本發(fā)明屬于蔬菜農(nóng)藝性狀分子標(biāo)記開發(fā)和分子標(biāo)記輔助育種，具體涉及一種適用于西瓜幼苗耐低溫葉面積性狀快速篩選和分子標(biāo)記輔助育種的kasp分子標(biāo)記及用途。

背景技術(shù)：

1、低溫脅迫是影響植物生長、發(fā)育、生產(chǎn)力和分布的主要環(huán)境因素。根據(jù)溫度范圍不同，低溫脅迫可以分為冷脅迫（chilling?stress，0℃及以上）和凍脅迫（freezing?stress，0℃以下），其中冷脅迫是熱帶及亞熱帶地區(qū)植物遭遇的主要脅迫方式。冷脅迫在植物整個生長發(fā)育進程中都能造成不利影響，低溫會降低種子的發(fā)芽勢及幼苗出土率，導(dǎo)致植株生長緩慢、苗弱、葉片萎蔫、坐果率低、產(chǎn)量及品質(zhì)下降等（guo?x，2018；王毅，1994；ding?y，2019；ruelland?e，2009；thomashow?mf，1999）。

2、植株的外部形態(tài)特征是植株對低溫脅迫最直接的表現(xiàn)，能夠直觀地反映植物的抗冷性。葉面積是指葉片的表面積，它能直接影響植物對光能的吸收和利用。眾多研究表明，在低溫脅迫下，黃瓜、番茄、辣椒等園藝作物葉片會出現(xiàn)水漬狀斑點，發(fā)生萎蔫卷曲干枯等現(xiàn)象，導(dǎo)致植物葉面積的減少，最終減少光合作用效率和光合作用總量。因此葉面積的變化能很好得代表植物耐冷性的好壞，且具有好觀察、易測量的優(yōu)點，在生產(chǎn)上具有重要意義。

3、西瓜[citrullus?lanatus?(thunb.)?matsum.?&?nakai]?是重要的經(jīng)濟作物,?栽培地域廣闊,?經(jīng)濟效益顯著。我國是世界重要的西瓜生產(chǎn)國和消費國，近年來，我國西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，面積、產(chǎn)量連續(xù)多年位居全球第一。2022年我國西瓜的收獲面積、產(chǎn)量分別為138.40萬hm2、6038.61萬t，分別占全球的47.46%、60.41%。隨著產(chǎn)業(yè)化、專業(yè)化步伐的加快，西瓜生產(chǎn)逐步走向區(qū)域化和規(guī)?；a(chǎn)格局。從全國區(qū)域布局來看，西瓜生產(chǎn)布局主要以華東和中南兩大地區(qū)為主，兩區(qū)域合計生產(chǎn)了70%左右的西瓜（余家慶,?2024）。

4、西瓜原產(chǎn)于非洲熱帶地區(qū)，對低溫反應(yīng)敏感。華東地區(qū)西瓜早春栽培，其苗期或定植初期常常受到低溫侵襲影響了植株生長發(fā)育，推遲了果品上市期，造成較大經(jīng)濟損失。生產(chǎn)上通常采取物理措施（多層覆蓋、人工加溫等）、栽培措施（嫁接、低溫?zé)捗纭⒄{(diào)節(jié)基質(zhì)物料配比、添加益生菌等）、噴施化學(xué)試劑（激素類生長調(diào)節(jié)劑、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、非酶促抗氧化物質(zhì)等）來緩解幼苗的受害程度或增強其耐冷性，但同時也增加了生產(chǎn)成本和生物安全隱患，因而培育和推廣耐冷強的西瓜新品種是解決這一問題的根本途徑。然而，衡量西瓜耐低溫性能的表型高效精準(zhǔn)評價技術(shù)以及育種可用分子標(biāo)記的缺乏，嚴(yán)重制約了西瓜耐低溫分子育種的進展。

5、上文涉及的參考文獻如下：

6、余家慶,夏詠.我國西瓜產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、問題及建議[j].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè).2024(05):25-27.

7、guo?x,?liu?d,?chong?k.?cold?signaling?in?plants:?insights?intomechanisms?and?regulation[j].?integr?plant?biol.?2018(9):745-756.

8、王毅，楊宏福，李德樹?園藝植物冷害和抗冷性的研究—文獻綜述[j].園藝學(xué)報,1994,21(3):239-244.

9、ding,?y.,?shi,?y.?and?yang,?s.?advances?and?challenges?in?uncoveringcold?tolerance?regulatory?mechanisms?in?plants[j].?new?phytol.?2019.222:1690-1704.

