亚洲狠狠干,亚洲国产福利精品一区二区,国产八区,激情文学亚洲色图

用于治療KCNQ4相關聽力損失的組合物和方法與流程

文檔序號:39526803發(fā)布日期:2024-09-27 17:03閱讀:49來源:國知局
用于治療KCNQ4相關聽力損失的組合物和方法與流程


背景技術:

1、聽力損失有許多類型。有些聽力損失與一種或多種基因有關。本公開提供了與kcnq4相關聽力損失有關的技術。


技術實現思路

1、本公開認識到與聽力損失相關的疾病或疾患可以經由例如替換、添加和/或抑制某些基因產物來治療。本公開還提供了耳細胞(例如內耳細胞,例如毛細胞)的發(fā)育、功能和/或維持中所涉及的基因產物可用于治療與細胞損失(例如,毛細胞損失)相關的疾病或疾患。因此,本公開提供了各種技術,包括用于制備、使用和/或施用組合物以表達內耳細胞(例如,毛細胞)的發(fā)育、功能和/或維持中所涉及的基因產物的方法的那些技術。

2、本公開所提供的技術還包括此類組合物在治療聽力損失或與聽力損失相關的疾病或疾患中的用途。在一些實施方案中,基因產物可以由鉀電壓門控通道亞家族q成員4(kcnq4)基因或其特征部分編碼。在一些實施方案中,基因產物可以是kcnq4蛋白或其特征部分。在一些實施方案中,變體kcnq4基因產物受抑制。在一些實施方案中,本公開提供了表達功能性kcnq4的技術。在一些實施方案中,本公開提供了抑制kcnq4變體的技術。在一些實施方案中,本公開提供了表達功能性kcnq4并抑制kcnq4變體的技術。

3、本公開還提供了例如經由aav顆粒進行的病毒遞送可用于施用組合物以表達內耳細胞的發(fā)育、功能和/或維持和/或聽力損失或與聽力損失相關的疾病或疾患的治療中所涉及的基因產物。如本文所描述,aav顆粒包含(i)aav多核苷酸構建體(例如,重組aav多核苷酸構建體),和(ii)包含衣殼蛋白的衣殼。在一些實施方案中,aav多核苷酸構建體包含kcnq4基因或其特征部分。在一些實施方案中,本文所描述的aav顆粒稱作raav-kcnq4或raav-kcnq4顆粒。在一些實施方案中,本文所描述的aav顆粒包含anc80?aav衣殼蛋白并且稱作raav?anc80-kcnq4或raav?anc80-kcnq4顆粒。

4、此外,本公開提供了一種包含可操作地連接至啟動子的編碼序列的構建體,其中所述編碼序列編碼kv7.4蛋白。

5、本公開還提供了一種包含可操作地連接至啟動子的編碼序列的構建體,其中所述編碼序列編碼kcnq4抑制性核酸,所述kcnq4抑制性核酸包含與kcnq4基因互補的核苷酸序列。在一些實施方案中,本文所描述的aav顆粒稱作raav-kcnq4-抑制性rna或raav-kcnq4-抑制性rna顆粒。在一些實施方案中,本文所描述的aav顆粒包含anc80?aav衣殼蛋白并且稱作raav?anc80-kcnq4-抑制性rna或raav?anc80-kcnq4-抑制性rna顆粒。

6、在一些實施方案中,編碼序列是kcnq4基因。在一些實施方案中,kcnq4基因是靈長類動物kcnq4基因。在一些實施方案中,kcnq4基因是人類kcnq4基因。在一些實施方案中,kcnq4基因是鼠類(或小鼠)kcnq4基因。

7、在一些實施方案中,人類kcnq4基因包含根據seq?id?no:1、seq?id?no:2、seq?idno:3、seq?id?no:4、seq?id?no:5、seq?id?no:6、seq?id?no:7、seq?id?no:8、seq?id?no:9、seq?id?no:10、seq?id?no:25、seq?id?no:26、seq?id?no:27、seq?id?no:28、seq?id?no:29、seq?id?no:30或seq?id?no:90的核酸序列。在一些實施方案中,人類kcnq4基因包含根據seq?id?no:9或10的核酸序列。在一些實施方案中,小鼠(或鼠類)kcnq4基因包含根據seqid?no:91的核酸序列。

8、在一些實施方案中,kv7.4蛋白是靈長類動物kv7.4蛋白。在一些實施方案中,kv7.4蛋白是人類kv7.4蛋白。在一些實施方案中,kv7.4蛋白是小鼠kv7.4蛋白。在一些實施方案中,kv7.4蛋白包含根據seq?id?no:11、seq?id?no:12、seq?id?no:13或seq?id?no:92的氨基酸序列。

9、在一些實施方案中,啟動子是誘導型啟動子、組成型啟動子或組織特異性啟動子。在一些實施方案中,啟動子是膽堿能受體煙堿α10亞基(chrna10)啟動子、動力蛋白3(dnm3)啟動子、粘蛋白15(muc15)啟動子、含磷脂酶b結構域1(plbd1)啟動子、rar相關孤兒受體b(rorb)啟動子、紋狀蛋白相互作用蛋白2(strip2)啟動子、水通道蛋白11(aqp11)啟動子、kcnq4啟動子、lbh啟動子、硬纖毛蛋白(strc)啟動子、微管蛋白α8(tuba8)啟動子、癌調蛋白(ocm)啟動子、截短的(或“短的”)ocm啟動子、快蛋白啟動子或截短的(或“短的”)快蛋白啟動子。

10、在一些實施方案中,啟動子是耳蝸毛細胞特異性啟動子。在一些實施方案中,耳蝸毛細胞特異性啟動子是atoh1啟動子、pou4f3啟動子、lhx3啟動子、myo7a啟動子、myo6啟動子、α9achr啟動子或α10achr啟動子。在一些實施方案中,啟動子是cag啟動子、cba啟動子、smcba啟動子、cmv啟動子或cb7啟動子。在一些實施方案中,啟動子包含根據seq?id?no:22、seq?id?no:23、seq?id?no:24、seq?id?no:297、seq?id?no:298、seq?id?no:299、seq?idno:300、seq?id?no:301、seq?id?no:302、seq?id?no:303、seq?id?no:304、seq?id?no:305、seq?id?no:306、seq?id?no:307、seq?id?no:308、seq?id?no:309和/或seq?id?no:310的核酸序列。

11、在一些實施方案中,本公開的構建體包含兩個aav反向末端重復序列(itr),其中這兩個aav?itr位于編碼序列和啟動子側翼。在一些實施方案中,兩個aav?itr是aav2?itr或來源于aav2?itr。在一些實施方案中,兩個aav?itr包含:(i)包含根據seq?id?no:15的核酸序列的5′itr和包含根據seq?id?no:16的核酸序列的3′itr。在一些實施方案中,兩個aavitr包含:(i)包含根據seq?id?no:19的核酸序列的5′itr和包含根據seq?id?no:20的核酸序列的3′itr。在一些實施方案中,兩個aav?itr包含:(i)包含根據seq?id?no:311的核酸序列的5′itr和包含根據seq?id?no:312或seq?id?no:313的核酸序列的3′itr。在一些實施方案中,構建體包含根據seq?id?no:1、seq?id?no:2、seq?id?no:3、seq?id?no:4、seq?id?no:5、seq?id?no:6、seq?id?no:7、seq?id?no:8、seq?id?no:9、seq?id?no:10、seq?id?no:25、seq?id?no:26、seq?id?no:27、seq?id?no:28、seq?id?no:29、seq?id?no:30或seq?id?no:90的核酸序列。在一些實施方案中,構建體包含根據seq?id?no:1-41和/或42-70和/或96-97中的一者或多者的核酸序列。

12、本公開還提供了一種包含可操作地連接至啟動子的編碼序列的構建體,其中所述編碼序列編碼kcnq4抑制性核酸,所述kcnq4抑制性核酸包含與kcnq4基因互補的核苷酸序列。在一些實施方案中,kcnq4抑制性核酸是mirna、sirna或shrna。在一些實施方案中,kcnq4抑制性rna包含根據seq?id?no:42、seq?id?no:43、seq?id?no:44、seq?id?no:45、seqid?no:46、seq?id?no:47、seq?id?no:48、seq?id?no:49、seq?id?no:50、seq?id?no:51、seqid?no:52、seq?id?no:53、seq?id?no:54、seq?id?no:55、seq?id?no:56、seq?id?no:57、seqid?no:58、seq?id?no:59、seq?id?no:60、seq?id?no:61、seq?id?no:62、seq?id?no:63、seqid?no:64、seq?id?no:65、seq?id?no:66、seq?id?no:67、seq?id?no:68、seq?id?no:69、seqid?no:70、seq?id?no:96或seq?id?no:97的序列。在一些實施方案中,kcnq4抑制性rna是grna。在一些實施方案中,kcnq4抑制性rna包含根據seq?id?no:42、seq?id?no:43、seq?idno:44、seq?id?no:45、seq?id?no:46、seq?id?no:47、seq?id?no:48的序列。在一些實施方案中,啟動子是h1或u6啟動子。

