專利名稱：一種食甲基菌mp688及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物菌株及其應(yīng)用，具體地說是一種食甲基菌菌株MP688及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone, PQQ)是一種較新近發(fā)現(xiàn)的輔酶和生物 必需營(yíng)養(yǎng)素，具有刺激某些微生物和動(dòng)植物生長(zhǎng)、，防治肝損傷、ι促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子生成、 調(diào)節(jié)體內(nèi)自由基水平和調(diào)節(jié)免疫等多種生理功能，可能用于阿爾茨海默氏癥、心血管疾病 和糖尿病等疾病的防治。通過選育新的PQQ高產(chǎn)菌種，確定其與PQQ合成相關(guān)的基因，對(duì)于 通過代謝工程手段進(jìn)一步提高PQQ產(chǎn)量，降低PQQ生產(chǎn)成本，推進(jìn)PQQ實(shí)際應(yīng)用具有重要意 義?；瘜W(xué)合成PQQ步驟多，產(chǎn)率低，異構(gòu)體和副產(chǎn)品的去除需要多步純化，要用到多種 有毒化學(xué)試劑因而污染嚴(yán)重(JACS，Vol 103，pp5599-2600，1981)。新的PQQ化學(xué)合成方 法需經(jīng)過11步反應(yīng)，5步純化才能得到純度在97%左右的PQQ(Davis Paul J, Karliner Joel S, Mousa Shaker A, et al. Pyrroloquinoline quinone drugs and methods ofuse thereof :US，No. US2008/0051428A1. 2008. 2. 28)。一般認(rèn)為生物學(xué)合成方法更有產(chǎn)業(yè)化意義。迄今為止，已知能夠合成PQQ的微生 物均為革蘭氏陰性菌，包括副球菌屬(Paracoccus)，精朊桿菌屬(ftOtaminobacter)、假單 胞菌屬(Pseudomonas),無色桿菌屬(Achromobacter),互生平胞菌屬(Alteromonas),桿菌 屬(Ancylobacter)，絲狀細(xì)菌屬(Hyphomicrobium)，甲烷單胞菌(Methanomonas)，甲基芽 孢桿菌屬(Methylobacillus)，甲基單胞菌(Methylomonas)，嗜甲基菌(Methylophilus)， 甲基桿菌(Methylobacterium)，微環(huán)菌屬(Microcyclus)，枝動(dòng)菌屬(Mycoplana)，原單胞 菌(Protomonas)，硫桿菌(Thiobacillus)以及茁平胞菌(Xanthobacter)。目前，也有采用 菌種發(fā)酵的方法生產(chǎn)PQQ，使用的原始菌種PQQ產(chǎn)量在0. 07 7mg/L，發(fā)酵時(shí)間為2-5天左 右(US I^at4994382和5344768)，因此產(chǎn)量低，成本高，難以實(shí)現(xiàn)PQQ的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，因而 需要更加高產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)的PQQ生產(chǎn)菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)吡咯喹啉醌的食甲基菌新菌株及其在生產(chǎn)吡咯喹 啉醌中的應(yīng)用。本發(fā)明的菌株MP688通過⑶H酶法從土壤中分離得到，食甲基菌(Methylovorus sp.)新菌株，已于2010年8月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路甲3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào) 為 CGMCC No. 4096。本發(fā)明還提供該菌株的篩選方法，包括如下步驟克隆大腸桿菌葡萄糖脫氫酶(⑶H)基因，并進(jìn)行原核表達(dá)，獲得純化后的⑶H蛋
3白。將采集土樣加適當(dāng)無菌水混懸后靜置，取上清加至富集培養(yǎng)基(每升含有硫酸 銨3g、磷酸二氫鉀1. 4g、磷酸氫二鈉3g、硫酸鎂0. 2g、檸檬酸鐵30mg、氯化鈣30mg、氯化錳 5mg、硫酸鋅5mg、硫酸銅0. 5mg，ImL維生素溶液，8mL甲醇，pH調(diào)至7. 0。維生素溶液生物 素 2mg、400mg 泛酸鈣、400mgVBl、400mgVB6、200mg 對(duì)氨基苯甲酸、2mg 葉酸、2g 肌醇、400mg 煙酸、200mg核黃素)，30°C厭氧培養(yǎng)5d，培養(yǎng)物離心取上清。取培養(yǎng)物的上清通過GDH重組酶法快速初篩，篩選出PQQ產(chǎn)量高的培養(yǎng)物。在分 離培養(yǎng)基平板上分離初篩培養(yǎng)物中的單菌落，再接種至含富集培養(yǎng)基的搖瓶，30°C振蕩培 養(yǎng)5d，再通過GDH酶法測(cè)定精確分析培養(yǎng)物中PQQ含量，篩選PQQ產(chǎn)量高的菌株。再重復(fù) 篩選兩輪，獲得了一株P(guān)QQ的高產(chǎn)菌株，命名為MP688。經(jīng)多次搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)分析，該菌PQQ 產(chǎn)量可達(dá)125mg/L。