本發(fā)明屬于遺傳育種領域，具體涉及扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白mahmbp及其編碼基因、植物雙元載體和應用。

背景技術：

隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展、城市的急劇擴大，自然環(huán)境中的重金屬污染日益嚴重。每年因重金屬污染帶來的糧食減產(chǎn)達1000多萬噸，被重金屬污染的糧食每年達1200萬噸，年經(jīng)濟損失在200億以上。傳統(tǒng)的土壤重金屬污染修復技術有排土填埋法、稀釋法、淋洗法、物理分離法和化學法等因成本高、效率低，而且會破壞土壤結構，導致二次污染等原因，難以大面積應用。

植物修復是生物修復(bioremediation)的一種方式，又稱綠色修復(greenremediation)，是以植物忍耐、分解或超量積累某種或某些化學元素的生理功能為基礎，利用植物及其共存微生物體系來吸收、降解、揮發(fā)和富集環(huán)境中污染物的一項環(huán)境污染治理技術。與傳統(tǒng)的處理方式相比，植物修復的主要優(yōu)點是成本低，處理設施簡單，適合大規(guī)模的應用，利于土壤生態(tài)系統(tǒng)的保持，對環(huán)境擾動小，具有美學價值等特點。但是目前植物修復的能力有限，例如，植物對于重金屬的種類和濃度的抗性均有一定限度，這大大制約了植物修復的應用。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白及其編碼基因和植物雙元載體，所述扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白或編碼基因具有提高植物的抗重金屬的功能。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：

本發(fā)明提供了一種扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白mahmbp，具有序列表中seqidno.1所示的氨基酸序列。

本發(fā)明提供了一種扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白編碼基因mahmbp，具有序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種植物雙元載體，pcambia-1301載體中包含權利要求2所述的扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白編碼基因mahmbp、煙草的染色質附著sar序列的外源基因的表達單元。

本發(fā)明還提供了所述的重金屬結合蛋白基因mahmbp或所述的植物雙元載體在培育抗重金屬植物中的應用。

優(yōu)選的，所述植物包括擬南芥。

優(yōu)選的，所述重金屬包括鉻離子、鎘離子、汞離子、鉻離子、鉛離子和砷離子中的一種或幾種。

優(yōu)選的，所述培育的方法采用農(nóng)桿菌介導法將所述重金屬結合蛋白基因mahmbp或所述植物雙元載體轉化入宿主植物中。

本發(fā)明了扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白mahmbp及其編碼基因，為了進一步分析所述基因在重金屬逆境中的作用與功能，比較轉mahmbp基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株的抗重金屬性。結果表明，野生型和轉mahmbp基因擬南芥植株在表型上有很大的差異；同時在500μm濃度的氯化鉻濃度培養(yǎng)基處理下野生型生長明顯受抑制，根系不生長，葉片稀少，而轉基因株系抑制較小，這說明mahmbp基因明顯提高了擬南芥的抗重金屬能力。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中擬南芥轉化的植物表達載體示意圖；

圖2為實施例5轉mahmbp基因擬南芥的gus染色圖；

圖3為實施例6轉mahmbp基因擬南芥與野生型擬南芥的抗重金屬表型圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白mahmbp，具有序列表中seqidno.1所示的氨基酸序列。

本發(fā)明中，所述扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白mahmbp的合成方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的合成方法即可。

本發(fā)明提供了一種扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白編碼基因mahmbp，具有序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明中，所述扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白編碼基因mahmbp的合成方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的合成方法即可。

本發(fā)明中，所述扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白編碼基因mahmbp的合成方法優(yōu)選采用人工方法合成。所述人工方法包括以下步驟：

依照ptds(pcr-basedtwo-stepdnasynthesis，ptds)方法進行源自扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白編碼基因的化學合成，在保持mahmbp基因的氨基酸序列不變的基礎上，合成基因編碼區(qū)，根據(jù)得到的基因編碼區(qū)核苷酸序列設計引物擴增了mahmbp基因。

