本發(fā)明涉及特異性結(jié)合米酵菌酸的抗體及其應(yīng)用,屬于基因工程。
背景技術(shù):
1、米酵菌酸(bongkrekic?acid,ba)是由唐菖蒲伯克霍爾德氏菌產(chǎn)生的劇毒生物毒素。其結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定,普通烹飪方法難以破壞,且臨床上缺乏針對(duì)米酵菌酸中毒的有效治療方案,突發(fā)性食物中毒事件常有發(fā)生,人體攝入后可引起廣泛性器官損害甚至死亡。亟需開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)單、快速的適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的米酵菌酸定量檢測(cè)方法。
2、識(shí)別是檢測(cè)的基礎(chǔ),目前最為常見(jiàn)的識(shí)別元件為抗體??贵w具有高親和力和特異性等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)有技術(shù)中,以抗原-抗體檢測(cè)米酵菌酸主要有以下方案:
3、專利cn113801220b公開(kāi)了一種米酵菌酸復(fù)合抗原、米酵菌酸抗體及其制備方法和酶聯(lián)免疫試劑盒,其通過(guò)對(duì)抗原結(jié)構(gòu)優(yōu)化,通過(guò)動(dòng)物免疫以及雜交瘤細(xì)胞制備得到的米酵菌酸抗體靈敏度為10μg/l。
4、專利cn114045266a公開(kāi)了一種抗米酵菌酸的單克隆抗體及其應(yīng)用,其同樣通過(guò)通過(guò)動(dòng)物免疫以及雜交瘤細(xì)胞制備,得到了米酵菌酸抗體,在該方案中,將所得抗體以酶聯(lián)免疫法檢測(cè)米酵菌酸時(shí),檢測(cè)限為5.79ng/ml。
5、綜上,現(xiàn)有的方案中,均以動(dòng)物免疫后制備雜交瘤細(xì)胞來(lái)制備得到米酵菌酸抗體,一方面,這種方法實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣,成本高;另一方面,現(xiàn)有技術(shù)提供的抗體在米酵菌酸檢測(cè)中的檢測(cè)限仍較高,導(dǎo)致在實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用場(chǎng)景有限。因此,亟待提供一種制備簡(jiǎn)單,成本和檢測(cè)限低的米酵菌酸抗體。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、[技術(shù)問(wèn)題]
2、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備簡(jiǎn)單,成本和檢測(cè)限低的米酵菌酸抗體。
3、[技術(shù)方案]
4、為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
5、在第一方面,本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合米酵菌酸的抗體或其抗原結(jié)合片段,所述抗體或其抗原片段包含輕鏈可變區(qū)vl和重鏈可變區(qū)vh,所述vl包含分別具有如seq?idno:6、gts、seq?id?no:7所示氨基酸序列的lcdr1-lcdr3,并且所述vh包含分別具有如seqid?no:3、seq?id?no:4、seq?id?no:5所示氨基酸序列的hcdr1-hcdr3。
6、在一種實(shí)施方式中,所述vl包含seq?id?no:2所示的氨基酸序列并且所述vh包含seq?id?no:1所示的氨基酸序列。
7、在一種實(shí)施方式中,所述抗體包括重鏈抗體hc和輕鏈抗體lc,所述hc具有seq?idno.11所示的氨基酸序列,并且所述lc具有seq?id?no.13所示的氨基酸序列。
8、在一種實(shí)施方式中,所述抗原結(jié)合片段選自fab、fab’、f(ab’)2、fv或scfv。
9、在第二方面,本發(fā)明提供了一種生物材料,所述生物材料包括如下(a)~(c)中的至少一種:
10、(a):編碼第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸;
11、(b):含有(a)中所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體;
12、(c):含有(a)中所述多核苷酸或(b)中所述核酸構(gòu)建體的載體。
13、在第三方面,本發(fā)明提供了一種細(xì)胞,其含有第二方面所述生物材料。
14、在一種實(shí)施方式中,所述細(xì)胞以微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞為宿主。
15、在第四方面,發(fā)明提供了一種試劑盒,所述試劑盒中含有第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
16、在第五方面,發(fā)明提供了第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、第二方面所述生物材料或第三方面所述細(xì)胞在制備用于檢測(cè)樣本中米酵菌酸的試劑中的應(yīng)用。