MP688菌株在MPQ平板上劃線30°C培養(yǎng)30h，觀察菌落形態(tài)，為小的邊緣整齊的濕 潤(rùn)圓形菌落，菌落隆起于固體培養(yǎng)基并與培養(yǎng)基結(jié)合緊密。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀 察，菌體呈紅色，為小的桿菌。MP688菌株使用電鏡放大24000 X倍觀察，菌體為短桿狀，頂端有鞭毛。根據(jù)已知的幾種食甲基菌的16S rDNA保守序列設(shè)計(jì)并合成引物，以MP688菌基因 組DNA為模板，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增該菌的部分16S rDNA序列。連接T載體并送測(cè)序，得到 的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比較，其與多種菌均具有一定同源性，選取與其同源性較高 者根據(jù)16S rDNA序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，其與食甲基菌的同源性最高。綜合形態(tài)特征與16S rDNA序列鑒定MP688為食甲基菌(Methylovorus sp.)新菌株。本發(fā)明還提供一種包含該菌株的菌劑。本發(fā)明還提供一種用該菌株生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，所述方法包括如下步驟將 MP688發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)弱堿性陰離子交換層析柱層析后洗脫，洗脫成分經(jīng)Cw反向?qū)游鲋?附后，用甲醇洗脫，洗脫液濃縮并使其自然結(jié)晶。本發(fā)明提供的食甲基菌菌株在常規(guī)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，PQQ產(chǎn)量可達(dá)125mg/L， 而且菌株生長(zhǎng)良好，產(chǎn)量穩(wěn)定，經(jīng)菌種選育和培養(yǎng)優(yōu)化有望進(jìn)一步提高產(chǎn)量，可以用于工業(yè) 化PQQ生產(chǎn)，對(duì)促進(jìn)PQQ的產(chǎn)業(yè)化有重要意義。


圖1為土壤樣品⑶H活性部分初篩結(jié)果。圖2為PQQ標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。圖 3 為 GDH 的 PCR產(chǎn)物電泳。其中 1 為 λ _EcoT14 I digest Maker ；2 為⑶H PCR產(chǎn)物。圖4為⑶H表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。其中1為蛋白的Marker ；1為 BL21-pET28a-gdh 總蛋白；2 為 BL21-pEI^8a_gdh 上清液；3 為 BL21 的總蛋白；4 為 BL21-pET28a 總蛋白。 圖5純化后⑶H蛋白的SDS-PAGE分析。圖 6 為 MP688 電鏡檢測(cè)(24000 X)。圖 7 為 MP68816S rDNA 基因的 PCR 擴(kuò)增。其中 1 為 DL 2000Marker ；2 為 PCR 產(chǎn)
4物。圖8為以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖9為PQQ產(chǎn)物柱層析圖譜。圖10為PQQ產(chǎn)物的針狀結(jié)晶(100X)。圖11為產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果。其中A為PQQ標(biāo)準(zhǔn)品；B為PQQ樣品。圖12為PQQ產(chǎn)物的吸收光譜。其中A為PQQ標(biāo)準(zhǔn)品；B為PQQ樣品。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例IPQQ產(chǎn)生菌篩選將從全國(guó)各地廣泛采集了約3000份土壤樣本，主要來源包括北京市內(nèi)及各區(qū)郊、 吉林通化、河北衡水、浙江杭州等地區(qū)。以滅菌的1. 5mL離心管采集土樣，每管土樣加入ImL 無菌水采集土樣加適當(dāng)無菌水混懸后靜置，取100 μ 1上清加至5ml富集培養(yǎng)基(每升含有 硫酸銨3g、磷酸二氫鉀1. 4g、磷酸氫二鈉3g、硫酸鎂0. 2g、檸檬酸鐵30mg、氯化鈣30mg、氯 化錳5mg、硫酸鋅5mg、硫酸銅0. 5mg, ImL維生素溶液，8mL甲醇，pH調(diào)至7. 0。維生素溶液 生物素^g、400mg泛酸鈣、400mgVB 1、400mgVB6、200mg對(duì)氨基苯甲酸、2mg葉酸、2g肌醇、 400mg煙酸、200mg核黃素)，30°C厭氧培養(yǎng)5d，培養(yǎng)物離心取上清，用PQQ的⑶H重組酶法 快速初篩，方法如下取20 μ L⑶H重組酶溶液加入96孔板中，再加180 μ L檢測(cè)反應(yīng)液(ρΗ6. 8磷酸鹽 緩沖溶液50mM，PMS lmmol/L,硫酸鎂2mM，葡萄糖10mM，DCIPlOOuM, PQQ標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 μ M或 者上清50μ L)開始反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)液的褪色時(shí)間可以快速估測(cè)樣品中PQQ的含量水平。圖1顯示了初篩的部分結(jié)果。富集培養(yǎng)基平板(富集培養(yǎng)基+1. 