本發(fā)明中，所述合成基因編碼區(qū)的設計方法包括以下部分：

(一)優(yōu)化基因密碼子，提高基因翻譯效率；

(二)消除基因內(nèi)部的常用限制性內(nèi)切酶的識別位點，便于表達盒構建；

(三)消除逆向重復序列、莖環(huán)結構和轉錄終止信號，使基因內(nèi)部的gc/at均衡，提高rna的穩(wěn)定性；

(四)使基因編碼蛋白符合n端原則(tobias1991)，以提高翻譯蛋白的穩(wěn)定性；

(五)設計提高基因5’端的自由能，以提高基因翻譯起始效率。

所述引物包括正向引物和反向引物。所述正向引物的核苷酸序列為tcagaagaaccatcagaagac(seqidno.3)。所述反向引物的的核苷酸序列為gagcaacagtagtagcagag(seqidno.4)。

本發(fā)明還提供了一種植物雙元載體，pcambia-1301載體中包含權利要求2所述的扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白編碼基因mahmbp、煙草的染色質附著sar序列的外源基因的表達單元。

本發(fā)明中，所述植物雙元載體的構建方法，包括以下步驟：

①將pcambia-1301載體在bamhi和sacl酶的作用下進行酶切，得到酶切后的線性pcambia-1301載體；

②扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白編碼基因mahmbp兩端添加bamhi和sacl酶切位點；

③在所述步驟②中得到的具有bamhi和sacl酶切位點的扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白編碼基因mahmbp的兩端添加上煙草的染色質附著sar序列，以保證轉基因的穩(wěn)定遺傳，得到兩端附加了煙草的染色質附著sar序列的外源基因的表達單元；

④將所述步驟①得到的線性pcambia-1301載體和所述步驟③得到的兩端附加了煙草的染色質附著sar序列的外源基因的表達單元連接，得到植物雙元載體。

本發(fā)明中，所述植物雙元載體中外源基因的表達由雙camv355啟動子+tmvomegaleadersequence控制。

本發(fā)明還提供了所述的重金屬結合蛋白基因mahmbp或所述的植物雙元載體在培育抗重金屬植物中的應用。

本發(fā)明中，所述植物優(yōu)選包括擬南芥。

本發(fā)明中，所述重金屬優(yōu)包括鉻離子、鎘離子、汞離子、鉻離子、鉛離子和砷離子中的一種或幾種。

本發(fā)明中，所述培育的方法優(yōu)選采用農(nóng)桿菌介導法將所述重金屬結合蛋白基因mahmbp或所述植物雙元載體轉化入宿主植物中。

本發(fā)明中，所述培育方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的培育方法即可。

本發(fā)明中，培育后的抗重金屬植物優(yōu)選進行功能驗證。所述驗證方法為將培育后的抗重金屬植物自交純合3代，獲得純合轉化株，收取種子；將所述種子播種后，在22℃條件下生長兩周；將野生型和轉基因培養(yǎng)皿小苗進行抗重金屬實驗。

本發(fā)明中，所述抗重金屬實驗的方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的抗重金屬實驗即可。所述重金屬的種類為氯化鉻。所述氯化鉻的摩爾濃度優(yōu)選為300～600μm，更優(yōu)選為500μm。

下面結合實施例對本發(fā)明提供的扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白mahmbp及其編碼基因、植物雙元載體和應用進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。

本發(fā)明所用的試驗材料及其來源如下：

野生型擬南芥(arabidopsisthaliana)和生態(tài)型擬南芥columbia在23℃人工氣候室培養(yǎng)，16h光照培養(yǎng)，光照強度為130μmol/(㎡·s)。

克隆載體pmd-18-simplet、各類限制性內(nèi)切酶、taq聚合酶、連接酶、dntp、10×pcrbuffer和dnamarker購自寶生物工程大連有限公司。

