專(zhuān)利名稱(chēng)：一種卡拉八糖的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
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本發(fā)明涉及生物化學(xué)、微生物和酶工程領(lǐng)域，具體涉及利用卡拉膠降解酶生產(chǎn)聚合度為 3-6的卡拉膠寡糖的方法，尤其涉及利用卡拉膠酶生產(chǎn)聚合度為4的卡拉八糖的方法，該方法 制備的卡拉八糖具有具有抑制腫瘤血管生成、抗血栓、抗衰老和治療糖尿病的作用。
背景技術(shù)：
卡拉膠是一種來(lái)源于海洋紅藻的以1，3-P -D半乳糖和1,4-a -D半乳糖交替連接形成骨架 的硫酸半乳聚糖，由于卡拉膠帶有大量的硫酸根，表現(xiàn)出很多生理活性，例如抗病毒作用、 抗?jié)?、抗凝和抗血栓作用等。但是由于卡拉膠屬于高分子化合物，粘度大，擴(kuò)散困難，很 難吸收，且有一定的毒性，因此嚴(yán)重限制了卡拉膠在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。因而通過(guò)制備卡 拉寡糖，降低分子量，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性，增強(qiáng)其生物活性和溶解性，可作為開(kāi)發(fā) 海洋功能食品、海洋新藥的重要資源，增加產(chǎn)品的技術(shù)含量和附加值，對(duì)促進(jìn)海藻化學(xué)工業(yè) 的蓬勃發(fā)展、海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展、提高海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)水平具有重要意義。
但目前卡拉膠的降解有化學(xué)法和酶法兩種，其中化學(xué)法降解產(chǎn)物不均一，工藝難以控制， 因此難以產(chǎn)業(yè)化；酶法降解雖然專(zhuān)一性較強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，工藝易于控制，產(chǎn)業(yè)化前景好， 但是目前酶解產(chǎn)物多是聚合度較低的卡拉二糖和卡拉四糖，而且由于酶活性較低，產(chǎn)物得率 低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種降解專(zhuān)一性較強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、工藝易于控制、產(chǎn)業(yè)化前 景好，產(chǎn)物得率高的一種卡拉八糖的酶法制備方法。
本發(fā)明的原理是利用卡拉膠降解酶為工具，該酶可專(zhuān)一性作用于卡拉膠的1,a-3,(3糖苷 鍵，降解卡拉膠獲得產(chǎn)物均一的卡拉寡糖，主要為卡拉八糖，分離后得到卡拉八糖純品。
本發(fā)明的技術(shù)方案是 一種卡拉八糖，其分子結(jié)構(gòu)式如下其中n代表卡拉膠寡糖的聚合度，n=4，分子量為1642。 上述卡拉八糖的制備方法，具體步驟如下
(1) 培養(yǎng)微生物N52 24小時(shí)，5000轉(zhuǎn)離心去掉微生物，收集上清，作為粗酶液使用；
(2) 將粗酶按照粗酶蒸餾水=1:10 50的體積比稀釋?zhuān){(diào)pH為6. 0-7. 0，制備酶解工
作液；
(3) 按照每100毫升酶解工作液加入1克卡拉膠的比例向酶解工作液中加入卡拉膠，然 后在35'C下進(jìn)行酶解，酶解效果與酶解時(shí)間相關(guān)，時(shí)間越長(zhǎng)酶解效果越好，酶解半小時(shí)后體 系中就出現(xiàn)卡拉八糖的產(chǎn)物，酶解24小時(shí)后，卡拉膠完全被降解為卡拉八糖。酶解過(guò)程中可 以通過(guò)控制酶解時(shí)間獲得不同分子量的產(chǎn)物；
(4) 酶解完成后，用95%的乙醇沉淀，收集沉淀物，沉淀物中95%以上的產(chǎn)物是卡拉八 糖；或者7(TC減壓濃縮后，將濃縮液冷凍，然后冷凍干燥，收集粗品，粗品中95%以上的產(chǎn)物 是卡拉八糖；
(5) 對(duì)步驟(4)收集的沉淀物或粗品進(jìn)行分離純化，獲得卡拉八糖純品。 本發(fā)明制備的卡拉八糖具有抑制腫瘤血管生成、抗菌、抗氧化和降血糖的作用。 本發(fā)明的有益效果是卡拉膠降解酶活性較高，專(zhuān)一作用于卡拉膠的l,a-3,p糖苷鍵，生
成產(chǎn)物均一，制備方法簡(jiǎn)單易行、可產(chǎn)業(yè)化；該制備方法獲得的卡拉八糖具有非常廣闊的醫(yī)
藥領(lǐng)域應(yīng)用前景。


