本技術(shù)涉及治療性重組蛋白的瞬時(shí)基因表達(dá)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、隨著對縮短時(shí)間線和提高重組蛋白產(chǎn)生通量的需求的增加，迫切需要快速產(chǎn)生藥品材料，并且所述藥品材料的產(chǎn)品質(zhì)量特征與傳統(tǒng)的穩(wěn)定細(xì)胞系中產(chǎn)生的材料是可比較的。瞬時(shí)基因表達(dá)(tge)通過快速且一致地產(chǎn)生代表克隆材料的目的蛋白而潛在地填補(bǔ)了這一空白。tge比代表克隆材料的穩(wěn)定細(xì)胞系生產(chǎn)早數(shù)周產(chǎn)生材料的能力，通過支持下游配制和分析開發(fā)，加速了到臨床制造的時(shí)間線。kelley(2020)nat.biotechnol.38(5):540-545；coffman等人(2008)biotechnol.bioeng.100(4):605-618；bolisetty等人(2020)mabs12(1):p176372。因此，在選擇最終細(xì)胞系之前，可以以對下游活性的最小風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行開發(fā)程序。此外，tge使得能夠使用來自與后期開發(fā)階段中相同的哺乳動物宿主系統(tǒng)的材料進(jìn)行早期毒理學(xué)研究，使程序期之間的評估更容易并且更準(zhǔn)確。tge的進(jìn)一步用途包括用于罕見病或孤兒病的小規(guī)模制造(例如，用于產(chǎn)生小批量藥物)，允許為特定患者群體設(shè)計(jì)靶向藥物，或甚至用于個(gè)體化治療劑(gutierrez-granados等人(2018)crit.rev.biotechnol.38(6):918-940)，能夠更有效地生產(chǎn)孤兒病治療劑，因?yàn)樗С稚a(chǎn)的多功能性并且減少了開發(fā)需求，從而降低了每位患者的整體治療成本(sun等人(2017)am.j.med.genet.a?173(9):2307-2322)。然而，低生產(chǎn)率(低滴度)、與克隆材料的產(chǎn)品質(zhì)量差異和可擴(kuò)展性限制了tge在非glp臨床前研究中的使用，并且阻止了瞬時(shí)表達(dá)在臨床開發(fā)中的廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開文本提供了一種用于在大規(guī)模生物反應(yīng)器中高產(chǎn)量和/或高質(zhì)量產(chǎn)生重組蛋白的方法，所述方法包括

2、(i)培養(yǎng)真核細(xì)胞以將所述真核細(xì)胞濃縮至高密度；以及

3、(ii)使用電穿孔用編碼所述重組蛋白的多核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所述真核細(xì)胞。

4、在一些方面，所述重組蛋白的質(zhì)量與克隆材料(即，使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞獲得的重組蛋白)的質(zhì)量是可比較的。在一些方面，培養(yǎng)真核細(xì)胞以將所述真核細(xì)胞濃縮至高密度包括將所述細(xì)胞維持在最佳生長期。

5、在一些方面，所述真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。在一些方面，所述哺乳動物細(xì)胞選自cho、vero、bhk、hek、hela、cos、mdck和雜交瘤細(xì)胞。在一些方面，所述哺乳動物細(xì)胞是cho細(xì)胞。在一些方面，所述重組蛋白包括抗體或其抗原結(jié)合部分。在一些方面，所述抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合選自以下的抗原：pd-1、pd-l1、cvtla-4、lag-3、tigit、gitr、cxcr4、cd73、her2、vegf、cd20、cd40、cd11a、組織因子(tf)、psca、il-8、egfr、her3和her4。在一些方面，所述生物反應(yīng)器是高通量生物反應(yīng)器。在一些方面，所述高通量生物反應(yīng)器是250或15生物反應(yīng)器。在一些方面，所述生物反應(yīng)器是1l、2l、5l、10l、25l、50l、100l、500l、1000l、2000l、5000l、10,000l或20,000l生物反應(yīng)器。在一些方面，所述生物反應(yīng)器是補(bǔ)料分批生產(chǎn)生物反應(yīng)器。在一些方面，所述生物反應(yīng)器是一次性生物反應(yīng)器。在一些方面，所述生物反應(yīng)器是玻璃罐生物反應(yīng)器。