13、在一些實施方案中,一種或多種kcnq4抑制性核酸被工程化至本文所描述的構建體的嵌合內含子中的mir支架靶向區(qū)域中。舉例而言,在一些實施方案中,一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種kcnq4抑制性核酸被工程化至本文所描述的構建體的嵌合內含子中的mir支架靶向區(qū)域中。在一些實施方案中,一種或多種kcnq4抑制性核酸被工程化至本文所描述的構建體的3′utr中的mir支架靶向區(qū)域中。舉例而言,在一些實施方案中,一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種kcnq4抑制性核酸被工程化至本文所描述的構建體的3′utr中的mir支架靶向區(qū)域中。

14、在一些實施方案中,本公開提供了一種包含抑制性核酸的構建體,其中所述抑制性核酸是或包含以下一者或多者:mir1-155;mir2-155;mir4-155;mir5-155;mir6-155;mir7-155mir1-16;mir1-26;mir1-96;mir1-122;mir1-135;mir1-182;mir1-183;mir1-335;mir1-451和/或選自由mir1-155;mir2-155;mir4-155;mir5-155;mir6-155;mir7-155;mir1-16;mir1-26;mir1-96;mir1-122;mir1-135;mir1-182;mir1-183;mir1-335;mir1-451以及它們的組合組成的組的mirna。在一些實施方案中,本公開提供了一種包含抑制性核酸的構建體,其中所述抑制性核酸是或包含以下一者或多者:mir2-26;mir6-26;以及它們的組合。

15、在一些實施方案中,本文所描述的構建體可以包含根據seq?id?no:332、seq?idno:333、seq?id?no:334、seq?id?no:335、seq?id?no:336、seq?id?no:337、seq?id?no:338、seq?id?no:339、seq?id?no:340、seq?id?no:341、seq?id?no:342、seq?id?no:343、seq?idno:344、seq?id?no:345、seq?id?no:346、seq?id?no:347、seq?id?no:348、seq?id?no:349、seq?id?no:350、seq?id?no:351、seq?id?no:352、seq?id?no:353、seq?id?no:354或seq?idno:355的序列。

16、在一些實施方案中,本文所描述的構建體包含根據seq?id?no:334、seq?id?no:335、seq?id?no:337、seq?id?no:339、seq?id?no:345、seq?id?no:346、seq?id?no:347、seqid?no:348、seq?id?no:349、seq?id?no:350、seq?id?no:351、seq?id?no:352、seq?id?no:353、seq?id?no:354或seq?id?no:355的序列,而不含flag序列。

17、在一些實施方案中,本公開提供了一種aav顆粒,所述aav顆粒還包含如本文所提供的構建體。在一些實施方案中,aav顆粒還包含aav衣殼,其中所述aav衣殼是或來源于aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav-rh8、aav-rh10、aav-rh39、aav-rh43或aav?anc80衣殼。在一些實施方案中,aav衣殼是aav?anc80衣殼。

18、在一些實施方案中,本公開提供了一種組合物,所述組合物包含至少一種本文所提供的構建體。在一些實施方案中,組合物包含如本文所提供的aav顆粒。在一些實施方案中,組合物的顆粒還包含aav衣殼,其中所述aav衣殼是或來源于aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav-rh8、aav-rh10、aav-rh39、aav-rh43或aav?anc80衣殼。在一些實施方案中,aav顆粒的aav衣殼是aav?anc80衣殼。在一些實施方案中,組合物是藥物組合物。在一些實施方案中,組合物還包含藥學上可接受的載體。

19、本公開還提供了一種細胞。在一些實施方案中,細胞包含一種或多種本文所提供的構建體、組合物和/或顆粒。在一些實施方案中,細胞是體內的、離體的或體外的。在一些實施方案中,細胞是哺乳動物細胞。在一些實施方案中,細胞是人類細胞。在一些實施方案中,細胞被永生化以產生穩(wěn)定的細胞系。在一些實施方案中,人類細胞在受試者的耳中。在一些實施方案中,細胞具有至少一個拷貝的內源kcnq4基因,所述基因具有至少一種序列變異。在一些實施方案中,至少一種序列變異產生功能喪失型基因產物。

20、在一些實施方案中,本公開提供了一種包含可操作地連接至啟動子的編碼序列的細胞,其中所述編碼序列編碼kv7.4蛋白。在一些實施方案中,本公開提供了一種包含可操作地連接至啟動子的編碼序列的細胞,其中所述編碼序列編碼功能喪失型kcnq4變異基因產物。在一些實施方案中,kcnq4基因產物是kv7.4蛋白。在一些此類實施方案中,本公開提供了一種包含一種或多種細胞的細胞群體,其中所述群體是或包含穩(wěn)定的細胞系。

21、在一些實施方案中,內耳細胞是外毛細胞。在一些實施方案中,內耳細胞在受試者的耳中。在一些實施方案中,內耳細胞是體外的或離體的。

22、本公開還提供了一種系統(tǒng)。在一些實施方案中,所述系統(tǒng)包含至少一種如本文所提供的組合物。

23、本公開提供了一種方法,所述方法包括使內耳細胞與至少一種如本文所描述的組合物接觸。

24、本公開提供了一種系統(tǒng)、方法或試劑盒,其包括如圖32-35中描述的裝置。

25、本公開提供了一種方法,所述方法包括使內耳細胞與至少一種如本文所提供的構建體和一種或多種包含aav?rep基因、aav?cap基因、aav?va基因、aav?e2a基因和aav?e4基因的質粒接觸。

26、在一些實施方案中,內耳細胞是外毛細胞。在一些實施方案中,內耳細胞在受試者的耳中。在一些實施方案中,內耳細胞是體外的或離體的。

27、本公開提供了一種方法,所述包括將至少一種如本文所提供的組合物引入受試者的內耳中。在一些實施方案中,將組合物引入受試者的耳蝸中。在一些實施方案中,經由圓窗膜注射引入組合物。

28、在一些實施方案中,本公開的方法還包括測量受試者的聽力水平。在一些實施方案中,通過進行聽覺腦干反應(abr)測試來測量聽力水平。在一些實施方案中,所述方法還包括將受試者的聽力水平與參考聽力水平進行比較。在一些實施方案中,abr閾值的降低、abr閾值的存在和/或正常abr形態(tài)指示受試者的聽力水平已改善或增加。在一些實施方案中,參考聽力水平是公布的或歷史的參考聽力水平。在一些實施方案中,在本文所提供的任何構建體之后測量受試者的聽力水平,并且參考聽力水平是在引入如本文所提供的任何構建體之前測量的受試者的聽力水平。

29、在一些實施方案中,通過進行畸變產物耳聲發(fā)射(dpoae)測試來測量聽力水平。在一些實施方案中,所述方法還包括將受試者的聽力水平與參考聽力水平進行比較。在一些實施方案中,dpoae閾值的降低、dpoae閾值的存在和/或正常dpoae形態(tài)指示受試者的聽力水平已改善或增加。在一些實施方案中,參考聽力水平是公布的或歷史的參考聽力水平。在一些實施方案中,在本文所提供的任何構建體之后測量受試者的聽力水平,并且參考聽力水平是在引入如本文所提供的任何構建體之前測量的受試者的聽力水平。

30、在一些實施方案中,所述方法還包括測量受試者中kcnq4基因產物的水平。在一些實施方案中,在受試者的內耳中測量kcnq4基因產物的水平。在一些實施方案中,在受試者的耳蝸中測量kcnq4基因產物的水平。在一些實施方案中,所述方法還包括將受試者中kcnq4基因產物的水平與參考kcnq4基因產物水平進行比較。在一些實施方案中,參考聽力水平是公布的或歷史的參考kcnq4基因產物水平。在一些實施方案中,在引入如本文所提供的任何構建體之后測量受試者中kcnq4基因產物的水平,并且參考kcnq4基因產物水平是在引入如本文所提供的任何組合物之前測量的受試者的kcnq4基因產物水平。

31、本公開還提供了一種治療聽力損失的方法,所述方法包括向有需要的受試者施用至少一種如本文所提供的組合物。在一些實施方案中,本公開提供了一種治療聽力損失的方法,所述方法包括向有需要的受試者施用至少一種如本文所提供的顆粒。

32、在一些實施方案中,如本文所提供的任何構建體可以用于治療聽力損失。在一些實施方案中,如本文所提供的任何組合物可以用于治療聽力損失。在一些實施方案中,如本文所提供的任何顆??梢杂糜谥委熉犃p失。在一些實施方案中,本公開提供了一種如本文所提供的構建體用于制造用以治療聽力損失的藥劑的用途。在一些實施方案中,本公開提供了一種如本文所提供的組合物用于制造用以治療聽力損失的藥劑的用途。在一些實施方案中,本公開提供了一種如本文所提供的顆粒用于制造用以治療聽力損失的藥劑的用途。