圖1是卡拉膠降解酶降解卡拉膠的情況示意圖中A、 B、 C、 D、 E分別代表卡拉膠酶作用于卡拉膠24、 12、 6、 3、 0. 5小時(shí)的薄層 結(jié)果，l代表卡拉八糖的薄層結(jié)果。圖2是卡拉八糖抑制腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的結(jié)果。
圖中A:沒(méi)有腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)；B:存在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液的誘導(dǎo)作用；C:卡拉八 糖抑制腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液的誘導(dǎo)作用。
圖3是卡拉八糖抑制腫瘤血管生成的結(jié)果。
圖中A:陰性對(duì)照；B:陰性對(duì)照小鼠皮下乳腺癌腫瘤的組織切片，箭頭所示為毛細(xì)血 管；C:經(jīng)卡拉膠八糖(200mg/Kg)干預(yù)后，小鼠腫瘤表面情況；D:經(jīng)卡拉膠八糖干預(yù)后 (200mg/Kg)，小鼠皮下乳腺癌腫瘤的組織切片。
圖4是卡拉八糖對(duì)小鼠SOD活性的影響。
圖5是卡拉八糖對(duì)小鼠血液MDA含量的影響。
圖6是卡拉八糖對(duì)小鼠血液中GSH-Px活性的影響。
圖7是卡拉八糖對(duì)小鼠血糖濃度的影響。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
卡拉八糖的制備
以海洋微生物N52分泌的卡拉膠降解酶為工具，培養(yǎng)微生物N52 24小時(shí)，5000轉(zhuǎn)離心 去掉微生物，收集上清，作為粗酶液使用；將粗酶按照粗酶:蒸餾水=1: 50的體積比稀釋?zhuān)?調(diào)pH為6. 0-7. 0，制備酶解工作液；按照每100毫升酶解工作液加入1克卡拉膠的比例向酶 解工作液中加入卡拉膠，然后在35'C下進(jìn)行酶解，降解時(shí)間為24小時(shí)，95%的乙醇沉淀降解 產(chǎn)物，收集后冷凍干燥，以DNS法檢測(cè)分子量為1642，經(jīng)薄層層析檢測(cè)，降解產(chǎn)物均一，經(jīng) spei-dexG250分離可獲得純品，結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖1町以看出半小時(shí)后在卡拉膠酶的作用下， 卡拉膠降解產(chǎn)物已經(jīng)出現(xiàn)，主要為卡拉膠八糖，同時(shí)還有很多卡拉膠沒(méi)有被降解，隨著時(shí)間 的延長(zhǎng)，卡拉膠被酶降解的程度增強(qiáng)，24小時(shí)后卡拉膠基本上被卡拉膠酶降解完全，產(chǎn)物均 一，主要是卡拉膠八糖。
實(shí)施例2:
卡拉八糖抑制腫瘤血管生成的作用以實(shí)施例1中獲得卡拉八糖體外作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卡拉八糖具有 抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用結(jié)果見(jiàn)圖2;由圖2可以看出，A:沒(méi)有腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)， 血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移效果較?。籅:在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液的誘導(dǎo)作用下，細(xì)胞遷移效果明顯；C:
在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液存在的同時(shí)，加入200ug/mL卡拉八糖，明顯抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。 以肺癌細(xì)胞對(duì)小鼠進(jìn)行荷瘤，通過(guò)給小鼠用200mg/Kg的卡拉八糖灌胃進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)卡 拉八糖具有抑制腫瘤小鼠血管生成的作用，結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖3可以看出，A:陰性對(duì)照未用
卡拉八糖進(jìn)行干預(yù)的小鼠皮下的乳腺癌腫瘤，瘤體表面長(zhǎng)滿(mǎn)血管；B:陰性對(duì)照未用卡拉八糖 進(jìn)行干預(yù)的小鼠皮下乳腺癌腫瘤的組織切片，箭頭所示為毛細(xì)血管；C:經(jīng)卡拉膠八糖干預(yù)后， 腫瘤表面沒(méi)有血管存在；D:經(jīng)卡拉膠八糖干預(yù)后，小鼠皮下乳腺癌腫瘤的組織切片，幾乎看 不到血管的存在。