6、在一些方面，例如在轉(zhuǎn)染之前，所述培養(yǎng)是灌注培養(yǎng)。在一些方面，所述灌注通過切向流過濾進(jìn)行。在一些方面，所述切向流過濾是交替切向流過濾(atf)。在一些方面，所述灌注使用repligenmatf2系統(tǒng)進(jìn)行。在一些方面，將所述細(xì)胞濃縮至以下密度：至少約40x106、至少約50x?106、至少約60x?106、至少約70x?106、至少約80x?106、至少約90x?106、至少約100x?106、至少約110x?106、至少約120x?106、至少約130x?106、至少約140x?106、至少約150x?106、至少約160x?106、至少約170x?106、至少約180x?106、至少約190x?106或至少約200x?106個(gè)細(xì)胞/ml。在一些方面，將所述細(xì)胞濃縮至以下密度：約40x?106至約200x?106、約60x?106至約200x?106、約80x?106至約200x?106、約100x?106至約200x?106、約120x?106至約200x?106、約140x?106至約200x?106、約160x?106至約200x?106、約180x?106至約200x?106、約40x?106至約180x?106、約60x?106至約180x?106、約80x?106至約180x?106、約100x?106至約180x?106、約120x?106至約180x?106、約140x?106至約180x?106、約160x?106至約180x106、約40x?106至約160x?106、約60x?106至約160x106、約80x?106至約160x?106、約100x?106至約160x?106、約120x?106至約160x?106、約140x?106至約160x?106、約40x?106至約140x106、約60x?106至約140x?106、約80x?106至約140x?106、約100x?106至約140x?106、約120x106至約140x?106、約40x?106至約120x?106、約60x?106至約120x?106、約80x?106至約120x106、約100x?106至約120x?106、約40x?106至約100x?106、約60x?106至約100x?106、約80x?106至約100x?106個(gè)細(xì)胞/ml。在一些方面，將所述細(xì)胞濃縮至以下密度：約100x?106、約110x106、約120x?106、約130x?106、約140x?106、約150x?106、約160x?106、約170x?106、約180x106、約190x?106、約200x?106、約210x?106、約220x?106、約230x?106、約240x?106或約250x106個(gè)細(xì)胞/ml。

7、在一些方面，在以下細(xì)胞密度下進(jìn)行電穿孔：約100x?106、約110x?106、約120x106、約130x?106、約140x?106、約150x?106、約160x?106、約170x?106、約180x?106、約190x106、約200x?106、約210x?106、約220x?106、約230x?106、約240x?106或約250x?106個(gè)細(xì)胞/ml。在一些方面，所述電穿孔是基于流式的電穿孔。在一些方面，使用maxcytem轉(zhuǎn)染系統(tǒng)進(jìn)行電穿孔。在一些方面，所述轉(zhuǎn)染系統(tǒng)是maxcytemstx或vlx轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。在一些方面，在以下dna與細(xì)胞比率下進(jìn)行電穿孔：每1x?106個(gè)細(xì)胞約1、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4或約2.5μg?dna。

8、在一些方面，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)起始密度在5x?106與20x?106個(gè)細(xì)胞/ml之間。在一些方面，所述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)在某個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)轉(zhuǎn)變溫度。在一些方面，所述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)的溫度在某個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)變。在一些方面，所述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)包括在第1天或第2天的溫度轉(zhuǎn)變。在一些方面，所述溫度轉(zhuǎn)變是從約37℃至約32℃。在一些方面，所述溫度轉(zhuǎn)變是從約37℃至約34℃。在一些方面，所述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)包括添加n,n-二甲基乙酰胺(dma)。在一些方面，以約0.125％v/v或約0.250％v/v添加dma。在一些方面，以約0.125％v/v至約0.250％v/v之間添加dma。在一些方面，所述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)包括添加丁酸鈉(nabu)。在一些方面，以約1mm與約2mm之間的濃度添加nabu。

9、在一些方面，培養(yǎng)7天后，所述方法的蛋白質(zhì)產(chǎn)量是至少約0.1g/l、至少約0.2g/l、至少約0.3g/l、至少約0.4g/l、至少約0.5g/l、至少約0.6g/l、至少約0.7g/l、至少約0.8g/l、至少約0.9g/l、至少約1g/l、至少約2g/l、至少約3g/l、至少約4g/l、至少約5g/l或至少約6g/l。在一些方面，培養(yǎng)14天后，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)量高達(dá)2g/l。

10、本公開文本提供了一種用于在生物反應(yīng)器中高產(chǎn)量和/或高質(zhì)量產(chǎn)生重組蛋白的方法，所述方法包括

11、(i)轉(zhuǎn)染前在連續(xù)atf灌注下培養(yǎng)真核細(xì)胞，

12、(ii)轉(zhuǎn)染前使用連續(xù)atf灌注將所述細(xì)胞濃縮至40-200x?106個(gè)細(xì)胞/ml的密度；

13、(iii)使用基于流式的電穿孔用編碼所述重組蛋白的多核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所述真核細(xì)胞；以及

14、(iv)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)所述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞。