10、ruelland?e,?vaultier?mn,?zachowski?a,?hurry?v.?cold?signalling?andcold?acclimation?in?plants[j].?advances?in?botanical?research.2009.49:?35–150.

11、thomashow?mf.?plant?cold?acclimation:?freezing?tolerance?genes?andregulatory?mechanisms.?annual?review?of?plant?physiology?and?plant?molecularbiology.?1999.?50:?571–599.

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種西瓜幼苗耐低溫葉面積性狀的kasp分子標(biāo)記及用途，本發(fā)明所獲得的分子標(biāo)記lac?(relative?rate?of?change?in?leafarea?under?chilling?stress)為西瓜幼苗耐低溫響應(yīng)控制葉面積相對變化的kasp標(biāo)記，能用于耐低溫和非耐低溫西瓜的輔助育種。

2、為了達到上述目的，本發(fā)明提供一種西瓜幼苗耐低溫葉面積性狀的kasp分子標(biāo)記，位于西瓜基因組11號染色體的16128196bp處，前后50bp的序列如seq?id?no.1或seq?idno.2所示。

3、進一步地，所述kasp分子標(biāo)記基因型為c或t；c基因型前后50bp的序列如seq?idno.1所示，對應(yīng)的表型為非耐低溫型；t基因型前后50bp的序列如seq?id?no.2所示，對應(yīng)的表型為耐低溫型。

4、本發(fā)明還提供一種所述kasp分子標(biāo)記在鑒定西瓜幼苗低溫條件下葉面積大小基因方面的用途。

5、進一步地，分子標(biāo)記引物選自如下引物對，其中，核苷酸序列為5’-3’：

6、正向引物f-hex如seq?id?no.3所示：

7、gaaggtcggagtcaacggatttcggcatcttgttgagctcca；

8、正向引物f-fam如seq?id?no.4所示：

9、gaaggtgaccaagttcatgcttcggcatcttgttgagctccg；

10、反向引物r如seq?id?no.5所示：

11、cggaagtggtcaagcaaatcaacg。

12、進一步地，所述kasp分子標(biāo)記在鑒定西瓜幼苗低溫條件下葉面積大小基因方面的用途具體包括以下步驟：

13、1）提取待測西瓜品種基因組dna；

14、2）利用所述kasp分子標(biāo)記對西瓜基因組?dna?進行?pcr?擴增?；

15、3）根據(jù)pcr擴增結(jié)果熒光信號的差異，通過kraken?軟件，鑒別出每個待測西瓜的基因型：若pcr擴增結(jié)果熒光信號顏色與正向引物f-fam的熒光接頭顏色一致，則待測西瓜為純合基因型cc；與正向引物f-hex的熒光接頭顏色一致，則待測西瓜為純合基因型tt；若pcr擴增結(jié)果熒光信號顏色與正向引物f-hex、正向引物f-fam的熒光接頭顏色均不同，則待測西瓜為雜合基因型ct。

16、進一步地，步驟2）中，所述pcr擴增使用的pcr反應(yīng)體系為：20~50?ng/μl西瓜基因組dna?5.0?μl，kasp?master?mix5.0?μl，kasp?assay?mix?0.14μl?；所述kasp?assay?mix包含正向引物f-hex、正向引物f-fam和反向引物r，f-hex：f-fam：r的摩爾濃度比為?2：2：5，共10.14μl；pcr程序為：94℃?預(yù)變性，15?分鐘；94℃，變性20?秒；61?℃，-0.6℃/循環(huán)，退火60?s，共10個循環(huán)；再94?℃變性20?s，55?℃退火60?s，29個循環(huán)。

17、本發(fā)明還提供一種所述kasp分子標(biāo)記在西瓜低溫條件下葉面積大小的分子輔助育種方面的用途。

18、本發(fā)明的有益效果如下：

19、1.?前期篩選：可通過苗期提前檢測標(biāo)記基因型，預(yù)測后期植株耐低溫的葉面積表型。

20、2.?替代表型篩選；利用標(biāo)記篩選替代大規(guī)模低溫逆境處理的表型篩選，減少田間工作量以及因逆境處理導(dǎo)致的植株損失。

21、3.?提高篩選效率與準(zhǔn)確率：植株耐低溫表型是基因型與環(huán)境互作后的綜合結(jié)果，基于表型的耐低溫性篩選會因環(huán)境差異導(dǎo)致選擇誤差，結(jié)合分子標(biāo)記對基因型進行篩選可以極大提高篩選的準(zhǔn)確性與效率。