33、定義

34、本公開的范圍由所附權利要求書限定并且不受本文所描述的某些實施方案限制。閱讀本說明書的本領域技術人員將意識到可以等效于此類所描述的實施方案或以其它方式處于權利要求書的范圍內的各種修改。一般而言,除非另有明確指示,否則本文所用的術語與其在本領域中所理解的含義一致。下文提供了某些術語的明確定義;在本說明書通篇,在特定情況下這些和其它術語的含義對于本領域技術人員而言將從上下文顯而易見。

35、在權利要求書中使用諸如“第一”、“第二”、“第三”的順序術語來修飾權利要求要素本身并不意味著一個權利要求要素相對于另一個權利要求要素的任何優(yōu)先權、優(yōu)先級或順序或者執(zhí)行方法動作的時間順序,而僅用作將具有特定名稱的一個權利要求要素與具有相同名稱(但使用順序術語)的另一個要素區(qū)分開以區(qū)分所述權利要求要素的標記。

36、除非相反地明確指示,否則如本文所用,冠詞“一個/種(a/an)”應理解為包括復數指示物。除非相反地指示或從上下文另外顯而易見,否則如果在給定的產物或過程中存在、采用或以其它方式涉及一個、多于一個或所有組成員,則認為滿足在組的一個或多個成員之間包括“或”的權利要求或描述。在一些實施方案中,在給定的產物或過程中存在、采用或以其它方式涉及組的僅一個成員。在一些實施方案中,在給定的產物或過程中存在、采用或以其它方式涉及多于一個或所有組成員。應了解,除非另有指示或除非本領域普通技術人員將顯而易見會出現矛盾或不一致,否則本公開涵蓋將來自一個或多個所列權利要求的一個或多個限制、要素、條款、描述性術語等引入從屬于同一獨立權利要求(或相關的任何其它權利要求)的另一權利要求中的所有變化、組合和排列。在要素以列表(例如,以馬庫什組(markush?group)或類似格式)呈現的情況下,應了解,還公開了要素的每個子組,并且可以從所述組中去除任何要素。應了解,一般而言,在實施方案或方面被稱作“包含”特定要素、特征等的情況下,某些實施方案或方面“由此類要素、特征等組成”或“基本上由此類要素、特征等組成”。為簡單起見,那些實施方案并未在每種情況下在本文中用如此多的詞語具體闡述。還應了解,任何實施方案或方面可以從權利要求書中明確排除,無論本說明書中是否敘述特定排除情況。

37、在本說明書通篇,每當多核苷酸或多肽由字母序列(例如,a、c、g和t,在多核苷酸的情況下分別表示腺苷、胞苷、鳥苷和胸苷)表示時,此類多核苷酸或多肽從左至右以5′至3′或n末端至c末端的順序呈現。

38、施用:如本文所用,術語“施用”通常是指向受試者或系統(tǒng)施用組合物以實現劑向受試者或系統(tǒng)的遞送。在一些實施方案中,劑是組合物或包含于組合物中;在一些實施方案中,通過組合物或其一種或多種組分的代謝產生劑。本領域普通技術人員將意識到在適當情況下可以用于向受試者(例如,人類)施用的多種途徑。舉例而言,在一些實施方案中,施用可以是全身或局部。在一些實施方案中,全身施用可以是靜脈內。在一些實施方案中,施用可以是局部。局部施用可以涉及遞送至耳蝸外淋巴,例如,經由在小管切開術之后注射穿過圓窗膜或注射至鼓階中,中階注射穿過內淋巴、外淋巴和/或內淋巴。在一些實施方案中,施用可以僅涉及單個劑量。在一些實施方案中,施用可以涉及施加固定數目的劑量。在一些實施方案中,施用可以涉及間歇性(例如,時間上隔開的多個劑量)給藥和/或周期性(例如,由共同的時間段隔開的單獨劑量)給藥。在一些實施方案中,施用可以涉及連續(xù)給藥(例如,灌注)持續(xù)至少所選的時間段。

39、等位基因:如本文所用,術語“等位基因”是指特定多態(tài)性基因組基因座的兩個或更多個現有遺傳變體中的一者。

40、改善:如本文所用,術語“改善”是指受試者的狀態(tài)的預防、減輕或緩和,或受試者的狀態(tài)的好轉。改善可以包括但不要求疾病、病癥或疾患的完全恢復或完全預防。

41、氨基酸:在最廣泛的意義上,如本文所用,術語“氨基酸”是指可以例如通過形成一個或多個肽鍵而并入多肽鏈中的任何化合物和/或物質。在一些實施方案中,氨基酸具有通用結構,例如,h2n-c(h)(r)-cooh。在一些實施方案中,氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些實施方案中,氨基酸是非天然氨基酸;在一些實施方案中,氨基酸是d-氨基酸;在一些實施方案中,氨基酸是l-氨基酸?!皹藴拾被帷笔侵柑烊淮嬖诘碾闹型ǔ0l(fā)現的二十種標準l-氨基酸中的任一者?!胺菢藴拾被帷笔侵赋龢藴拾被嵋酝獾娜魏伟被?,無論其以合成方式制備還是從天然來源獲得。在一些實施方案中,氨基酸,包括多肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸,與如上文所示的通用結構相比可以含有結構修飾。舉例而言,在一些實施方案中,氨基酸可以通過與通用結構相比進行甲基化、酰胺化、乙?;?、聚乙二醇化、糖基化、磷酸化和/或取代(例如,氨基、羧酸基、一個或多個質子和/或羥基)而修飾。在一些實施方案中,與含有其它方面相同的未經修飾的氨基酸的多肽相比,此種修飾可以例如改變含有經修飾的氨基酸的多肽的循環(huán)半衰期。在一些實施方案中,與含有其它方面相同的未經修飾的氨基酸的多肽相比,此種修飾并不顯著改變含有經修飾的氨基酸的多肽的相關活性。

42、大約或約:如本文所用,術語“大約”或“約”可以應用于一個或多個所關注的值,包括與規(guī)定參考值類似的值。在一些實施方案中,除非另有規(guī)定或從上下文另外顯而易見(此種數值將超過可能值的100%的情況除外),否則術語“大約”或“約”是指處于規(guī)定參考值的±10%(大于或小于)以內的值的范圍。舉例而言,在一些實施方案中,術語“大約”或“約”可以涵蓋處于參考值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小以內的值的范圍。

43、相關:如本文所用,術語“相關”將兩個事件或實體描述為彼此“相關”,條件為一者的存在、水平和/或形式與另一者的存在、水平和/或形式相關聯。舉例而言,特定實體(例如,多肽、遺傳簽名、代謝物、微生物等)應視為與特定疾病、病癥或疾患相關,條件為其存在、水平和/或形式與疾病、病癥或疾患的發(fā)生率和/或易感性(例如,在相關群體中)相關聯。在一些實施方案中,兩個或更多個實體在物理上彼此“相關”,條件為其直接或間接相互作用,使得其彼此和/保持彼此物理接近。在一些實施方案中,彼此物理相關的兩個或更多個實體彼此共價連接;在一些實施方案中,彼此物理相關的兩個或更多個實體彼此不共價連接,但非共價相關,例如,借助于氫鍵、范德華相互作用(van?der?waals?interaction)、疏水相互作用、磁性以及它們的組合。

44、生物活性:如本文所用,術語“生物活性”是指由所關注的劑或實體實現的可觀察到的生物作用或結果。舉例而言,在一些實施方案中,特異性結合相互作用是生物活性。在一些實施方案中,生物路徑或事件的調節(jié)(例如,誘導、增強或抑制)是生物活性。在一些實施方案中,通過檢測由所關注的生物路徑或事件產生的直接或間接產物來評估生物活性的存在或程度。

45、特征部分:如本文所用,術語“特征部分”在最廣泛的意義上是指物質的一部分,其存在(或不存在)與物質的特定特征、屬性或活性的存在(或不存在)相關聯。在一些實施方案中,物質的特征部分是在給定的物質中和在共享特定特征、屬性或活性的相關物質中發(fā)現,而非在不共享特定特征、屬性或活性的那些物質中發(fā)現的部分。在一些實施方案中,特征部分與完整物質共享至少一種功能特征。舉例而言,在一些實施方案中,蛋白質或多肽的“特征部分”是含有氨基酸連續(xù)段或氨基酸連續(xù)段的集合的部分,其合在一起是蛋白質或多肽的特征。在一些實施方案中,每個此種連續(xù)段一般含有至少2、5、10、15、20、50個或更多個氨基酸。一般而言,物質(例如,蛋白質、抗體等)的特征部分是除上文指定的序列和/或結構同一性以外,與相關完整物質共享至少一種功能特征的部分。在一些實施方案中,特征部分可以是生物活性的。