15、在一些方面，所述方法產(chǎn)生具有與克隆材料可比較的產(chǎn)品質(zhì)量的重組蛋白。在一些方面，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)包括(i)約15x?106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞培養(yǎng)起始密度，(ii)約0.125％(v/v)的dma，(iii)約1mm的nabu，以及(iv)在第1天從約36.5℃至約32℃的溫度轉(zhuǎn)變，其中所述生物反應(yīng)器的體積在約250ml與約5l之間。在一些方面，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所述真核細(xì)胞獲得的重組蛋白的產(chǎn)品質(zhì)量屬性值在通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染獲得的重組蛋白的產(chǎn)品質(zhì)量屬性值的+/-10％之內(nèi)。在一些方面，所述質(zhì)量屬性選自：

16、(i)蛋白質(zhì)聚集；

17、(ii)還原和非還原物質(zhì)；

18、(iii)電荷變體；

19、(iv)糖基化譜；以及

20、(v)其任何組合。

21、在一些方面，所述蛋白質(zhì)聚集質(zhì)量屬性選自(i)高分子量物質(zhì)的百分比(hmw％)，(ii)單體物質(zhì)的百分比，以及(iii)其任何組合。在一些方面，使用hplc尺寸排阻色譜法測定所述蛋白質(zhì)聚集質(zhì)量屬性。在一些方面，所述還原和非還原物質(zhì)質(zhì)量屬性選自(i)還原重組蛋白的百分比，(ii)非還原重組蛋白的百分比，以及(iii)其任何組合。在一些方面，在還原和非還原條件下使用毛細(xì)管電泳(ce-sds)測定所述還原和非還原物質(zhì)質(zhì)量屬性。在一些方面，所述電荷變體質(zhì)量屬性選自(i)堿性變體的百分比，(ii)酸性變體的百分比，(iii)主要物質(zhì)的百分比，以及(iv)其任何組合。在一些方面，通過由毛細(xì)管等電聚焦(icief)分析等電分布來測定所述電荷變體質(zhì)量屬性。在一些方面，所述糖基化譜包括一種或多種n-連接的聚糖。在一些方面，所述n-連接的聚糖包括(甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-巖藻糖)(g0f)、甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-1-巖藻糖(g1f)、甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-2-巖藻糖(g2f)、單唾液酸化的甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-1-巖藻糖(s1g1f)、單唾液酸化的甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-2-巖藻糖(s1g2f)、單唾液酸化的甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-3-巖藻糖(s2g3f)、二唾液酸化的甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-2-巖藻糖(s2g2f)或其任何組合。在一些方面，所述糖基化譜質(zhì)量屬性選自(i)g1f的百分比，(ii)g0f的百分比，(iii)g2f的百分比，(iv)總?cè)r藻糖基化蛋白的百分比，以及(v)其任何組合。在一些方面，使用hplc方法測定所述糖基化譜質(zhì)量屬性。在一些方面，所述hplc方法是具有熒光檢測的超高效液相色譜法(uplc-flr)。

22、本公開文本還提供了一種根據(jù)上文公開的任何方法獲得的重組蛋白。在一些方面，所述重組蛋白是結(jié)合選自以下的抗原的抗體或抗原結(jié)合片段：pd-1、pd-l1、cvtla-4、lag-3、tigit、gitr、cxcr4、cd73、her2、vegf、cd20、cd40、cd11a、組織因子(tf)、psca、il-8、egfr、her3和her4。

23、本公開文本還提供了一種包含根據(jù)上文公開的任何方法獲得的重組蛋白的藥物組合物。還提供了一種根據(jù)上文公開的任何方法獲得的細(xì)胞或其多個(gè)細(xì)胞。在一些方面，所述細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞。本公開文本還提供了一種用于制造根據(jù)上文公開的任何方法產(chǎn)生的重組蛋白的生物反應(yīng)器。還提供了一種包含上文公開的細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞的生物反應(yīng)器。本公開文本還提供了一種用于通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染高產(chǎn)量產(chǎn)生重組蛋白的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括(i)生物反應(yīng)器；(ii)atf灌注系統(tǒng)；以及(iii)電穿孔轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。在一些方面，所述系統(tǒng)用于實(shí)踐所述方法或用于獲得上文公開的組合物(例如，重組蛋白)。

24、本公開文本還提供了一種用于加速或縮短所述重組蛋白的開發(fā)時(shí)間線的方法，所述方法包括(i)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)真核細(xì)胞以將所述真核細(xì)胞濃縮至高密度，以及(ii)使用電穿孔用編碼所述重組蛋白的多核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所述真核細(xì)胞。還提供了一種用于降低重組蛋白的宿主細(xì)胞毒性的方法，所述方法包括(i)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)真核細(xì)胞以將所述真核細(xì)胞濃縮至高密度，以及(ii)使用電穿孔用編碼所述重組蛋白的多核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所述真核細(xì)胞。本公開文本還提供了一種用于產(chǎn)生用于個(gè)體化治療劑的重組蛋白的方法，所述方法包括(i)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)真核細(xì)胞以將所述真核細(xì)胞濃縮至高密度，以及(ii)使用電穿孔用編碼所述重組蛋白的多核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所述真核細(xì)胞。