所有的化學試劑購買自美國西格瑪化學公司和上海國藥化學試劑。

測序試劑盒購自美國應用系統(tǒng)公司的abipriambig-dyeterminatordna測序試劑盒。

本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪－奧德里奇(sigma－aldrich)。

實施例1

扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白mahmbp基因的人工合成

根據(jù)genbank登錄的扭脫甲基桿菌mahmbp基因序列，用以基因合成方法【nucleicacidsresearch,2004,32,e98】，在不改變基因編碼的氨基酸序列的前提下，按以下原則進行合成基因編碼區(qū)的設計：(一)優(yōu)化基因密碼子，提高基因翻譯效率。(二)消除基因內(nèi)部的常用限制性內(nèi)切酶的識別位點，便于表達盒構建。(三)消除逆向重復序列、莖環(huán)結構和轉錄終止信號，使基因內(nèi)部的gc/at均衡，提高rna的穩(wěn)定性。(四)使基因編碼蛋白符合n端原則(tobias1991)，以提高翻譯蛋白的穩(wěn)定性。(五)設計提高基因5’端的自由能，以提高基因翻譯起始效率。

擴增條件為：94℃預熱1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，2min，使用的taqdna聚合酶為kodfxtaq酶(toyobo公司，日本)，共25個循環(huán)。

pcr結束后，1％瓊脂糖膠回收，取10μl直接與t/a克隆載體相連(大連寶生物公司)。4℃連接過夜，高效轉化dh5α感受態(tài)中。獲得陽性克隆。

實施例2

mahmbp農(nóng)桿菌雙元載體的構建

上述人工合成的mahmbp基因的陽性克隆用引物經(jīng)pcr擴增后頭尾分別加入bamhi和saci切點，經(jīng)bamhi+saci雙酶切，回收dna片段與相應酶切的載體相連，經(jīng)酶切鑒定和測序后得到正確的雙元載體(見圖1)。

實施例3

電擊法轉化農(nóng)桿菌

1)制備農(nóng)桿菌gv3101感受態(tài)，方法參照micropulsertmelectroporationapparatusoperatinginstructionsandapplicationguide(bio-rad公司)((rainerietal.,bio.tech.,1990,8:33-38)。

2)取50μlgv3101感受態(tài)細胞，加入1μldna，轉入0.2cm電擊杯轉化(400ω，2.5kv，25μf)。加入1ml含有1％甘露醇的lb培養(yǎng)基恢復培養(yǎng)2小時(28℃，250rpm)。分別取10μl、100μl涂lb平板(利福平50μg/ml，慶大霉素50μg/ml，氯霉素100μg/ml)。

3)挑取幾個克隆，堿法抽提農(nóng)桿菌質粒，酶切鑒定，pcr檢測。

實施例4

農(nóng)桿菌介導轉化擬南芥

a擬南芥的培養(yǎng)

1)擬南芥種子在4℃進行2－3天的春化處理，目的是有利于種子的一致萌發(fā)和花期的提前。

2)將蛭石、黑土、珍珠巖按9：3：0.5的比例拌勻，經(jīng)高溫滅菌后裝于10cm的塑料小盆，以營養(yǎng)液pns浸濕待用。

3)以牙簽將擬南芥種子點播于濕潤的基質上，保鮮膜封口。放置于22℃暗培養(yǎng)2－3天，待種子萌發(fā)后，揭開保鮮膜，置于22℃培養(yǎng)室中進行16小時光照培養(yǎng)。

4)擬南芥抽苔后及抽苔后兩周以及轉化后需再以pns營養(yǎng)液浸濕一次。中途可視情況適當澆水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生長，當次生苔長至2－10cm(少數(shù)已經(jīng)開花)可用于轉化(何玉科，鞏振輝，細跑生物學雜志,1991,13(3):97-101)。

b農(nóng)桿菌的準備

1)挑取農(nóng)桿菌單菌接種于5mllb液體培養(yǎng)基(利福平50μg/ml，氯霉素100μg/ml)中，28℃，250rpm培養(yǎng)20小時。(rashidetal.,1996)