46、特征序列:如本文所用,術語“特征序列”是在多肽或核酸家族的所有成員中發(fā)現的序列,并且因此可以由本領域普通技術人員用于定義家族的成員。

47、特征序列元件:如本文所用,短語“特征序列元件”是指在聚合物(例如,在多肽或核酸中)中發(fā)現的序列元件,其代表那種聚合物的特征部分。在一些實施方案中,特征序列元件的存在與聚合物的特定活性或特性的存在或水平相關聯。在一些實施方案中,特征序列元件的存在(或不存在)將特定聚合物定義為此類聚合物的特定家族或組的成員(或非成員)。特征序列元件通常包含至少兩個單體(例如,氨基酸或核苷酸)。在一些實施方案中,特征序列元件包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50個或更多個單體(例如,連續(xù)連接的單體)。在一些實施方案中,特征序列元件包括至少第一段和第二段連續(xù)單體,其由一個或多個間隔區(qū)間隔開,所述間隔區(qū)的長度在共享序列元件的聚合物之間可能有變化或可能無變化。

48、裂解:如本文所用,術語“裂解”是指dna中產生斷裂。舉例而言,在一些實施方案中,裂解可以指單鏈斷裂或雙鏈斷裂,這取決于可以用于引起此種斷裂的核酸酶的類型。

49、組合療法:如本文所用,術語“組合療法”是指受試者同時暴露于兩種或更多種治療方案(例如,兩種或更多種治療劑)的那些情況。在一些實施方案中,可以同時施用兩種或更多種劑。在一些實施方案中,可以依序施用兩種或更多種劑。在一些實施方案中,可以在重疊的給藥方案中施用兩種或更多種劑。

50、可比較:如本文所用,術語“可比較”是指兩種或更多種劑、實體、情形、條件集合、受試者、群體等可能彼此不相同但足夠相似以允許在其之間進行比較,使得本領域技術人員將了解可以基于所觀察到的差異或相似性合理地得出結論。在一些實施方案中,可比較的劑、實體、情形、條件集合、受試者、群體等的集合由多個基本上相同的特征和一種或少量不同特征來表征。本領域普通技術人員將了解,在上下文中,在任何給定情況下需要何種程度的同一性以將兩種或更多種此類劑、實體、情形、條件集合、受試者、群體等視為可比較的。舉例而言,本領域普通技術人員將了解,當由足夠數目和類型的基本上相同的特征表征時,劑、實體、情形、條件集合、受試者、群體等的集合彼此可比較,以確保以下合理的結論:在環(huán)境、刺激、劑、實體、情形、條件集合、受試者、群體等的不同集合下或使用所述不同集合所獲得的結果或所觀察到的現象的差異由那些不同特征的變化所引起或指示那些不同特征的變化。

51、構建體:如本文所用,術語“構建體”是指包含能夠攜帶至少一個異源多核苷酸的多核苷酸的組合物。在一些實施方案中,構建體可以是質粒、轉座子、粘粒、人工染色體(例如,人類人工染色體(hac)、酵母人工染色體(yac)、細菌人工染色體(bac)或p1源性人工染色體(pac))或病毒構建體,和任何質粒。構建體可以例如包括足以用于表達的順式作用元件;用于表達的其它元件可以由宿主靈長類動物細胞或在體外表達系統(tǒng)中提供。構建體可以包括當與適當控制元件相關時能夠復制的任何遺傳元件(例如,質粒、轉座子、粘粒、人工染色體或病毒構建體等)。因此,在一些實施方案中,“構建體”可以包括克隆和/或表達構建體和/或病毒構建體(例如,腺相關病毒(aav)構建體、腺病毒構建體、慢病毒構建體或逆轉錄病毒構建體)。

52、保守:如本文所用,術語“保守”是指描述保守氨基酸取代的情況,包括氨基酸殘基由具有類似化學特性(例如,電荷或疏水性)的側鏈r基團的另一個氨基酸殘基取代。一般而言,保守氨基酸取代基本上不會改變蛋白質所關注的功能特性,例如,受體結合至配體的能力。具有類似化學特性的側鏈的氨基酸組的實例包括:脂族側鏈,諸如甘氨酸(gly、g)、丙氨酸(ala、a)、纈氨酸(val、v)、亮氨酸(leu、l)和異亮氨酸(ile、i);脂族羥基側鏈,諸如絲氨酸(ser、s)和蘇氨酸(thr、t);含酰胺側鏈,諸如天冬酰胺(asn、n)和谷氨酰胺(gln、q);芳族側鏈,諸如苯丙氨酸(phe、f)、酪氨酸(tyr、y)和色氨酸(trp、w);堿性側鏈,諸如賴氨酸(lys、k)、精氨酸(arg、r)和組氨酸(his、h);酸性側鏈,諸如天冬氨酸(asp、d)和谷氨酸(glu、e);以及含硫側鏈,諸如半胱氨酸(cys、c)和甲硫氨酸(met、m)。保守氨基酸取代組包括例如纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸(val/leu/ile、v/l/i)、苯丙氨酸/酪氨酸(phe/tyr、f/y)、賴氨酸/精氨酸(lys/arg、k/r)、丙氨酸/纈氨酸(ala/val、a/v)、谷氨酸/天冬氨酸(glu/asp、e/d)和天冬酰胺/谷氨酰胺(asn/gln、n/q)。在一些實施方案中,保守氨基酸取代可以是用丙氨酸取代蛋白質中的任何天然殘基,例如,用于丙氨酸掃描誘變中。在一些實施方案中,進行保守取代,其在gonnet等,1992,science256:1443-1445中公開的pam250對數似然矩陣中具有正值,所述文獻以引用的方式整體并入本文。在一些實施方案中,取代是適度保守取代,其中所述取代在pam250對數似然矩陣中具有非負值。本領域技術人員將了解,來自不同物種的相同蛋白質之間不保守的氨基酸的變化(例如,取代、添加、缺失等)不太可能對蛋白質的功能具有影響,并且因此應選擇這些氨基酸進行突變。在來自不同物種的相同蛋白質之間保守的氨基酸不應改變(例如,缺失、添加、取代等),因為這些突變更有可能引起蛋白質功能的變化。

53、

54、

55、對照:如本文所用,術語“對照”是指“對照”作為比較結果的標準的本領域理解的含義。通常,對照用于通過分離變量以得出關于此類變量的結論來增強實驗中的完整性。在一些實施方案中,對照是與測試反應或測定同時進行以提供比較的反應或測定。舉例而言,在一個實驗中,應用“測試”(即,所測試的變量)。在第二個實驗中,不應用“對照”,即,所測試的變量。在一些實施方案中,對照是歷史對照(例如,先前進行的測試或測定,或先前已知的量或結果)。在一些實施方案中,對照是或包括印刷或以其它方式保存的記錄。在一些實施方案中,對照是陽性對照。在一些實施方案中,對照是陰性對照。

56、確定、測量、評價、評估、測定和分析:如本文所用,術語“確定”、“測量”、“評價”、“評估”、“測定”和“分析”可以互換使用以指代任何形式的測量,并且包括確定要素是否存在。這些術語包括定量和/或定性確定。測定可以是相對或絕對的。舉例而言,在一些實施方案中,“測定存在”可以是確定所存在的某物的量和/或確定其是否存在。

57、編輯:如本文所用,術語“編輯”、“編輯中”或“經編輯”是指通過特定核酸序列(例如,基因組靶序列)的選擇性缺失、經由使用外源核酸序列特定地包含新序列或用外源核酸序列替換核酸序列來改變多核苷酸的核酸序列(例如,野生型天然存在的核酸序列或突變的天然核酸序列)的方法。在一些實施方案中,此種特定基因組靶標包括但不限于染色體區(qū)域、線粒體dna、基因、啟動子、開放閱讀框或任何核酸序列。

58、工程化:一般而言,如本文所用,術語“工程化”是指已由人工操縱的方面。舉例而言,如果已操縱細胞或生物體以改變其遺傳信息(例如,通過例如轉化、交配、體細胞雜交、轉染、轉導或其它機制已引入先前不存在的新遺傳物質,或者通過例如取代或缺失突變或通過交配方案改變或去除先前存在的遺傳物質),則所述細胞或生物體被視為“工程化”。按照慣例并且如本領域技術人員所了解,工程化的多核苷酸或細胞的子代通常仍稱作“工程化”,即使實際操縱是對先前的實體進行。

59、賦形劑:如本文所用,術語“賦形劑”是指可以包含于藥物組合物中,例如以提供或有助于所需稠度或穩(wěn)定作用的無活性(例如,非治療性)劑。在一些實施方案中,適合的藥物賦形劑可以包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。

60、表達:如本文所用,術語核酸序列的“表達”是指從核酸序列產生任何基因產物(例如轉錄物,例如mrna,例如多肽等)。在一些實施方案中,基因產物可以是轉錄物。在一些實施方案中,基因產物可以是多肽。在一些實施方案中,核酸序列的表達涉及以下一項或多項:(1)從dna序列產生rna模板(例如,通過轉錄);(2)rna轉錄物的加工(例如,通過剪接、編輯、5′帽形成和/或3′端形成);(3)rna翻譯成多肽或蛋白質;和/或(4)多肽或蛋白質的翻譯后修飾。

