一種來(lái)源于扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白基因及其抗重金屬應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明將一種來(lái)源于扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)入植物并使得這種轉(zhuǎn)基因植物能夠具備增加植物抗重金屬的作用。所述重金屬結(jié)合蛋白基因按植物偏愛(ài)密碼合成含234個(gè)堿基，編碼的氨基酸73個(gè)；所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。本發(fā)明中來(lái)源于扭脫甲基桿菌的重簡(jiǎn)化結(jié)合采用人工方法合成，轉(zhuǎn)基因植物具備較高的抗重金屬性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種來(lái)源于扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白基因及其抗重 金屬應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種來(lái)源于扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白 基因的序列，利用農(nóng)桿菌將該基因轉(zhuǎn)化到植物中，使植物抗金屬能力得到提高。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展、城市的急劇擴(kuò)大，自然環(huán)境中的重金屬污染日益嚴(yán) 重。每年因重金屬污染帶來(lái)的糧食減產(chǎn)達(dá)1000多萬(wàn)噸，被重金屬污染的糧食每年達(dá)1200 萬(wàn)噸，年經(jīng)濟(jì)損失在200億以上。傳統(tǒng)的土壤重金屬污染修復(fù)技術(shù)有排土填埋法、稀釋 法、淋洗法、物理分離法和化學(xué)法等因成本高、效率低，而且會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致二次污 染等原因，難以大面積應(yīng)用。
[0003] 與傳統(tǒng)的處理方式相比，植物修復(fù)的主要優(yōu)點(diǎn)是成本低，處理設(shè)施簡(jiǎn)單，適合大 規(guī)模的應(yīng)用，利于土壤生態(tài)系統(tǒng)的保持，對(duì)環(huán)境擾動(dòng)小，具有美學(xué)價(jià)值等特點(diǎn)。植物修復(fù) 是生物修復(fù)（bioremediation)的一種方式，又稱綠色修復(fù)（green remediation)，是以植 物忍耐、分解或超量積累某種或某些化學(xué)元素的生理功能為基礎(chǔ)，利用植物及其共存微生 物體系來(lái)吸收、降解、揮發(fā)和富集環(huán)境中污染物的一項(xiàng)環(huán)境污染治理技術(shù)。
[0004] 然而，植物修復(fù)的關(guān)鍵核心問(wèn)題在于修復(fù)的效率問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù) 提高植物修復(fù)的效率，從而希望能引領(lǐng)植物修復(fù)技術(shù)的新一輪發(fā)展。
[0005] 本項(xiàng)發(fā)明利用PTDS法合成了來(lái)源于扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白基因，將該 基因轉(zhuǎn)化擬南芥，進(jìn)而提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐重金屬能力，該基因?qū)τ谂嘤参锟怪亟?屬的植物品種非常重要，具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于將一種來(lái)源于扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白 基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，并對(duì)該轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行功能驗(yàn)證，以證明它具有提高植物的抗重金屬 的功能。
[0007] -種來(lái)源于扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白斯，其核苷酸序列如SEQ ID N0 1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0008] 所述來(lái)源于扭脫甲基桿菌的根據(jù)植物偏愛(ài)人工合成的重金屬結(jié)合蛋白ife/M爐長(zhǎng) 234bp，編碼的氨基酸73個(gè)。
[0009] 所述來(lái)源于扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白ife?爐通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入擬南 芥，應(yīng)用于植物抗重金屬性。
[0010] 所述來(lái)源于扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白基因采用人工方法合成，具 體包括以下步驟： 的人工合成 依照PTDS(PCR_based two-step DNA synthesis，PTDS)方法進(jìn)行源自扭脫甲基桿菌的 重金屬結(jié)合蛋白基因進(jìn)行化學(xué)合成，在保持基因的氨基酸序列不變的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì) 引物合成了 基因。
[0011] 2 ) 娜SP農(nóng)桿菌雙元載體的構(gòu)建 #a娜SP基因植物雙元載體在pcAMBIA-1301載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成，在pCAMBIA-1301 載體的多克隆位點(diǎn)處插入兩端附加了煙草的染色質(zhì)附著SAR序列的外源基因的表達(dá)單元， 這有利于轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定遺傳；在外源基因的表達(dá)單元內(nèi)，我們?cè)谀康幕虻膬蓚?cè)導(dǎo)入了 BamHI和Sacl酶切位點(diǎn)，便于外源基因的插入，外源基因的表達(dá)由雙CAMV355啟動(dòng)子+TMV omega leader sequence 控制。