實(shí)施例3
卡拉八糖的抗氧化作用
以不同劑量的卡拉八糖灌胃小鼠，連續(xù)灌胃30天后，以溴化苯對(duì)小鼠造成損傷，12小時(shí) 后，處死小鼠，檢測(cè)小鼠血液中丙二醛的含量、超氧化物歧化酶的活性和谷胱甘肽過(guò)氧化物 酶的活性，發(fā)現(xiàn)卡拉膠八糖具有降低小鼠血液中丙二醛含量、提高超氧化物歧化酶和谷胱甘 肽過(guò)氧化物酶活性的作用，表現(xiàn)出抗氧化的作用，結(jié)果見(jiàn)圖4、 5、 6。由圖4可以看出卡拉八 糖可以顯著的提高動(dòng)物血液中SOD的活性，其中卡拉八糖劑量為50mg/Kg時(shí)的作用最強(qiáng)，可以 將小鼠血液中S0D活性提高40yc，隨著濃度的增高，這種作用逐漸降低；由圖5可以看出卡拉八 糖可以顯著降低小鼠血液中丙二醛的含量，表現(xiàn)出抗氧化的作用，其中卡拉八糖劑量為 50mg/Kg時(shí)的作用最強(qiáng)，相對(duì)于對(duì)照組可以使血液中丙二醛的含量降低40%;由圖6可以看出卡 拉八糖可以顯著提高小鼠血液中GSH-Px的活性，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，這種提高GSH-Px 活性的作用隨劑量的增高而增高。
實(shí)施例4
卡拉八糖的降血糖作用通過(guò)四氧嘧啶處理小鼠，建立糖尿病小鼠模型，以實(shí)施例1制備的卡拉八糖灌胃糖尿病 小鼠14天后，通過(guò)O-TB法檢測(cè)小鼠血液中的血糖含量，結(jié)果標(biāo)明卡拉八糖具有降低小鼠血 糖含量的作用，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可以看出模型小鼠的血糖相對(duì)于對(duì)照未處理的空白小鼠 的血糖明顯升高，血糖值達(dá)空白小鼠的160%，不同劑量卡拉八糖都可以顯著降低模型小鼠的 血糖含量，表現(xiàn)出降血糖作用，其中卡拉八糖劑量為25mg/Kg時(shí)的作用最好，處理后小鼠血 糖值幾乎恢復(fù)正常。
權(quán)利要求
1、一種卡拉八糖，其特征在于，分子結(jié)構(gòu)式如下其中n代表聚合度，n＝4，分子量為1642。
2、 權(quán)利要求l所述的一種卡拉八糖的制備方法，其特征在于，該方法歩驟如下(1) 培養(yǎng)微生物N52 24小時(shí)，5000轉(zhuǎn)離心去掉微生物，收集上清，作為粗酶液使用；(2) 將粗酶按照粗酶:蒸餾水=1:10 50的體積比稀釋?zhuān){(diào)pH為6. 0-7. 0，制備酶解工作液；(3) 按照每100毫升酶解工作液加入1克卡拉膠的比例，向酶解工作液中加入卡拉膠， 然后在35'C下進(jìn)行酶解，酶解效果與酶解時(shí)間相關(guān)，時(shí)間越長(zhǎng)酶解效果越好，酶解半小時(shí)后 體系中就出現(xiàn)卡拉八糖的產(chǎn)物，酶解24小時(shí)后，卡拉膠完全被降解為卡拉八糖，酶解過(guò)程中 可以通過(guò)控制酶解時(shí)間獲得不同分子量的產(chǎn)物；(4) 酶解完成后，用95%的乙醇沉淀，收集沉淀物，沉淀物中95%以上的產(chǎn)物是卡拉八 糖；或者7(TC減壓濃縮后，將濃縮液冷凍，然后冷凍干燥，收集粗品，粗品中95%以上的產(chǎn)物 是卡拉八糖；(5) 對(duì)步驟(4)收集的沉淀物或粗品進(jìn)行分離純化，獲得卡拉八糖純品。
3、 權(quán)利要求1所述的一種卡拉八糖的應(yīng)用，其特征在于，具有抑制腫瘤血管生成、抗菌、 抗氧化和降血糖的作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物化學(xué)、微生物和酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種卡拉八糖的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明是利用卡拉膠降解酶作為工具，該酶可專(zhuān)一性的作用于卡拉膠1，α-3，β糖苷鍵，降解卡拉膠獲得產(chǎn)物均一的聚合度為4的卡拉八糖，其分子結(jié)構(gòu)式如上。本發(fā)明制備的卡拉八糖具有具有抑制腫瘤血管生成、抗血栓、抗衰老和治療糖尿病的作用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101602811SQ20091001238
公開(kāi)日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2009年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月4日
發(fā)明者吳海歌, 姚子昂 申請(qǐng)人:大連大學(xué)