17、在第六方面,發(fā)明提供了制備第一方面所述抗體或其抗原結(jié)合片段的方法,包括:培養(yǎng)第三方面所述細(xì)胞,制備得到第一方面所述抗體或其抗原結(jié)合片段。
18、在一種實(shí)施方式中,所述方法包括以下步驟:將所述細(xì)胞接種于培養(yǎng)基,培養(yǎng)至od600=0.6~0.8,加入iptg,誘導(dǎo)培養(yǎng),收集菌體;所述細(xì)胞以大腸桿菌為宿主,以質(zhì)粒pet-22b為表達(dá)載體。
19、在一種實(shí)施方式中,所述方法包括以下步驟:將所述細(xì)胞接種于培養(yǎng)基,于30~40℃,5~10%?co2條件下培養(yǎng)6~7天,收集培養(yǎng)上清;所述細(xì)胞以expi293f細(xì)胞為宿主,以質(zhì)粒pcdna3.1為表達(dá)載體。
20、在第七方面,發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣本中是否存在米酵菌酸或其含量的方法,所述方法包括使第一方面所述抗體或其抗原結(jié)合片段與樣本接觸的步驟。
21、與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具備以下有益效果:
22、1.本發(fā)明提供的米酵菌酸抗體在用于檢測(cè)時(shí),檢測(cè)限顯著低于現(xiàn)有技術(shù),且能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)米酵菌酸的高靈敏檢測(cè)。本發(fā)明提供的米酵菌酸抗體通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)方法檢測(cè)米酵菌酸時(shí)的ic50為0.259ng/ml,線性范圍為0.5~20ng/ml,檢測(cè)限為0.410ng/ml。
23、2.本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建pet-22b-ba質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染e.coli?bl21,iptg誘導(dǎo)scfv表達(dá),借助ni親和柱純化,從而實(shí)現(xiàn)scfv的表達(dá)純化,并將scfv與哺乳動(dòng)物細(xì)胞expi293f表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組全長(zhǎng)igg抗體活性進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)重組全長(zhǎng)igg抗體活性高于scfv。
24、3.本發(fā)明提供的米酵菌酸抗體制備時(shí)不需要?jiǎng)游锩庖?,制備方法?jiǎn)單。
25、4.本發(fā)明中表達(dá)的米酵菌酸重組抗體,可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行基因改造,廣泛應(yīng)用于其它靶標(biāo)的抗體快速制備。
1.一種特異性結(jié)合米酵菌酸的抗體或其抗原結(jié)合片段,所述抗體或其抗原片段包含輕鏈可變區(qū)vl和重鏈可變區(qū)vh,其特征在于,所述vl包含分別具有如seq?id?no:6、gts、seqid?no:7所示氨基酸序列的lcdr1-lcdr3,并且所述vh包含分別具有如seq?id?no:3、seq?idno:4、seq?id?no:5所示氨基酸序列的hcdr1-hcdr3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段,其特征在于,所述vl包含seq?id?no:2所示的氨基酸序列并且所述vh包含seq?id?no:1所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段,其特征在于,所述抗體包括重鏈抗體hc和輕鏈抗體lc,所述hc具有seq?id?no.11所示的氨基酸序列,并且所述lc具有seq?idno.13所示的氨基酸序列。
4.一種生物材料,其特征在于,所述生物材料包括如下(a)~(c)中的至少一種:
5.一種細(xì)胞,其特征在于,含有權(quán)利要求4所述生物材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞以微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞為宿主。
7.試劑盒,其特征在于,所述試劑盒中含有權(quán)利要求1~3任一所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
8.權(quán)利要求1~3任一所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、權(quán)利要求4所述生物材料或權(quán)利要求5或6所述細(xì)胞在制備用于檢測(cè)樣本中米酵菌酸的試劑中的應(yīng)用。
9.制備權(quán)利要求1~3任一所述抗體或其抗原結(jié)合片段的方法,其特征在于,包括:培養(yǎng)權(quán)利要求5或6所述細(xì)胞,制備得到權(quán)利要求1~3任一所述抗體或其抗原結(jié)合片段。
10.一種檢測(cè)樣本中是否存在米酵菌酸或其含量的方法,其特征在于,所述方法包括使權(quán)利要求1~3任一所述抗體或其抗原結(jié)合片段與樣本接觸的步驟。