6%瓊脂粉)上分 離初篩培養(yǎng)物中的單菌落，再接種至含富集培養(yǎng)基的搖瓶，30°C振蕩培養(yǎng)5d，通過GDH酶法 測(cè)定精確分析培養(yǎng)物中PQQ含量。方法如下取ImL⑶H重組酶溶液加入比色杯中，再加入2mL檢測(cè)反應(yīng)液(同上)，通過測(cè)定 600nm處溶液吸光度的變化速率定量分析樣品中PQQ的含量。檢測(cè)時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照， 以不加PQQ的反應(yīng)液為空白對(duì)照。在相應(yīng)條件下，梯度稀釋PQQ標(biāo)準(zhǔn)品，制作PQQ標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖幻。根據(jù)測(cè)定樣品溶液吸光度的變化速率，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量分析樣品PQQ的含量。 經(jīng)過數(shù)輪初篩和復(fù)篩分離PQQ高產(chǎn)菌株。結(jié)果從3000余份土樣中分離得到一株高產(chǎn)菌，我 們命名為MP688，經(jīng)多次搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)分析，該菌PQQ產(chǎn)量可達(dá)125mg/L。其中，⑶H重組酶按如下方式制備根據(jù)E. coli的gdh基因序列設(shè)計(jì)引物PU P2，序列如SEQ IDNo. 1和2所示，在 5，端和3，端分別引入Nde I和Bam H I酶切位點(diǎn)。以E. coli DH5 α基因組為模板，通過 PCR擴(kuò)增得大小為2674bp的目的片段(圖3)。PCR條件為-MV 4min, 94°C 30s, 55°C 30s， 72°C 3min, 30個(gè)循環(huán)后于72°C繼續(xù)延伸5min，用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。產(chǎn) 物經(jīng)測(cè)序鑒定正確，經(jīng)回收并用Nde I和Bam H I酶切，與pET28a表達(dá)載體連接，連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，挑選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，再測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果表明 擴(kuò)增得到的序列與文獻(xiàn)報(bào)道的gdh基因序列完全一致，表明pET28a-GDH質(zhì)粒構(gòu)建成功。將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)，挑取陽(yáng)性克隆的單菌落接至5mL含卡那霉
5素的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，全部接入500mL含卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培 養(yǎng)至OD值為0.6左右，加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。于10°C 5000r/ min離心IOmin收集菌體。用20mmol/L pH7. 0的磷酸鹽緩沖溶液洗滌菌體2次，懸浮至20mL 同樣緩沖液，超聲破菌。破菌液經(jīng)離心，通過DEAE kpharose離子交換柱從上清液中純化 目的蛋白。層析柱經(jīng)平衡后以lmol/L的NaCl梯度洗脫并收集各洗脫峰組份。經(jīng)檢測(cè)具有 酶活的組分經(jīng)疏水柱脫鹽。SDS-PAGE檢測(cè)分析，表達(dá)產(chǎn)物及純化蛋白的分子量約為87kDa， 與文獻(xiàn)報(bào)道一致(圖4 5)。實(shí)施例2PQQ生產(chǎn)菌MP688的鑒定MP688菌株在MPQ平板上劃線30°C培養(yǎng)30h，觀察菌落形態(tài)，為小的邊緣整齊的濕 潤(rùn)圓形菌落，菌落隆起于固體培養(yǎng)基并與培養(yǎng)基結(jié)合緊密。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀 察，菌體呈紅色，為小的桿菌。MP688菌株使用電鏡放大Μ000Χ倍觀察，菌體為短桿狀， 頂端有鞭毛(圖6)。根據(jù)已知的幾種食甲基菌的16S rDNA保守序列設(shè)計(jì)并合成引物，以 MP688菌基因組DNA為模板，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增該菌的部分16S rDNA序列(圖7)。其引物 序列如SEQ ID No. 3和4所示。連接T載體并送測(cè)序，其序列如SEQ ID No. 5所示。得到 的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比較，與食甲基菌屬兩菌株的16SrDNA序列同源性達(dá)99% (圖 8)。實(shí)施例3PQQ的提取、純化和鑒定1.MP688 發(fā)酵培養(yǎng)將菌種按照5%的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基(每升含有酵母粉5g、蛋白胨5g、硫酸 銨3g、磷酸二氫鉀1. 4g、磷酸氫二鈉3g、硫酸鎂0. 2g、檸檬酸鐵30mg、氯化鈣30mg、氯化錳 5mg、硫酸鋅5mg、硫酸銅0. 