF-5的濃度使用在280納米的1.16毫升/毫克*厘米的消光系數(shù)計(jì)算。HPLC方法非還原(non-reduced)rpHPLC法(TM0051D)用于監(jiān)測蛋白質(zhì)的改進(jìn)類型。測試樣品使用50mM乙酸稀釋到約0.1毫克rhGDF-5/毫升溶液。稀釋樣品(每個(gè)50毫升)注入到HPLC柱(Vydac218TP52,C18柱)。樣品使用水中0.15%(體積/體積)的TFA和乙腈中0.15%(體積/體積)的TFA作為流動(dòng)相以0.3毫升/分鐘洗脫。在214納米檢測到洗脫峰。計(jì)算每個(gè)峰面積的百分比以監(jiān)測主峰和較小峰(降解峰)的改變體積排阻色譜(SEC)蛋白質(zhì)聚集物使用SEC法監(jiān)測。通常30微升每種測試樣品直接注入到SEC柱(TOSOHBioscience,Cat#08540)并且使用水中0.1%(體積/體積)TFA和45%(體積/體積)乙腈以0.5毫升/分鐘的速率洗脫。在280納米監(jiān)測到蛋白質(zhì)峰，并且計(jì)算聚集物的百分比。凝膠電泳蛋白質(zhì)聚集物和降解的小塊還使用凝膠電泳法監(jiān)測。通常，約10微克蛋白質(zhì)被干燥并使用70微升具有或沒有10%P-巰基乙醇的SDS-PAGE樣品緩沖液(Invitrogen,Cat#LC2676)重構(gòu)。樣品在95°C培養(yǎng)5分鐘。約18微升每個(gè)樣品加載到凝膠(Invitrogen，Cat#NP0341Box)上。凝膠使用流動(dòng)緩沖液(Invitrogen,Cat#NP0002)在200伏電壓流動(dòng)約35分鐘。然后〗疑月史^f吏用Simplybluesolution(Invitrogen,Cat#LC6060)著色并使用去離子水脫色。掃描凝膠并收集圖像。生物活性測試僅僅分析6個(gè)月穩(wěn)定的樣品(甘氨酸制劑和鹽酸制劑)的生物學(xué)活性?；诩?xì)胞的測試(TM0046)用于測量^5威性磷酸酶活性以確定樣品的穩(wěn)定性。-含水量含水量測試使用卡爾.費(fèi)歇爾滴定法(KarlFischerTitrationmethod)通過PDD進(jìn)4亍。結(jié)果凍干結(jié)塊的完整性從時(shí)間零點(diǎn)到9-月時(shí)間點(diǎn)所有儲存條件下的測試樣品結(jié)塊都顯示為固體和白色至灰白色。當(dāng)例如海藻糖或蔗糖的糖類用作填充劑時(shí)，通常觀察到結(jié)塊的輕微收縮，或者結(jié)塊從玻璃瓶的玻璃壁略微分離。所有測試樣品沒有觀察到結(jié)塊的崩解。結(jié)塊崩解通?？梢愿淖冎貥?gòu)時(shí)間并引起蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。在沒有海藻糖的制劑中得到白色、松軟和輕質(zhì)的結(jié)塊。重構(gòu)時(shí)間在測試時(shí)，向每個(gè)樣品瓶中加入1毫升水。將樣品輕輕混合并記錄重構(gòu)時(shí)間。結(jié)塊完全溶解需要約30-40秒。溶液透明度重構(gòu)的溶液樣品在垂直光線下對著黑色背景檢查，發(fā)現(xiàn)全部試樣溶液透明并且無色。.pH使用校準(zhǔn)pH計(jì)測量重構(gòu)溶液的pH。在整個(gè)研究過程中，全部制劑的pH都沒有發(fā)生顯著變化。含有海藻糖/緩沖劑的制劑樣品的pH約為3.0±0.2。沒有海藻糖的制劑的pH約為4.0。UV光譜蛋白質(zhì)濃度在UV-VIS分光光度計(jì)上測量。在整個(gè)研究中，在含有甘氨酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、乳酸鹽緩沖液或o.oi%TFA的rhGDF-5/海藻糖制劑中，蛋白質(zhì)濃度沒有顯著變化。當(dāng)其在25。C/60。/。和40°C/60%RH儲存時(shí)，rhGDF-5/海藻糖/鹽酸制劑中在280納米的吸光度增加。蛋白質(zhì)的濃度在40。C儲存的制劑中似乎增加；由時(shí)間零點(diǎn)的0.7毫克/毫升的初始蛋白質(zhì)濃度增加到6-月時(shí)間點(diǎn)的1毫克/毫升。