本發(fā)明涉及特異性結(jié)合米酵菌酸的抗體及其應(yīng)用，屬于基因工程。

背景技術(shù)：

1、米酵菌酸(bongkrekic?acid,ba)是由唐菖蒲伯克霍爾德氏菌產(chǎn)生的劇毒生物毒素。其結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，普通烹飪方法難以破壞，且臨床上缺乏針對(duì)米酵菌酸中毒的有效治療方案，突發(fā)性食物中毒事件常有發(fā)生，人體攝入后可引起廣泛性器官損害甚至死亡。亟需開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)單、快速的適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的米酵菌酸定量檢測(cè)方法。

2、識(shí)別是檢測(cè)的基礎(chǔ)，目前最為常見(jiàn)的識(shí)別元件為抗體?？贵w具有高親和力和特異性等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)有技術(shù)中，以抗原-抗體檢測(cè)米酵菌酸主要有以下方案：

3、專利cn113801220b公開(kāi)了一種米酵菌酸復(fù)合抗原、米酵菌酸抗體及其制備方法和酶聯(lián)免疫試劑盒，其通過(guò)對(duì)抗原結(jié)構(gòu)優(yōu)化，通過(guò)動(dòng)物免疫以及雜交瘤細(xì)胞制備得到的米酵菌酸抗體靈敏度為10μg/l。

4、專利cn114045266a公開(kāi)了一種抗米酵菌酸的單克隆抗體及其應(yīng)用，其同樣通過(guò)通過(guò)動(dòng)物免疫以及雜交瘤細(xì)胞制備，得到了米酵菌酸抗體，在該方案中，將所得抗體以酶聯(lián)免疫法檢測(cè)米酵菌酸時(shí)，檢測(cè)限為5.79ng/ml。

5、綜上，現(xiàn)有的方案中，均以動(dòng)物免疫后制備雜交瘤細(xì)胞來(lái)制備得到米酵菌酸抗體，一方面，這種方法實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，成本高；另一方面，現(xiàn)有技術(shù)提供的抗體在米酵菌酸檢測(cè)中的檢測(cè)限仍較高，導(dǎo)致在實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用場(chǎng)景有限。因此，亟待提供一種制備簡(jiǎn)單，成本和檢測(cè)限低的米酵菌酸抗體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、[技術(shù)問(wèn)題]

2、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備簡(jiǎn)單，成本和檢測(cè)限低的米酵菌酸抗體。

3、[技術(shù)方案]

4、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

5、在第一方面，本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合米酵菌酸的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原片段包含輕鏈可變區(qū)vl和重鏈可變區(qū)vh，所述vl包含分別具有如seq?idno:6、gts、seq?id?no:7所示氨基酸序列的lcdr1-lcdr3，并且所述vh包含分別具有如seqid?no:3、seq?id?no:4、seq?id?no:5所示氨基酸序列的hcdr1-hcdr3。

6、在一種實(shí)施方式中，所述vl包含seq?id?no:2所示的氨基酸序列并且所述vh包含seq?id?no:1所示的氨基酸序列。

7、在一種實(shí)施方式中，所述抗體包括重鏈抗體hc和輕鏈抗體lc，所述hc具有seq?idno.11所示的氨基酸序列，并且所述lc具有seq?id?no.13所示的氨基酸序列。

8、在一種實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合片段選自fab、fab’、f(ab’)2、fv或scfv。

9、在第二方面，本發(fā)明提供了一種生物材料，所述生物材料包括如下(a)～(c)中的至少一種：

10、(a)：編碼第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸；

11、(b)：含有(a)中所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體；

12、(c)：含有(a)中所述多核苷酸或(b)中所述核酸構(gòu)建體的載體。

13、在第三方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞，其含有第二方面所述生物材料。

14、在一種實(shí)施方式中，所述細(xì)胞以微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞為宿主。

15、在第四方面，發(fā)明提供了一種試劑盒，所述試劑盒中含有第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。

16、在第五方面，發(fā)明提供了第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、第二方面所述生物材料或第三方面所述細(xì)胞在制備用于檢測(cè)樣本中米酵菌酸的試劑中的應(yīng)用。

17、在第六方面，發(fā)明提供了制備第一方面所述抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，包括：培養(yǎng)第三方面所述細(xì)胞，制備得到第一方面所述抗體或其抗原結(jié)合片段。