5mg，ImL維生素溶液，8mL甲醇，pH調(diào)至7. 0。維生素溶液生物 素 ang、400mg 泛酸鈣、400mg VB1JOOmg VB6、200mg 對(duì)氨基苯甲酸、2mg 葉酸、2g 肌醇、400mg 煙酸、200mg核黃素)中，30°C振蕩培養(yǎng)5d。發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)按照10%接種，培養(yǎng)基濃度為正 常2倍。2. PQQ 的制備將MP688接種至富集培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)5d，培養(yǎng)物10 V 8000r/min離心 IOmin,上清液經(jīng)弱堿性陰離子交換層析柱AmberlystA21吸附，以20mmol/L的1Tris-HCl (pH 8.0)緩沖溶液平衡，再以lmol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫。收集的洗脫成分再以kppak Cw反 向?qū)游鲋?圖9)，以甲醇洗脫，洗脫液濃縮后使其自然結(jié)晶，結(jié)果濃縮液中長(zhǎng)出產(chǎn)物的 針狀晶體(圖10)。3. PQQ 的分析3.1產(chǎn)物的HPLC分析采用Waters Symmetry 300CW反向色譜柱，以水甲醇磷酸(80 20 0. 1) 為流動(dòng)相，流速lml/min，通過HPLC分離分析PQQ，采用梯度洗脫方法及254nm波長(zhǎng)檢測(cè)可 以得到較好的色譜分析結(jié)果(圖U)。結(jié)果表明，樣品譜峰的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品相同，說明 樣品為PQQ。3. 2產(chǎn)物的紫外吸收光譜以Sigma公司生產(chǎn)的PQQ作為對(duì)照，利用紫外_可見分光光度作200-400nm波長(zhǎng) 掃描可以得到PQQ產(chǎn)物的紫外吸收光譜圖(圖12)。
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結(jié)果表明，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的特征吸收峰幾乎完全一致。實(shí)施例4MP688菌劑的制備1、菌種活化使用富集培養(yǎng)基，將MP688接種于固體富集培養(yǎng)基斜面上，30°C培養(yǎng)3d。2、種子液的培養(yǎng)種子培養(yǎng)用富集培養(yǎng)基，活化好的MP688用無菌生理鹽水配制成109CFU/mL的菌 懸液，以5%的接種量接種于液體富集培養(yǎng)基中，30°C搖床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng) 時(shí)間為3d。3、發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵罐培養(yǎng)使用發(fā)酵培養(yǎng)基。把培養(yǎng)好的種子液以10%的接種量接入發(fā)酵罐中， 30°C，攪拌速度為200rpm，通氣量為1 0. 8-1. 0(發(fā)酵液體積每分鐘通氣量體積)、罐壓 1. 2-1. 8F/cm2。發(fā)酵 5d，菌量達(dá)至Ij 5-10 X lOtFU/mL，得至Ij MP688 菌株的菌劑。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.食甲基菌(Methylovorussp.)菌株 MP688，其保藏號(hào)為 CGMCCNo. 4096。
2.含有權(quán)利要求1所述菌株的菌劑。
3.權(quán)利要求1所述的菌株在生產(chǎn)吡咯喹啉醌中的應(yīng)用。
4.利用權(quán)利要求1所述菌株生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步驟將MP688發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng) 弱堿性陰離子交換層析柱層析后洗脫，洗脫成分經(jīng)Cw反向?qū)游鲋胶螅眉状枷疵?，?脫液濃縮并使其自然結(jié)晶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種食甲基菌(Methylovorus sp.)新菌株MP688，其保藏號(hào)為CGMCC No.4096，保藏日期為2010年8月20，保藏單位為中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。該菌株用PQQ的GDH重組酶法從土壤中分離得到。本發(fā)明提供的食甲基菌菌株在常規(guī)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，PQQ產(chǎn)量可達(dá)125mg/L，可以用于工業(yè)化PQQ生產(chǎn)，對(duì)促進(jìn)PQQ的產(chǎn)業(yè)化有重要意義。
文檔編號(hào)C12P17/18GK102061278SQ20101054851
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者周滿祥, 崔艷菊, 張惟材, 智靜娟, 李月, 李淼鑫, 杜寶華, 楊延新, 楊璐, 汪建華, 熊向華, 王歆, 申云飛, 董方, 魏琳, 魏紅玉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所, 山西康寶生物制品股份有限公司