2)取1ml菌液轉接入20－30mllb液體培養(yǎng)基(利福平50μg/ml，氯霉素100μg/ml)中，28℃，250rpm培養(yǎng)約12小時，測od600≈1.5。

3)8000rpm，4℃，10min離心收集菌體，重懸于農(nóng)桿菌轉化滲透液(5％蔗糖，0.05％silwetl-77)并稀釋至od600≈0.8。

c擬南芥蘸花法轉化

1)將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約3～5秒后取出，全部轉化完畢后，托盤中加入pns營養(yǎng)液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤環(huán)境，置于22℃培養(yǎng)室低光強度下生長24小時，即可正常培養(yǎng)。

2)初次轉化四天后，可再進行一次轉化，重復兩次，總共轉化三次，這樣可以在花發(fā)育的不同時期進行轉化，提高轉化效率。

3)生長約兩個月后，收集種子，4℃冰箱貯存待用。

實施例5

擬南芥轉化植株種子的篩選

1)稱25－30mg種子放入1.5ml離心管。

2)1ml75％乙醇消毒1min(不停搖晃振蕩)，8000rpm離心5秒，去上清。

3)加入1ml過濾后的漂白粉消毒15min(不停搖晃振蕩，充分消毒)，8000rpm離心5秒，去上清。

4)無菌水洗滌3－4次。

5)將種子均勻的播撒到1/2ms平板(hyg50μg/ml)上，parafilm膜封口，4℃冰箱放置兩天，22℃，16小時光照培養(yǎng)6天。

6)將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進行gus活性檢測，選出陽性植株(t1)繼續(xù)培養(yǎng)，并收集種子進行t2代和t3代篩選。

實施例6

轉基因陽性植株的檢測

按jefferson(1978)的方法，將待測擬南芥葉片樣品與x-gluc染色反應液(50mmol/lnah2po4，ph7.0；0.5mmol/lk4[fe(cn)6]，0.1％tritonx-100，20％甲醇，0.5mg/mlx-gluc[x-glucuronide])于37℃保溫2～4小時后，用75％乙醇脫色觀察。

由圖2可以看出，離心管底部沉淀為藍色，說明擬南芥葉片樣品為轉基因陽性植株。

實施例7

扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白mahmbp基因轉化植物后的抗重金屬分析

將轉化植物自交純合3代，獲得純合轉化株，收取種子。播種后，在22℃生長兩個星期。然后比較了轉mahmbp基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株的抗重金屬性。重金屬首先抑制的根的生長，根長是比較直接簡單的指標。

結果如圖3所示，結果表明，野生型和轉mahmbp基因擬南芥植株在表型上有很大的差異。結果顯示在500μm濃度的氯化鉻濃度培養(yǎng)基處理下野生型生長明顯受抑制，根系不生長，葉片稀少，而轉基因株系抑制較小。說明mahmbp基因明顯提高了擬南芥的抗重金屬能力。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。

sequencelisting

<110>上海市農(nóng)業(yè)科學院

<120>扭脫甲基桿菌重金屬結合蛋白mahmbp及其編碼基因、植物雙元載體和應用

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>234

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ggatccatggatcagtctccaatcgaacttactatgagagttgatggtatgacttgtgaa60

ggttgtgctgaagctgtcagaagaaccatcagaagacttgatccacaagctgacgtctct120

gttgatgttggtcttggcagagtctctgctactactgttgctcagtctctggatgttgct180

caagctctgactcaagctggctatactgctactgctatgactggctaagagctc234

<210>2

<211>73

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

metaspglnserproilegluleuthrmetargvalaspglymetthr

151015

cysgluglycysalaglualavalargargthrileargargleuasp

202530

proglnalaaspvalservalaspvalglyleuglyargvalserala

354045

thrthrvalalaglnserleuaspvalalaglnalaleuthrglnala

505560

glytyrthralathralametthrgly

6570

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tcagaagaaccatcagaagac21

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gagcaacagtagtagcagag20