18、在一種實(shí)施方式中，所述方法包括以下步驟：將所述細(xì)胞接種于培養(yǎng)基，培養(yǎng)至od600＝0.6～0.8，加入iptg，誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體；所述細(xì)胞以大腸桿菌為宿主，以質(zhì)粒pet-22b為表達(dá)載體。

19、在一種實(shí)施方式中，所述方法包括以下步驟：將所述細(xì)胞接種于培養(yǎng)基，于30～40℃，5～10％?co2條件下培養(yǎng)6～7天，收集培養(yǎng)上清；所述細(xì)胞以expi293f細(xì)胞為宿主，以質(zhì)粒pcdna3.1為表達(dá)載體。

20、在第七方面，發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣本中是否存在米酵菌酸或其含量的方法，所述方法包括使第一方面所述抗體或其抗原結(jié)合片段與樣本接觸的步驟。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下有益效果：

22、1.本發(fā)明提供的米酵菌酸抗體在用于檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)限顯著低于現(xiàn)有技術(shù)，且能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)米酵菌酸的高靈敏檢測(cè)。本發(fā)明提供的米酵菌酸抗體通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)方法檢測(cè)米酵菌酸時(shí)的ic50為0.259ng/ml，線性范圍為0.5～20ng/ml，檢測(cè)限為0.410ng/ml。

23、2.本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建pet-22b-ba質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染e.coli?bl21，iptg誘導(dǎo)scfv表達(dá)，借助ni親和柱純化，從而實(shí)現(xiàn)scfv的表達(dá)純化，并將scfv與哺乳動(dòng)物細(xì)胞expi293f表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組全長(zhǎng)igg抗體活性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)重組全長(zhǎng)igg抗體活性高于scfv。

24、3.本發(fā)明提供的米酵菌酸抗體制備時(shí)不需要?jiǎng)游锩庖?，制備方法?jiǎn)單。

25、4.本發(fā)明中表達(dá)的米酵菌酸重組抗體，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行基因改造，廣泛應(yīng)用于其它靶標(biāo)的抗體快速制備。

技術(shù)特征：

1.一種特異性結(jié)合米酵菌酸的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原片段包含輕鏈可變區(qū)vl和重鏈可變區(qū)vh，其特征在于，所述vl包含分別具有如seq?id?no:6、gts、seqid?no:7所示氨基酸序列的lcdr1-lcdr3，并且所述vh包含分別具有如seq?id?no:3、seq?idno:4、seq?id?no:5所示氨基酸序列的hcdr1-hcdr3。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述vl包含seq?id?no:2所示的氨基酸序列并且所述vh包含seq?id?no:1所示的氨基酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體包括重鏈抗體hc和輕鏈抗體lc，所述hc具有seq?id?no.11所示的氨基酸序列，并且所述lc具有seq?idno.13所示的氨基酸序列。

4.一種生物材料，其特征在于，所述生物材料包括如下(a)～(c)中的至少一種：

5.一種細(xì)胞，其特征在于，含有權(quán)利要求4所述生物材料。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞以微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞為宿主。

7.試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有權(quán)利要求1～3任一所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。

8.權(quán)利要求1～3任一所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、權(quán)利要求4所述生物材料或權(quán)利要求5或6所述細(xì)胞在制備用于檢測(cè)樣本中米酵菌酸的試劑中的應(yīng)用。

9.制備權(quán)利要求1～3任一所述抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，其特征在于，包括：培養(yǎng)權(quán)利要求5或6所述細(xì)胞，制備得到權(quán)利要求1～3任一所述抗體或其抗原結(jié)合片段。

10.一種檢測(cè)樣本中是否存在米酵菌酸或其含量的方法，其特征在于，所述方法包括使權(quán)利要求1～3任一所述抗體或其抗原結(jié)合片段與樣本接觸的步驟。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了特異性結(jié)合米酵菌酸的抗體及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的米酵菌酸抗體制備方法簡(jiǎn)單，不需要?jiǎng)游锩庖撸每贵wBA?IgG活性較BA?scFv好，基于BA?IgG構(gòu)建的競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC<subgt;50</subgt;為0.259ng/mL，線性范圍為0.5～20ng/mL，檢測(cè)限為0.410ng/mL，可應(yīng)用于米酵菌酸免疫分析。

技術(shù)研發(fā)人員：孫秀蘭,孫嘉笛,林婉昕,鄭夢(mèng)瑤,馬萬(wàn)成,高松,葉永麗,張銀志
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/26