這可以暗示海藻糖可能降解成糠醛化合物，其在280納米具有類似的吸光度。非還原rhHPLC結(jié)果非還原rhHPLC法用來監(jiān)測rhGDF-5的降解物質(zhì)，其通過蛋氨酸氧化、脫酰胺反應(yīng)以及其它反應(yīng)形成。除鹽酸制劑和沒有海藻糖的制劑外，對于在2-8。C和25t:儲存9個(gè)月的全部制劑，主峰的百分比沒有顯著變化。全部制劑在9-月時(shí)間點(diǎn)具有小于90%的主峰。然而當(dāng)制劑在例如4CTC/75%RH的加速卩渚存條件下卩諸存時(shí)，^又僅一種制劑(即，rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸)在6-月時(shí)間點(diǎn)時(shí)具有大于91%的主峰。其它制劑在加速儲存條件下不如rhGDF-W海藻糖/甘氨酸制劑穩(wěn)定。特別地，rhGDF-5/海藻糖/鹽酸制劑在6-月時(shí)間點(diǎn)僅僅具有66%的主峰。圖6和圖7表示在4CTC/75%RH儲存6個(gè)月時(shí)rhGDF-S/海藻糖/甘氨酸制劑和rhGDF-5/海藻糖/鹽酸制劑的HPLC色譜。圖8、9和10表示在5'C、25。C和4(TC儲存時(shí)各種測試緩沖劑的蛋白質(zhì)回收百分率。rpHPLC分析結(jié)果表明海藻糖和甘氨酸緩沖劑的組合在儲存期間為凍干rhGDF-5提供最好的穩(wěn)定性。此外，由于強(qiáng)酸HC1可能對蛋白質(zhì)和海藻糖具有一定的去穩(wěn)定作用，rhGDF-5/海藻糖/鹽酸制劑不太穩(wěn)定。實(shí)施例13:rhGDF-5在具有5%海藻糖的pH為3的甘氨酸緩沖劑中在不同溫度下的穩(wěn)定性在此研究中，rhGDF-5以約0.01、0.03、0.1、2.5、4.5和9毫克/毫升與5%(重量/體積)海藻糖和pH為3的5mM甘氨酸-鹽酸緩沖液一起配制。配制的溶液用來以1毫升/并瓦添加到3毫升玻璃并瓦中并將玻璃瓶j凍干。凍干的樣品瓶在2-8°C、25°C/60%RH和40°C/75%RH儲存。在每個(gè)指定時(shí)間點(diǎn)分析樣品的產(chǎn)品穩(wěn)定性。該研究中使用的方法包括結(jié)塊外觀、重構(gòu)時(shí)間、溶液透明度、pH、rpHPLC(反相高效液相色譜)、UV(紫外光譜)、SEC(體積排阻色譜)和凝膠電泳。在三種儲存條件下存儲6個(gè)月后，在具有低至0.1毫克/毫升至高達(dá)9毫克/毫升的蛋白質(zhì)濃度的制劑中沒有觀察到顯著變化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度太低時(shí)，例如0.01和0.03毫克/毫升，現(xiàn)有方法不足以檢測微小變化。該研究結(jié)果表明含有海藻糖和甘氨酸-鹽酸并具有不同蛋白質(zhì)濃度的凍干rhGDF-5制劑在2-8°C、25°C/60%RH至少穩(wěn)定6個(gè)月。在4CTC/75%RH的加速儲存條件下在6-月時(shí)間點(diǎn)在儲存的產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)輕微的rpHPLC曲線改變。實(shí)施例14:不同濃度的rhGDF-5在具有5%海藻糖的pH為3的甘氨酸緩沖劑中在不同溫度下的穩(wěn)定性在該研究中，rhGDF-5以0.01、0.03、0.1、2.5、4.5和9毫克/毫升的rhGDF-5濃度與5%(重量/體積)海藻糖和pH為3的5mM甘氨酸緩沖液一起配制。此外作為對比，4.5毫克/毫升rhGDF-S與10%(重量/體積)海藻糖和5mM甘氨酸緩沖液(pH為3)—起配制為制劑。然后配制的溶液以1毫升/瓶添加到3毫升玻璃并瓦中并凍干。凍干的樣品儲存在穩(wěn)定的容器中。.PH為3的5mM甘氨酸-鹽酸緩沖液3x0.75克甘氨酸(分子量75.07克)稱重到3x2000毫升的燒杯中，并且向每個(gè)燒杯中加入約1900毫升去離子水。溶液使用鹽酸滴定至pH為3。