[0012] 3)電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 參照 MicroPulser? Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide (BIO-RAD公司）制備農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài).并且將構(gòu)建好的農(nóng)桿菌 雙元載體經(jīng)電擊法轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌中。
[0013] 4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥 利用蘸花法將構(gòu)建好的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入擬南芥體內(nèi).首先將擬南芥的花苔浸入滲透液中， 輕輕攪動(dòng)約3?5秒后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后，托盤(pán)中加入PNS營(yíng)養(yǎng)液，以黑色塑料袋套盆 封口，保持濕潤(rùn)環(huán)境，置于22°C培養(yǎng)室，低光強(qiáng)度下生長(zhǎng)24小時(shí)，即可正常培養(yǎng)。生長(zhǎng)約兩 個(gè)月后，收集種子，4 °C冰箱貯存待用。
[0014] 5)擬南芥轉(zhuǎn)化植株種子的篩選 將得到的種子進(jìn)行篩選，包括GUS組織化學(xué)染色分析和轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的PCR檢測(cè)得 到轉(zhuǎn)入基因的擬南芥。
[0015] 6)轉(zhuǎn)基因擬南芥抗重金屬性驗(yàn)證 將轉(zhuǎn)化植物自交純合3代，獲得純合轉(zhuǎn)化株，收取種子。播種后，在22°C生長(zhǎng)兩個(gè)星 期。然后將野生型和轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)皿小苗用于抗重金屬實(shí)驗(yàn)。用50〇μΜ濃度的氯化鉻溶液處 理野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。處理一周，結(jié)果顯示在50〇μΜ氯化鉻處理下野生型生長(zhǎng)明 顯受抑制，根系不生長(zhǎng)，葉片稀少，而轉(zhuǎn)基因株系抑制較小。結(jié)果說(shuō)明基因明顯提高 了擬南芥的抗重金屬能力。
[0016] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的有益效果 本發(fā)明采用PTDS法合成了來(lái)源于扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白ife/M爐基因，為了 進(jìn)一步分析該基因在重金屬逆境中的作用與功能，我們比較了轉(zhuǎn)基因的擬南芥植 株和野生型擬南芥植株的抗重金屬性。結(jié)果表明，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在表 型上有很大的差異。結(jié)果顯示在50〇μΜ濃度的氯化鉻濃度培養(yǎng)基處理下野生型生長(zhǎng)明顯受 抑制，根系不生長(zhǎng)，葉片稀少，而轉(zhuǎn)基因株系抑制較小。結(jié)果說(shuō)明iJWC基因明顯提高了擬 南芥的抗重金屬能力。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是用于擬南芥轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體示意圖。
[0018] 圖2是獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥的⑶S染色圖。
[0019] 圖3是轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥的抗重金屬表型圖。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，所述實(shí)施例僅用以說(shuō) 明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明 技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
[0021] 本發(fā)明所用的試驗(yàn)材料及其來(lái)源包括： 野生型擬南芥)生態(tài)型擬南芥，23 °C人工氣候室培 養(yǎng)，16 h光照培養(yǎng)。
[0022] 克隆載體pMD-18-Simple T、各類(lèi)限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶、連接酶、dNTP、 10XPCR buffer和DNA marker購(gòu)自寶生物工程大連有限公司。所有的化學(xué)試劑都從美國(guó) 西格瑪化學(xué)公司和上海國(guó)藥化學(xué)試劑購(gòu)買(mǎi)。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA測(cè)序試劑 盒購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)公司。
[0023] 本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購(gòu)自西格瑪一奧德里奇（Sigma - Aldrich)。
[0024] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如沒(méi)有特別注明，均參考自《分子克隆》一書(shū)（J.薩 姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科學(xué)出版社)。