61、功能性:如本文所用,術語“功能性”描述某物以展現表征其的特性和/或活性的形式存在。舉例而言,在一些實施方案中,“功能性”生物分子是呈展現表征其的特性和/或活性的形式的生物分子。在一些此類實施方案中,功能性生物分子相對于另一個非功能性生物分子的特征在于“非功能性”型式不展現與“功能性”分子相同或等效的特性和/或活性。生物分子可以具有一種功能、兩種功能(即,雙功能性)或許多功能(即,多功能性)。

62、基因:如本文所用,術語“基因”是指染色體中編碼基因產物(例如rna產物,例如多肽產物)的dna序列。在一些實施方案中,基因包括編碼序列(即,編碼特定產物的序列)。在一些實施方案中,基因包括非編碼序列。在一些特定實施方案中,基因可以包括編碼(例如,外顯子)和非編碼(例如,內含子)序列兩者。在一些實施方案中,基因可以包括例如可以控制或影響基因表達的一個或多個方面(例如,細胞類型特異性表達、誘導性表達等)的一個或多個調控序列(例如,啟動子、增強子等)和/或內含子序列。如本文所用,術語“基因”一般是指編碼多肽或其片段的核酸的一部分;如本領域普通技術人員從上下文將顯而易見,所述術語可以任選地涵蓋調控序列。此定義不意圖排除將術語“基因”應用于非蛋白質編碼表達單元,而是意圖澄清在大多數情況下,如本文獻中所用的術語是指多肽編碼核酸。在一些實施方案中,基因可以編碼多肽,但那種多肽可能不具有功能性,例如,基因變體可以編碼相對于野生型基因不以相同方式發(fā)揮功能或根本不發(fā)揮功能的多肽。在一些實施方案中,基因可以編碼轉錄物,在一些實施方案中,所述轉錄物的毒性可能超過閾值水平。在一些實施方案中,基因可以編碼多肽,但那種多肽可能不具有功能性和/或毒性可能超過閾值水平。

63、基因組編輯系統(tǒng):如本文所用,術語“基因組編輯系統(tǒng)”是指具有dna編輯活性的任何系統(tǒng)。此外,dna編輯活性可以包括缺失、替換或插入基因組中的dna序列。在一些實施方案中,基因組編輯系統(tǒng)包含rna引導的dna編輯活性。在一些實施方案中,本公開的基因組編輯系統(tǒng)包含多于一種組分。在一些實施方案中,基因組編輯系統(tǒng)包含至少兩種從天然存在的crispr系統(tǒng)改適的組分:引導rna(grna)和rna引導的核酸酶。在某些實施方案中,這兩種組分形成復合物,所述復合物能夠與特定核酸序列締合并且在那種核酸序列中或周圍編輯dna,例如,通過產生單鏈斷裂(ssb或切口)、雙鏈斷裂(dsb)和/或點突變中的一者或多者。在一些實施方案中,本公開的基因組編輯系統(tǒng)缺乏具有裂解活性的組分,但保留具有dna結合活性的組分。在一些此類實施方案中,本公開的基因組編輯系統(tǒng)包含充當dna活性(例如,轉錄、翻譯等)抑制劑的組分。在一些實施方案中,本公開的基因組編輯系統(tǒng)包含與調節(jié)劑融合以調節(jié)靶dna表達的組分。

64、基因組修飾:如本文所用,術語“基因組修飾”是指在細胞的基因組區(qū)域中進行的改變,其永久地改變那個細胞的基因組(例如,內源基因組)。在一些實施方案中,此類改變是體外的、離體的或體內的。在一些實施方案中,活生物體中的每個細胞都經修飾。在一些實施方案中,僅一組特定的細胞(例如,特定器官中的細胞)經修飾。舉例而言,在一些實施方案中,通過從一個或多個基因組區(qū)域中缺失、取代或添加一個或多個核苷酸來修飾基因組。在一些實施方案中,在干細胞或未分化細胞中進行基因組修飾。在一些此類實施方案中,相對于修飾之前的親本基因組,還將對基因組修飾的細胞或生物體的子代進行基因組修飾。在一些實施方案中,對成熟的或有絲分裂后的細胞進行基因組修飾,使得不會產生后代,并且因此除了在特定細胞中之外,基因組修飾沒有繁殖。

65、聽力損失:如本文所用,術語“聽力損失”可以用于指代活生物體部分或完全無法聽到聲音。在一些實施方案中,聽力損失可以是獲得性的。在一些實施方案中,聽力損失可以是遺傳性的。在一些實施方案中,聽力損失可以是基因的。在一些實施方案中,聽力損失可能因疾病或創(chuàng)傷(例如,身體創(chuàng)傷、用一種或多種劑治療導致聽力損失等)所致。在一些實施方案中,聽力損失可能歸因于一種或多種已知遺傳原因和/或綜合征。在一些實施方案中,聽力損失可能具有未知病因。在一些實施方案中,聽力損失可能會或可能不會通過使用助聽器或其它治療而減輕。

66、異源:如本文所用,術語“異源”可以用于指代與另一個區(qū)域和/或另一個分子相比特定分子的一個或多個區(qū)域。舉例而言,在一些實施方案中,異源多肽結構域是指多肽結構域不天然地一起出現(例如,在同一多肽中)的事實。舉例而言,在人工產生的融合蛋白中,來自一個多肽的多肽結構域可以與來自不同多肽的多肽結構域融合。在此種融合蛋白中,兩個多肽結構域將視為彼此“異源”,因為其不天然地一起出現。

67、同一性:如本文所用,術語“同一性”是指聚合分子之間,例如,核酸分子(例如,dna分子和/或rna分子)之間和/或多肽分子之間的總體相關性。在一些實施方案中,如果聚合分子的序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一,則所述聚合分子被視為彼此“基本上相同”。兩個核酸或多肽序列的同一性百分比的計算例如可以通過出于最佳比較目的比對兩個序列來進行(例如,可以在第一序列和第二序列中的一者或兩者中引入空位以用于最佳比對,并且出于比較目的可以忽略不相同的序列)。在一些實施方案中,出于比較目的比對的序列的長度是參考序列長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或基本上100%;然后比較相應位置處的核苷酸。當第一序列中的位置與第二序列中的相應位置由相同殘基(例如,核苷酸或氨基酸)占據時,則兩個分子(即,第一和第二)在那個位置處相同。兩個序列之間的同一性百分比是將為了兩個序列的最佳比對而需要引入的空位的數目和每個空位的長度考慮在內,由這兩個序列共享的相同位置的數目的函數。序列的比較和兩個序列之間的同一性百分比的確定可以使用數學算法來完成。舉例而言,兩個核苷酸序列之間的同一性百分比可以使用meyers和miller(cabios,1989,4:11-17,其以引用的方式整體并入本文)的算法來確定,所述算法已并入align程序(2.0版)中。在一些實施方案中,用align程序進行的核酸序列比較使用pam120權重殘基表、空位長度罰分12和空位罰分4。

68、抑制性核酸:如本文所用,術語“抑制性核酸”是指與靶基因特異性雜交的核酸序列,所述靶基因包括靶dna或rna(例如靶mrna(例如鉀通道基因產物,例如鉀通道m(xù)rna,例如kcnq4?mrna))。因此,在一些實施方案中,抑制性核酸抑制靶基因的表達和/或活性。在一些實施方案中,抑制性核酸是短干擾rna(sirna)、短發(fā)夾rna(shrna)、微小rna(或“mirna”)、反義寡核苷酸、引導rna(grna)或核酶。在一些實施方案中,抑制性核酸的長度在約10個核苷酸至約30個核苷酸之間(例如,約10個核苷酸至約28個核苷酸、約10個核苷酸至約26個核苷酸、約10個核苷酸至約24個核苷酸、約10個核苷酸至約22個核苷酸、約10個核苷酸至約20個核苷酸、約10個核苷酸至約18個核苷酸、約10個核苷酸至約16個核苷酸、約10個核苷酸至約14個核苷酸、約10個核苷酸至約12個核苷酸、約12個核苷酸至約30個核苷酸、約12個核苷酸至約28個核苷酸、約12個核苷酸至約26個核苷酸、約12個核苷酸至約24個核苷酸、約12個核苷酸至約22個核苷酸、約12個核苷酸至約20個核苷酸、約12個核苷酸至約18個核苷酸、約12個核苷酸至約16個核苷酸、約12個核苷酸至約14個核苷酸、約16個核苷酸至約30個核苷酸、約16個核苷酸至約28個核苷酸、約16個核苷酸至約26個核苷酸、約16個核苷酸至約24個核苷酸、約16個核苷酸至約22個核苷酸、約16個核苷酸至約20個核苷酸、約16個核苷酸至約18個核苷酸、約18個核苷酸至約30個核苷酸、約18個核苷酸至約28個核苷酸、約18個核苷酸至約26個核苷酸、約18個核苷酸至約24個核苷酸、約18個核苷酸至約22個核苷酸、約18個核苷酸至約20個核苷酸、約20個核苷酸至約30個核苷酸、約20個核苷酸至約28個核苷酸、約20個核苷酸至約26個核苷酸、約20個核苷酸至約24個核苷酸、約20個核苷酸至約22個核苷酸、約22個核苷酸至約30個核苷酸、約22個核苷酸至約28個核苷酸、約22個核苷酸至約26個核苷酸、約22個核苷酸至約24個核苷酸、約24個核苷酸至約30個核苷酸、約24個核苷酸至約28個核苷酸、約24個核苷酸至約26個核苷酸、約26個核苷酸至約30個核苷酸、約26個核苷酸至約28個核苷酸、約28個核苷酸至約30個核苷酸,或11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸)。在一些實施方案中,抑制性核酸是靶向kcnq4的抑制性rna。在一些此類實施方案中,抑制性kcnq4?rna與kcnq4上的靶標特異性雜交。在一些此類實施方案中,kcnq4抑制性rna包括例如,抑制性核酸是短干擾rna(sirna)、短發(fā)夾rna(shrna)、微小rna(mirna)、反義寡核苷酸、引導rna(grna)或核酶。在一些實施方案中,抑制性kcnq4?rna的雜交減少kcnq4基因產物的表達。本文提供了示例性kcnq4抑制性rna序列。