向每個(gè)燒杯中加入額外的水以達(dá)到2000毫升的最終體積并充分混合。制劑制備原料蛋白質(zhì)rhGDF-5(Lot#2142131)在2-8°。解凍。蛋白質(zhì)溶液(96毫升，3.8毫克/毫升)使用4離心過濾裝置(PallLifeScience,Cat#OD010C37,10KMWCO)濃縮至約24毫升的總合并體積。約3x8毫升濃縮的rhGDF-5溶液轉(zhuǎn)入到3x滲析過濾片(cassette)中(Pierce,Cat#66380),并且過濾片相對于甘氨酸-鹽酸緩沖液在2-8X:滲析整夜。rhGDF-5溶液從滲析過濾片中轉(zhuǎn)移到小玻璃瓶中。蛋白質(zhì)濃度使用UV-Vis分光光度計(jì)測量。蛋白質(zhì)使用5%或10%(重量/體積)的海藻糖和如上所述5mM甘氨酸緩沖液以各種濃度配制。配制的溶液通過0.22微米過濾器過濾，并且在凍干之前在2-8。C儲存。填充和凍干每個(gè)配制的溶液以1毫升/并瓦添加到3毫升玻璃并瓦(WestPharmaceuticalServices,Cat#68000316)中。塞子(WestPharmaceuticalServices,Cat#99150630)部分》文置在玻璃弁瓦上。樣品并瓦轉(zhuǎn)入到凍干器(FTSSystem,LyoStarII)中。熱電偶置于空白對照劑弁瓦中以監(jiān)測凍干過程的溫度曲線。使用的分析方法類似于如上所述實(shí)施例11和實(shí)施例12中的那些。結(jié)果凍干結(jié)塊的完整性從時(shí)間零點(diǎn)到6-月時(shí)間點(diǎn)，所有儲存條件下的測試樣品結(jié)塊都顯示為固體和白色。在結(jié)塊周圍觀察到輕微的收縮，或者結(jié)塊從玻璃瓶的玻璃壁略微分離。當(dāng)例如海藻糖或蔗糖的糖類用作填充劑時(shí)這相當(dāng)普遍。所有測試樣品沒有觀察到崩解的結(jié)塊。-重構(gòu)時(shí)間在測試時(shí)，向每個(gè)樣品瓶中加入1毫升水。玻璃瓶輕輕混合并記錄重構(gòu)時(shí)間。結(jié)塊溶解需要約30-40秒。溶液透明度當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液使用垂直光線對著黑色背景檢查時(shí)，全部重構(gòu)樣品透明并且無色。.pH重構(gòu)溶液用于測量pH。在整個(gè)研究過程中，全部制劑的pH都沒有發(fā)生顯著變化。制劑的pH值為3.0-3.3。UV光譜蛋白質(zhì)濃度使用UV光譜法測量。UV光譜還可提供蛋白質(zhì)聚集的信息(基線光散射)。對于0.01-0.1毫克/毫升的蛋白質(zhì)濃度，使用10毫米透明容器。對于2-9毫克/毫升的蛋白質(zhì)濃度，使用l毫米透明小容器，沒有稀釋或沒有樣品破壞。在穩(wěn)定性研究的整個(gè)過程中，在0.1-9毫克/毫升的樣品中沒有觀察到蛋白質(zhì)濃度的顯著變化。對于0.01-0.03毫克/毫升的低濃度樣品，由于吸光度太低而沒有觀察到更多變化。對于未來研究的低濃度樣品，應(yīng)當(dāng)需要新樣品制備方法。非還原rhHPLC結(jié)果非還原rhHPLC法用來監(jiān)測rhGDF-5的降解物質(zhì)，例如蛋氨酸氧化和脫酰胺。在整個(gè)6個(gè)月儲存期間，在2-8。C、25。C和4(TC儲存的全部樣品中沒有觀察到主峰百分比的顯著變化。在6個(gè)月儲存的樣品的rhGDF-5的主峰仍然回復(fù)為^96%,并且其與從時(shí)間零點(diǎn)樣品得到的數(shù)據(jù)是可比的。0.01和0.03毫克/毫升的低濃度樣品難以通過HPLC法分析。未來研究應(yīng)當(dāng)需要新樣品制備。SECSEC用于監(jiān)測蛋白質(zhì)聚集。在整個(gè)6個(gè)月穩(wěn)定性測試期間，全部樣品都沒有觀察到聚集的顯著變化。沒有分析0.01和0.03毫克/毫升的低濃度樣品。;疑力交電泳蛋白質(zhì)聚集和分解的物質(zhì)還使用凝膠電泳監(jiān)測。在整個(gè)6個(gè)月穩(wěn)定性測試期間，全部樣品都沒有發(fā)現(xiàn)顯著變化。