[0025] 實(shí)施例1 扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白基因的人工合成 根據(jù)Genbank登錄的扭脫甲基桿菌基因序列，用以基因合成方法【Nucleic Acids Research, 2004，32，e98】，在不改變基因編碼的氨基酸序列的前提下，按以下原 則進(jìn)行合成基因編碼區(qū)的設(shè)計(jì)：（一）優(yōu)化基因密碼子，提高基因翻譯效率。（二）消除基因 內(nèi)部的常用限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，便于表達(dá)盒構(gòu)建。（三)消除逆向重復(fù)序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu) 和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，使基因內(nèi)部的GC/AT均衡，提高RNA的穩(wěn)定性。（四)使基因編碼蛋白符合 N端原則（Tobias 1991)，以提商翻譯蛋白的穩(wěn)定性。（五)設(shè)計(jì)提商基因5'端的自由能，以 提商基因翻譯起始效率。
[0026] 擴(kuò)增條件為：94°C 預(yù)熱 1 min ;94°C，30 s，50°C，30 s，72°C，2 min，使用的 Taq DNA聚合酶為KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本)，共25個(gè)循環(huán)。
[0027] PCR結(jié)束后，1%瓊脂糖膠回收，取10 μ?直接與T/A克隆載體相連(大連寶生物 公司）。4°C連接過(guò)夜，高效轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)中。獲得陽(yáng)性克隆。
[0028] 實(shí)施例2 農(nóng)桿菌雙元載體的構(gòu)建 上述人工合成的基因的陽(yáng)性克隆用引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后頭尾分別加入Bam HI和 Sac I切點(diǎn)，經(jīng)Bam HI + Sac I雙酶切，回收DNA片段與相應(yīng)酶切的載體相連，經(jīng)酶切鑒定 和測(cè)序后得到正確的雙元載體(見(jiàn)圖1)。
[0029] 實(shí)施例3 電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 1)制備農(nóng)桿菌 GV3101 感受態(tài)，方法參照 MicroPulser? Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide (BIO-RAD 公司）((Raineri et al., Bio. Tech·, 1990， 8: 33-38)。
[0030] 2)取5(^1^￥3101感受態(tài)細(xì)胞，加入1以1^離，轉(zhuǎn)入0.2〇11電擊杯轉(zhuǎn)化（40(^， 2. 5KV，25y f)。加入1 mL含有1%甘露醇的LB培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)2小時(shí)（28°C，250rpm)。分 別取10 μ L、100 μ L涂LB平板(利福平50 μ g/mL，慶大霉素50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/mL)。
[0031] 3)挑取幾個(gè)克隆，堿法抽提農(nóng)桿菌質(zhì)粒，酶切鑒定，PCR檢測(cè)。
[0032] 實(shí)施例4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥 A擬南芥的培養(yǎng) 1)擬南芥種子在4°C進(jìn)行2 - 3天的春化處理，目的是有利于種子的一致萌發(fā)和花期 的提前。
[0033] 2)將蛭石、黑土、珍珠巖按9 :3 :0. 5的比例拌勻，經(jīng)高溫滅菌后裝于10cm的塑料 小盆，以營(yíng)養(yǎng)液PNS浸濕待用。
[0034] 3)以牙簽將擬南芥種子點(diǎn)播于濕潤(rùn)的基質(zhì)上，保鮮膜封口。放置于22°C暗培養(yǎng) 2 - 3天，待種子萌發(fā)后，揭開(kāi)保鮮膜，置于22°C培養(yǎng)室中進(jìn)行16小時(shí)光照培養(yǎng)。
[0035] 4)擬南芥抽苔后及抽苔后兩周以及轉(zhuǎn)化后需再以PNS營(yíng)養(yǎng)液浸濕一次。中途可視 情況適當(dāng)澆水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生長(zhǎng)，當(dāng)次生苔長(zhǎng)至2 - 10cm(少 數(shù)已經(jīng)開(kāi)花）可用于轉(zhuǎn)化(何玉科，鞏振輝，細(xì)跑生物學(xué)雜志，1991，13(3) :97-101 )。
[0036] B農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備 1)挑取農(nóng)桿菌單菌接種于5mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/mL) 中，28°C，250rpm 培養(yǎng) 20 小時(shí)（Rashid et al·，1996)。
[0037] 2)取lmL菌液轉(zhuǎn)接入20 - 30mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50μ g/mL，氯霉素100μ g/ mL)中，28°C，250rpm 培養(yǎng)約 12 小時(shí)，測(cè) 0D600 ?1· 5。
[0038] 3) 8000rpm，4°C，lOmin離心收集菌體，重懸于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化滲透液（5%鹿糖，0· 05% Silwet L-77)并稀釋至 0D600 ?0· 8。