69、改善、增加、增強、抑制或減少:如本文所用,術語“改善”、“增加”、“增強”、“抑制”、“減少”或其語法等效物指示相對于基線或其它參考測量值的值。在一些實施方案中,值與基線或其它參考測量值具有統(tǒng)計顯著差異。在一些實施方案中,適當參考測量值可以是或包括在特定系統(tǒng)中(例如,在單個個體中),在不存在/存在特定劑或治療(例如,之前和/或之后)其它方面可比較的條件下,或在適當可比較的參考劑存在下的測量值。在一些實施方案中,適當參考測量值可以是或包括在已知或預期以特定方式作出反應的可比較系統(tǒng)中在相關劑或治療存在下的測量值。在一些實施方案中,適當參考是陰性參考;在一些實施方案中,適當參考是陽性參考。

70、敲低:如本文所用,術語“敲低”是指一種或多種基因產物的表達減少。在一些實施方案中,抑制性核酸實現敲低。在一些實施方案中,本文所描述的基因組編輯系統(tǒng)實現敲低。

71、敲除:如本文所用,術語“敲除”是指一種或多種基因產物的表達消除。在一些實施方案中,本文所描述的基因組編輯系統(tǒng)實現敲除。

72、調節(jié):如本文所用,術語“調節(jié)”意指與不存在治療或化合物的情況下受試者中的反應水平相比和/或與其它方面相同但未經治療的受試者中的反應水平相比,介導受試者中的反應水平的可檢測的增加或減少。所述術語涵蓋擾亂和/或影響天然信號或反應,從而在受試者、優(yōu)選人類中介導有益的治療反應。

73、核酸酶:如本文所用,術語“核酸酶”是指能夠裂解連接核酸分子中的核苷酸殘基的磷酸二酯鍵的劑,例如,蛋白質或小分子。在一些實施方案中,核酸酶是蛋白質,例如,可以結合核酸分子并裂解連接核酸分子內的核苷酸殘基的磷酸二酯鍵的酶。核酸酶可以是裂解多核苷酸鏈內的磷酸二酯鍵的核酸內切酶,或裂解多核苷酸鏈末端處的磷酸二酯鍵的核酸外切酶。在一些實施方案中,核酸酶是結合和/或裂解特定核苷酸序列內的特定磷酸二酯鍵的位點特異性核酸酶,所述特定核苷酸序列在本文中也稱作“識別序列”、“核酸酶靶位點”或“靶位點”。在一些實施方案中,核酸酶是rna引導的(即,rna可編程的)核酸酶,其與具有與靶位點互補的序列的rna復合(例如,結合),從而提供核酸酶的序列特異性。在一些實施方案中,核酸酶識別單鏈靶位點,而在其它實施方案中,核酸酶識別雙鏈靶位點,例如,雙鏈dna靶位點。許多天然存在的核酸酶,例如許多天然存在的dna限制性核酸酶的靶位點是本領域技術人員眾所周知的。在許多情況下,dna核酸酶(例如,ecori、hindiii或bamhi)識別長度為4至10個堿基對的回文雙鏈dna靶位點,并且在靶位點內的特定位置處切割兩條dna鏈中的每一者。一些核酸內切酶對稱地切割雙鏈核酸靶位點,即,在相同位置處切割兩條鏈,使得末端包含堿基配對的核苷酸,在本文中也稱作平端。其它核酸內切酶不對稱地切割雙鏈核酸靶位點,即,在不同位置處切割每條鏈,使得末端包含未配對核苷酸。雙鏈dna分子末端處的未配對核苷酸也稱作“突出端”,例如,“5′-突出端”或“3′-突出端”,這取決于未配對核苷酸是否形成給定dna鏈的5′或3′端。以未配對核苷酸結尾的雙鏈dna分子末端也稱作粘性末端,因為它們可以“粘附至”包含互補的未配對核苷酸的其它雙鏈dna分子末端。核酸酶蛋白通常包含介導蛋白質與核酸底物相互作用并且在一些情況下還特異性結合靶位點的“結合結構域”,以及催化核酸主鏈內的磷酸二酯鍵裂解的“裂解結構域”。在一些實施方案中,核酸酶蛋白可以結合并裂解單體形式的核酸分子,而在其它實施方案中,核酸酶蛋白必須二聚化或多聚化以便裂解靶核酸分子。天然存在的核酸酶的結合結構域和裂解結構域以及可以融合產生結合特定靶位點的核酸酶的模塊結合結構域和裂解結構域是本領域技術人員眾所周知的。

74、核酸:如本文所用,術語“核酸”在最廣泛的意義上是指并入或可以并入寡核苷酸鏈中的任何化合物和/或物質。在一些實施方案中,核酸是經由磷酸二酯鍵聯并入或可以并入寡核苷酸鏈中的化合物和/或物質。如從上下文將顯而易見,在一些實施方案中,“核酸”是指單獨核酸殘基(例如,核苷酸和/或核苷);在一些實施方案中,“核酸”是指包含單獨核酸殘基的寡核苷酸鏈。在一些實施方案中,“核酸”是或包含rna;在一些實施方案中,“核酸”是或包含dna。在一些實施方案中,核酸是、包含一個或多個天然核酸殘基或由一個或多個天然核酸殘基組成。在一些實施方案中,核酸是、包含一個或多個核酸類似物或由一個或多個核酸類似物組成。在一些實施方案中,核酸類似物與核酸的不同之處在于其不利用磷酸二酯主鏈。或者或另外,在一些實施方案中,核酸具有一個或多個硫代磷酸酯和/或5′-n-亞磷酰胺鍵聯而非磷酸二酯鍵。在一些實施方案中,核酸是、包含一個或多個天然核苷(例如,腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷)或由其組成。在一些實施方案中,核酸是、包含一個或多個核苷類似物(例如,2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥苷、0(6)-甲基鳥嘌呤、2-硫胞苷、甲基化堿基、嵌入堿基以及它們的組合)或由其組成。在一些實施方案中,與天然核酸中的那些相比,核酸包含一個或多個經修飾的糖(例如,2′-氟核糖、核糖、2′-脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些實施方案中,核酸具有編碼功能基因產物,諸如rna或蛋白質的核苷酸序列。在一些實施方案中,核酸包括一個或多個內含子。在一些實施方案中,通過以下一種或多種方式制備核酸:從天然來源分離,通過基于互補模板(體內或體外)聚合進行酶促合成,在重組細胞或系統(tǒng)中復制,和化學合成。在一些實施方案中,核酸的長度是至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000個或更多個殘基。在一些實施方案中,核酸是部分或完全單鏈;在一些實施方案中,核酸是部分或完全雙鏈。在一些實施方案中,核酸具有包含至少一個元件的核苷酸序列,所述至少一個元件編碼多肽或與編碼多肽的序列互補。在一些實施方案中,核酸具有酶活性。

75、可操作地連接:如本文所用,是指其中所描述的組分處于允許所述組分以其預期方式發(fā)揮功能的關系的并置?!翱刹僮鞯剡B接”至功能元件的控制元件以在與控制元件相容的條件下實現功能元件的表達和/或活性的方式締合。在一些實施方案中,“可操作地連接的”控制元件與所關注的編碼元件相連(例如,共價連接);在一些實施方案中,控制元件與所關注的功能元件反式作用或以其它方式作用于所關注的功能元件。在一些實施方案中,“可操作地連接”是指調控序列與異源核酸序列之間的功能性連接促成后者的表達。舉例而言,當第一核酸序列與第二核酸序列處于功能關系時,第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。在一些實施方案中,例如,功能性連接可以包括轉錄控制。舉例而言,如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表達,則啟動子可操作地連接至編碼序列??刹僮鞯剡B接的dna序列可以彼此相連,并且例如在有必要連接兩個蛋白質編碼區(qū)的情況下,處于同一閱讀框中。