存儲期間沒有在任何樣品中形成蛋白質(zhì)的小片段，因?yàn)闆]有在還原SDS-PAGE上發(fā)現(xiàn)。含水量樣品的含水量低至0.19至0.32%。在蛋白質(zhì)濃度和含水量之間沒有觀察到相關(guān)性或趨勢。通過rpHPLC和SEC色譜證明，所得結(jié)果表明凍干的rhGDF-5產(chǎn)品在海藻糖和甘氨酸緩沖劑的存在下在2-8°C、25。C/60。/。RH和40°C/75%RH穩(wěn)定至少6個(gè)月。使用5%(重量/體積)海藻糖/5mM甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH為3),蛋白質(zhì)可以在0.1-9毫克/毫升的不同濃度范圍配制(凍干之前)并且凍干。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)以例如0.01毫克/毫升和0.03毫克/毫升的低濃度配制時(shí)，現(xiàn)有方法對測定變化具有某些限制。本發(fā)明已經(jīng)根據(jù)說明性實(shí)施方案進(jìn)行了說明。由于在不脫離本發(fā)明范圍的情況下可以對上述制劑作出改變，上述說明或附圖中所示的全部物質(zhì)將作為說明性而非限制性解釋。例如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識到，本發(fā)明說明性實(shí)施方案中的制劑不限于使用BMP,并且可以使用任<可合適的生物體系中的其它生物分子。-還應(yīng)當(dāng)理解的是以下權(quán)利要求將覆蓋本發(fā)明此處所述的全部通用和特疋特征，并且本發(fā)明范圍的全部聲明作為語言上的要素將落入其中。。權(quán)利要求1.包括至少一種BMP和足以穩(wěn)定所述BMP的量的海藻糖的組合物。2.權(quán)利要求l的組合物，另外包括pH為從約2.5至約3.5的甘氨酸緩沖液。3.權(quán)利要求l的組合物，其中所述BMP為rhGDF-5。4.權(quán)利要求2的組合物，其中所述BMP為rhGDF-5。5.穩(wěn)定BMP的方法，包括(a)提供含有至少一種BMP和足以穩(wěn)定所述BMP的量的海藻糖的組合物，(b)凍干該混合物。6.權(quán)利要求5的方法，另外包括加入pH為從約2.5至約3.5的甘氨酸緩沖液。7.權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的方法，其中所述BMP為rhGDF-5。8.植入在哺乳動(dòng)物中的裝置，所述裝置包括至少一種凍千BMP,其中BMP已經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求5的方法凍干。9.權(quán)利要求8的裝置，另外包括可生物降解的膠原基質(zhì)。10.權(quán)利要求8的裝置，其中所述BMP為rhGDF-5。11.植入在哺乳動(dòng)物中的裝置，所述裝置包括至少一種凍千BMP,其中BMP已經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求6的方法凍干。12.權(quán)利要求ll的裝置，另外包括可生物降解的膠原基質(zhì)。13.權(quán)利要求ll的裝置，其中所述BMP為rhGDF-5。全文摘要本發(fā)明涉及在各種凍干制劑和組合物中穩(wěn)定骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP′s)。本發(fā)明包括主要含有作為賦形劑的海藻糖并且任選含有其它賦形劑的制劑，海藻糖用于凍干組合物以及其隨后的儲存和重構(gòu)，其它賦形劑例如緩沖劑和表面活性劑。文檔編號A61P43/00GK101348524SQ20071019987公開日2009年1月21日申請日期2007年12月14日優(yōu)先權(quán)日2006年12月14日發(fā)明者D·蘇,R·坎扎達(dá),S·J·薩瓦穆拉,V·R·加里加帕蒂申請人:強(qiáng)生更生醫(yī)療有限責(zé)任公司