[0039] C擬南芥蘸花法轉(zhuǎn)化 1)將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動(dòng)約3?5秒后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后，托盤(pán) 中加入PNS營(yíng)養(yǎng)液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤(rùn)環(huán)境，置于22°C培養(yǎng)室低光強(qiáng)度下生 長(zhǎng)24小時(shí)，即可正常培養(yǎng)。
[0040] 2)初次轉(zhuǎn)化四天后，可再進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化，重復(fù)兩次，總共轉(zhuǎn)化三次，這樣可以在花 發(fā)育的不同時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率。
[0041] 3)生長(zhǎng)約兩個(gè)月后，收集種子，4°C冰箱貯存待用。
[0042] 實(shí)施例5 擬南芥轉(zhuǎn)化植株種子的篩選 1)稱25 - 30mg種子放入1. 5mL離心管。
[0043] 2) lmL 75%乙醇消毒lmin (不停搖晃振蕩），8000rpm離心5秒，去上清。
[0044] 3)加入lmL過(guò)濾后的漂白粉消毒15min (不停搖晃振蕩，充分消毒），8000rpm離 心5秒，去上清。
[0045] 4)無(wú)菌水洗滌3 - 4次。
[0046] 5)將種子均勻的播撒到1/2MS平板（Hyg 50yg/mL)上，Parafilm膜封口，4°C冰 箱放置兩天，22°C，16小時(shí)光照培養(yǎng)6天。
[0047] 6)將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進(jìn)行GUS活性檢測(cè)，選出陽(yáng)性植株（ΤΙ) 繼續(xù)培養(yǎng)，并收集種子進(jìn)行Τ2代和Τ3代篩選。
[0048] 實(shí)施例6 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的檢測(cè) 按Jefferson (1978)的方法，將待測(cè)擬南芥葉片樣品與X-Gluc染色反應(yīng)液（50m mol/ L NaH2P04，pH7.0 ;0· 5m mol/L K4[Fe(CN)6]，0.1% Triton X-100,20% 甲醇，0.5mg/mL X-Gluc [X-glucuronide])于37°C保溫2 - 4小時(shí)后，用75%乙醇脫色觀察(見(jiàn)圖2)。
[0049] 實(shí)施例7 扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白ife/M爐基因轉(zhuǎn)化植物后的抗重金屬分析 將轉(zhuǎn)化植物自交純合3代，獲得純合轉(zhuǎn)化株，收取種子。播種后，在22°C生長(zhǎng)兩個(gè)星 期。然后比較了轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株的抗重金屬性。結(jié)果表 明，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在表型上有很大的差異。結(jié)果顯示在50〇μΜ濃度 的氯化鉻濃度培養(yǎng)基處理下野生型生長(zhǎng)明顯受抑制，根系不生長(zhǎng)，葉片稀少，而轉(zhuǎn)基因株系 抑制較小。結(jié)果說(shuō)明基因明顯提高了擬南芥的抗重金屬能力（圖3)。 附：本申請(qǐng)中所涉及到的核苷酸序列表： 〈11〇>南京博歐生物科技有限公司 〈120> -種來(lái)源于扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白基因及其抗重金屬應(yīng)用 <141> 2012-12-8 <160> 2 <210> SEQ ID No 1 <211> 234 <212> DNA 〈213> 扭脫甲基桿菌（mex-Methylobacterium extorquens) <220> 〈223> n =a 或 g 或 c 或 t 〈400> ORIGIN 1 ggatccatgg atcagtctcc aatcgaactt actatgagag ttgatggtat 51 gacttgtgaa ggttgtgctg aagctgtcag aagaaccatc agaagacttg 101 atccacaagc tgacgtctct gttgatgttg gtcttggcag agtctctgct 151 actactgttg ctcagtctct ggatgttgct caagctctga ctcaagctgg 201 ctatactgct actgctatga ctggctaaga gctc // 〈210〉 SEQ ID No 2 〈211〉 73 〈212〉 PRT 〈213> 扭脫甲基桿菌（mex-Methylobacterium extorquens) 〈400〉 ORIGIN 1 MDQSPIELTM RVDGMTCEGC AEAVRRTIRR LDPQADVSVD VGLGRVSATT 51 VAQSLDVAQA LTQAGYTATA MTG- //
【權(quán)利要求】
1. 一種來(lái)源于扭脫甲基桿菌的根據(jù)植物偏愛(ài)人工合成的重金屬結(jié)合蛋白基因，其特征 在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的來(lái)源于扭脫甲基桿菌的重金屬結(jié)合蛋白，其特征在于，其氨 基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3. 權(quán)利要求1或2所述的重金屬結(jié)合蛋白采用人工方法制備而成。
4. 權(quán)利要求1或2所述的重金屬結(jié)合蛋白采用農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。
5. 權(quán)利要求1或2所述的重金屬結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)基因植物在抗重金屬中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104099347SQ201310124783
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月11日
【發(fā)明者】薛永, 蔣小輝, 徐小赟, 侯曉光, 吳順霞, 侯曙光, 周惠, 伍光彩, 張揚(yáng) 申請(qǐng)人:南京博歐生物科技有限公司