76、藥物組合物:如本文所用,術語“藥物組合物”是指其中活性劑與一種或多種藥學上可接受的載體一起配制的組合物。在一些實施方案中,活性劑以適于在治療方案中施用的單位劑量存在,當向相關群體施用時,所述治療方案顯示出實現預定治療作用的統(tǒng)計顯著概率。在一些實施方案中,藥物組合物可以專門配制用于以固體或液體形式施用,包括適于例如施用的那些,例如可注射制劑,例如水性或非水性溶液或懸浮液或經設計以向耳道施用的液滴。在一些實施方案中,藥物組合物可以被配制用于經由在特定器官或區(qū)室中注射,例如直接注射至耳中,或全身(例如,靜脈內)施用。在一些實施方案中,制劑可以是或包含浸液(水性或非水性溶液或懸浮液)、片劑、大丸劑、粉末、顆粒、糊劑、膠囊、粉末等。在一些實施方案中,活性劑可以是或包含分離的、純化的或純的化合物。

77、藥學上可接受的:如本文所用,例如關于用于配制如本文所公開的藥物組合物的載體、稀釋劑或賦形劑可以使用的術語“藥學上可接受的”意指載體、稀釋劑或賦形劑與組合物的其它成分相容并且對其接受者無害。

78、藥學上可接受的載體:如本文所用,術語“藥學上可接受的載體”意指將主題化合物從一個器官或身體部分攜帶或轉運至另一個器官或身體部分中所涉及的藥學上可接受的材料、組合物或媒劑,諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑包封材料。在與制劑的其它成分相容并且對患者無害的意義上,每種載體必須是“可接受的”??梢猿洚斔帉W上可接受的載體的材料的一些實例包括:糖,諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,諸如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉;纖維素及其衍生物,諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素;粉狀黃蓍膠;麥芽;明膠;滑石;賦形劑,諸如可可脂和栓劑蠟;油,諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油;二醇,諸如丙二醇;多元醇,諸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;酯,諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯;瓊脂;緩沖劑,諸如氫氧化鎂和氫氧化鋁;海藻酸;無熱原水;等張鹽水;林格氏溶液(ringer′s?solution);乙醇;ph緩沖溶液;聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐;以及藥物制劑中所采用的其它無毒相容物質。

79、多肽:如本文所用,術語“多肽”是指通常由肽鍵連接的殘基(例如,氨基酸)的任何聚合鏈。在一些實施方案中,多肽具有自然界中存在的氨基酸序列。在一些實施方案中,多肽具有自然界中不存在的氨基酸序列。在一些實施方案中,多肽具有通過人工作用而設計和/或產生的經工程化的氨基酸序列。在一些實施方案中,多肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸或兩者或由其組成。在一些實施方案中,多肽可以包括例如修飾或連接至一個或多個氨基酸側鏈的一個或多個側基或其它修飾,其在多肽的n末端、在多肽的c末端或它們的任何組合處。在一些實施方案中,此類側基或修飾可以是乙?;?、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等,包括它們的組合。在一些實施方案中,多肽可以含有l(wèi)-氨基酸、d-氨基酸或兩者,并且可以含有本領域中已知的多種氨基酸修飾或類似物中的任一者。在一些實施方案中,有用的修飾可以是或包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些實施方案中,蛋白質可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸以及它們的組合。術語“肽”一般用于指代長度小于約100個氨基酸、小于約50個氨基酸、小于20個氨基酸或小于10個氨基酸的多肽。在一些實施方案中,蛋白質是抗體、抗體片段、其生物活性部分和/或其特征部分。

80、多核苷酸:如本文所用,術語“多核苷酸”是指核酸的任何聚合鏈。在一些實施方案中,多核苷酸是或包含rna;在一些實施方案中,多核苷酸是或包含dna。在一些實施方案中,多核苷酸是、包含一個或多個天然核酸殘基或由其組成。在一些實施方案中,多核苷酸是、包含一個或多個核酸類似物或由其組成。在一些實施方案中,多核苷酸類似物與核酸的不同之處在于其不利用磷酸二酯主鏈。或者或另外,在一些實施方案中,多核苷酸具有一個或多個硫代磷酸酯和/或5′-n-亞磷酰胺鍵聯而非磷酸二酯鍵。在一些實施方案中,多核苷酸是、包含一個或多個天然核苷(例如,腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷)或由其組成。在一些實施方案中,多核苷酸是、包含一個或多個核苷類似物(例如,2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥苷、0(6)-甲基鳥嘌呤、2-硫胞苷、甲基化堿基、嵌入堿基以及它們的組合)或由其組成。在一些實施方案中,與天然核酸中的那些相比,多核苷酸包含一個或多個經修飾的糖(例如,2′-氟核糖、核糖、2′-脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些實施方案中,多核苷酸具有編碼功能基因產物,諸如rna或蛋白質的核苷酸序列。在一些實施方案中,多核苷酸包括一個或多個內含子。在一些實施方案中,通過以下一種或多種方式制備多核苷酸:從天然來源分離,通過基于互補模板(體內或體外)聚合進行酶促合成,在重組細胞或系統(tǒng)中復制,和化學合成。在一些實施方案中,多核苷酸的長度是至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000個或更多個殘基。在一些實施方案中,多核苷酸是部分或完全單鏈;在一些實施方案中,多核苷酸是部分或完全雙鏈。在一些實施方案中,多核苷酸具有包含至少一個元件的核苷酸序列,所述至少一個元件編碼多肽或是編碼多肽的序列的補體。在一些實施方案中,多核苷酸具有酶活性。

81、蛋白質:如本文所用,術語“蛋白質”是指多肽(即,一串通過肽鍵彼此連接的至少兩個氨基酸)。蛋白質可以包括除氨基酸以外的部分(例如,可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以按其它方式加工或修飾。本領域普通技術人員將了解,“蛋白質”可以是由細胞產生的完整多肽鏈(帶有或不帶有信號序列),或者可以是其特征部分。本領域普通技術人員將了解,蛋白質有時可以包括多于一條多肽鏈,例如,由一個或多個二硫鍵連接或以其它方式相關。

82、重組:如本文所用,術語“重組”意圖指代通過重組方式設計、工程化、制備、表達、產生、制造和/或分離的多肽,諸如使用轉染至宿主細胞中的重組表達構建體表達的多肽;從重組、組合人類多肽文庫分離的多肽;從動物(例如,小鼠、兔、綿羊、魚等)分離的多肽,所述動物是轉基因的或以其它方式操縱以表達編碼和/或引導多肽或其一個或多個組分、部分、元件或結構域的表達的一個或多個基因或基因組分;和/或通過任何其它方式制備、表達、產生或分離的多肽,所述方式涉及將所選核酸序列元件彼此剪接或連接,化學合成所選序列元件,和/或以其它方式產生編碼和/或引導多肽或其一個或多個組分、部分、元件或結構域的表達的核酸。在一些實施方案中,此類所選序列元件中的一者或多者在自然界中發(fā)現。在一些實施方案中,此類所選序列元件中的一者或多者在計算機中設計。在一些實施方案中,一個或多個此類所選序列元件由已知序列元件的誘變(例如,體內或體外)產生,所述已知序列元件例如來自天然或合成來源,諸如在所關注的源生物體(例如,人類、小鼠等)的種系中。

83、參考:如本文所用,術語“參考”描述相對于其進行比較的標準或對照。舉例而言,在一些實施方案中,將所關注的劑、動物、個體、群體、樣品、序列或值與參考或對照劑、動物、個體、群體、樣品、序列或值進行比較。在一些實施方案中,與所關注的測試或確定基本上同時測試和/或確定參考或對照。在一些實施方案中,參考或對照是歷史參考或對照,任選地在有形介質中體現。通常,如本領域技術人員將了解,在與評估中的那些可比較的條件或環(huán)境下確定或表征參考或對照。本領域技術人員將了解何時存在足夠的相似性來證明與特定可能參考或對照的依賴性和/或比較。在一些實施方案中,參考是陰性對照參考;在一些實施方案中,參考是陽性對照參考。

84、調控元件:如本文所用,術語“調控元件”或“調控序列”是指以某種方式調控一個或多個特定基因的表達的dna非編碼區(qū)。在一些實施方案中,此類基因與給定調控元件并列或“鄰近”。在一些實施方案中,此類基因位于距給定調控元件相當遠的位置。在一些實施方案中,調控元件損害或增強一個或多個基因的轉錄。在一些實施方案中,調控元件可以與所調控的基因順式定位。在一些實施方案中,調控元件可以與所調控的基因反式定位。舉例而言,在一些實施方案中,調控序列是指調控可操作地連接至調控序列的基因產物的表達的核酸序列。在一些此類實施方案中,此序列可以是調控基因產物的表達的增強子序列和其它調控元件。

85、樣品:如本文所用,術語“樣品”通常是指獲自或來源于所關注的來源的材料的等分試樣。在一些實施方案中,所關注的來源是生物或環(huán)境來源。在一些實施方案中,所關注的來源可以是或包含細胞或生物體,諸如微生物(例如,病毒)、植物或動物(例如,人類)。在一些實施方案中,所關注的來源是或包含生物組織或流體。在一些實施方案中,生物組織或流體可以是或包含羊水、房水、腹水、膽汁、骨髓、血液、母乳、腦脊液、耵聹、乳糜、食糜、射精液、內淋巴、滲出液、糞便、胃酸、胃液、淋巴、粘液、心包液、外淋巴、腹膜液、肋膜液、膿液、稀粘液、唾液、皮脂、精液、血清、包皮垢、痰液、滑液、汗液、淚液、尿液、陰道分泌物、玻璃體液、嘔吐物和/或它們的組合或一種或多種組分。在一些實施方案中,生物流體可以是或包含細胞內液、細胞外液、血管內液(血漿)、間隙液、淋巴液和/或跨細胞液。在一些實施方案中,生物流體可以是或包含植物滲出液。在一些實施方案中,生物組織或樣品可以通過例如抽吸、活檢(例如,細針或組織活檢)、拭子(例如,口腔、鼻腔、皮膚或陰道拭子)、刮擦、手術、洗滌或灌洗(例如,支氣管肺泡、導管、鼻腔、眼部、口腔、子宮、陰道或其它洗滌或灌洗)而獲得。在一些實施方案中,生物樣品是或包含從個體獲得的細胞。在一些實施方案中,樣品是通過任何適當方式直接從所關注的來源獲得的“初級樣品”。在一些實施方案中,如從上下文將顯而易見,術語“樣品”是指通過加工初級樣品(例如,通過去除初級樣品的一種或多種組分和/或通過向初級樣品中添加一種或多種劑)而獲得的制劑。舉例而言,使用半透膜過濾。此種“經加工的樣品”可以包含例如從樣品中提取或通過對初級樣品進行一種或多種技術,諸如核酸的擴增或逆轉錄、某些組分的分離和/或純化等而獲得的核酸或蛋白質。

86、受試者:如本文所用,術語“受試者”是指生物體,通常是哺乳動物(例如,人類,在一些實施方案中包括產前人類形態(tài))。在一些實施方案中,受試者罹患相關疾病、病癥或疾患。在一些實施方案中,受試者易患疾病、病癥或疾患。在一些實施方案中,受試者展現疾病、病癥或疾患的一種或多種癥狀或特征。在一些實施方案中,受試者不展現疾病、病癥或疾患的任何癥狀或特征。在一些實施方案中,受試者是具有表征對疾病、病癥或疾患的易感性或風險的一種或多種特征的人。在一些實施方案中,受試者是患者。在一些實施方案中,受試者是正施用和/或已施用診斷和/或療法的個體。

87、基本上:如本文所用,術語“基本上”是指展現所關注的特征或特性的全部或接近全部范圍或程度的定性條件。本領域普通技術人員將了解,生物和化學現象極少(如果有)完成和/或進行至完成或者實現或避免絕對結果。因此,術語“基本上”在本文中用于捕獲許多生物和化學現象中固有的潛在完整度缺乏。

88、靶位點:如本文所用,術語“靶位點”意指結合分子,例如微小rna、sirna、引導rna(“grna”)或引導rna:cas復合物將結合的核酸的一部分,只要存在足夠的結合條件即可。在一些實施方案中,包含靶位點的核酸是雙鏈。在一些實施方案中,包含靶位點的核酸是單鏈。通常,靶位點包含結合分子,例如本文所描述的grna或grna:cas復合物所結合的和/或由于此種結合而裂解的核酸序列。在一些實施方案中,靶位點包含與本文所描述的grna的靶向序列(本文中也稱作間隔區(qū))結合的dna序列互補的核酸序列(本文中也稱作靶序列或原間隔區(qū))。在一些實施方案中,在rna引導的核酸酶,例如crispr/cas核酸酶的情形中,靶位點通常包含與rna可編程核酸酶的grna中所包含的序列(本文中也稱作靶向序列或間隔區(qū))互補的核苷酸序列(本文中也稱作靶序列或原間隔區(qū))。在一些此類實施方案中,靶位點還包含位于與grna互補序列相鄰的3′端或5′端處的原間隔區(qū)相鄰基序(pam)。對于rna引導的核酸酶cas9,在一些實施方案中,靶序列可以是16-24個堿基對加上3-6個堿基對的pam(例如,nnn,其中n代表任何核苷酸)。rna引導的核酸酶(諸如cas9)的示例性pam序列是本領域技術人員已知的,并且包括但不限于nng、ngn、nag、nga、ngg、ngag和ngcg,其中n表示任何核苷酸。另外,已描述了來自不同物種的cas9核酸酶,例如,嗜熱鏈球菌(s.thermophilus)識別包含序列nggng的pam,并且來自金黃色葡萄球菌(s.aureus)cas9識別包含序列nngrrt的pam。在一些實施方案中,來自金黃色葡萄球菌的cas9識別包含序列nnnrrt的pam。額外pam序列是本領域中已知的,包括但不限于nnagaaw和naar(參見例如esvelt和wang,molecular?systems?biology,9:641(2013),其以引用的方式整體并入本文)。舉例而言,rna引導的核酸酶(諸如cas9)的靶位點可以包含結構[nz]-[pam],其中每個n獨立地是任何核苷酸,并且z是1與50之間的整數。在一些實施方案中,z是至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50。在一些實施方案中,z是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。在一些實施方案中,z是20。

89、冶療:如本文所用,術語“治療(treatment)”(也稱為“治療(treat)”或“治療(treating)”)是指療法的任何施用,所述療法部分或完全減輕、改善、消除、逆轉、緩解、抑制特定疾病、病癥和/或疾患的一種或多種癥狀、特征和/或病因,延遲其發(fā)作,降低其嚴重程度,和/或降低其發(fā)生率。在一些實施方案中,此種治療可以針對不展現相關疾病、病癥和/或疾患的體征的受試者和/或僅展現疾病、病癥和/或疾患的早期體征的受試者?;蛘呋蛄硗?,此種治療可以針對展現相關疾病、病癥和/或疾患的一種或多種確定體征的受試者。在一些實施方案中,治療可以針對已被診斷為患有相關疾病、病癥和/或疾患的受試者。在一些實施方案中,治療可以針對已知具有在統(tǒng)計學上與給定疾病、病癥和/或疾患的發(fā)展風險增加相關聯的一種或多種易感因素的受試者。

90、變體:如本文所用,術語“變體”是指在某種程度上不同于另一種型式的某物的型式,例如,基因序列。為了確定某物是否為變體,通常選擇參考型式并且變體相對于所述參考型式是不同的。在一些實施方案中,變體可以具有與野生型序列相同或不同(例如,增加或減少)的活性或功能性水平。舉例而言,在一些實施方案中,如果變體例如經密碼子優(yōu)化以抵抗例如抑制性核酸(例如,mirna)的降解,則所述變體與野生型序列相比可以具有改善的功能性。此種變體在本文中稱作功能獲得型變體。在一些實施方案中,變體具有引起負向結果的活性或功能性降低或消除或活性變化(例如,增加的電活性引起慢性去極化,導致細胞死亡)。此種變體在本文中稱作功能喪失型變體。舉例而言,在一些實施方案中,kcnq4基因序列是野生型序列,其編碼功能性蛋白并且存在于基因組合有kcnq4基因的物種的大多數成員中。在一些此類實施方案中,功能獲得型變體可以是相對于野生型kcnq4基因序列含有一個或多個核苷酸差異的kcnq4的基因序列。在一些實施方案中,野生型序列不是內源序列。在一些實施方案中,功能獲得型變體是編碼轉錄物或多肽的密碼子優(yōu)化的序列,所述轉錄物或多肽相比其相應的野生型(例如,非密碼子優(yōu)化)型式可以具有改善的特性(例如對降解的易感性較低,例如對mirna介導的降解的易感性較低)。在一些實施方案中,功能喪失型變體具有一個或多個變化,使得轉錄物或多肽相對于野生型轉錄物和/或多肽在某種程度上有缺陷(例如,功能降低、無功能)。舉例而言,在一些實施方案中,kcnq4序列中的突變產生無功能或其它方面有缺陷的kcnq4蛋白,其損害或阻止耳外毛細胞中含有kcnq4的鉀通道的功能。在一些此類實施方案中,此類含有功能喪失型變體kcnq4的通道引起外毛細胞的慢性去極化,并且因此導致細胞死亡。

當前第1頁1 2 
網友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1