本發(fā)明涉及蛋白質工程
技術領域：
，具體而言，涉及一種人重組組織因子及其基因、表達載體、宿主菌和表達方法。
背景技術：
：凝血酶原時間(PT)是外源性凝血系統常用篩選試驗之一，是指在缺乏血小板的血漿中加入過量的組織因子和Ca2+后，使凝血酶原轉變?yōu)槟?，后者使纖維蛋白原轉變?yōu)槔w維蛋白，血漿凝固所需要的時間即為PT。組織因子(TF)，是一種完整的膜糖蛋白。TF作為非酶類的蛋白輔助因子，可以與血液凝結因子FVIIa(blood-coagulationfactorVIIa)互作形成TF-FVIIa復合體啟動外源性凝血過程。人的TF蛋白是由263個氨基酸組成，包含三個結構域：胞外結構域(1-219)，跨膜結構域(220-242)和胞內結構域(243-263)。胞外結構域的功能主要是結合并激活FVIIa啟動外源凝血過程。TF與FVIIa的相互作用是鈣離子依賴的，而且TF-FVIIa復合體對FIX和FX的蛋白酶解過程是膜依賴的，跨膜結構域主要就是將TF蛋白錨定細胞膜上，對組織因子的生物活性非常重要，而胞內結構域主要起到信號轉導的作用。理論上TF蛋白的胞外結構域和跨膜結構域兩者就有了啟動外源性凝血過程的全部功能?，F有的技術表達的人組織因子存在生產工序復雜，活性低于正常糖基化的組織因子；而且異源表達系統存在密碼子偏好影響蛋白的表達；也同樣會影響蛋白的活性。技術實現要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種人重組組織因子，具有較高的生物活性。本發(fā)明的第二目的在于提供編碼上述的人重組組織因子的基因。本發(fā)明的第三目的在于提供含有上述基因的表達載體。本發(fā)明的第四目的在于提供含有上述基因的宿主菌。本發(fā)明的第五目的在于提供一種人重組組織因子的表達方法，可以快速高效的獲得具有較高生物活性的人重組組織因子。為了實現本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：一種人重組組織因子，該組織因子的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。編碼上述的人重組組織因子的基因。含有上述基因的表達載體。含有上述基因的宿主菌。一種人重組組織因子的表達方法，其包括：將上述的基因克隆到第一載體，獲得第一克隆載體；酶切第一克隆載體并轉化到宿主細胞，獲得表達菌株；培養(yǎng)表達菌株并用誘導劑誘導表達菌株表達組織因子。與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供人重組組織因子，具有較好的生物活性；通過表達載體連接表達人重組組織因子的目的基因在宿主菌種中表達，可以快速的、高效的獲得大量的組織因子，人重組組織因子的表達效率更高，活性也更高。提供的組織因子的表達方法，操作步驟簡單，操作簡便，反應條件溫和，方便簡潔；有利于大量的獲得人重組組織因子。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。圖1為本發(fā)明實施例3提供的pPIC9K載體示意圖；圖2為本發(fā)明實驗例2提供的標準曲線示意圖。具體實施方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產品。下面對本發(fā)明實施例的一種人重組組織因子及其基因、表達載體、宿主菌和表達方法進行具體說明。20世紀初期，Schmid與Moranitz首次發(fā)現了組織中血液凝固的啟動因子，并將其命名為組織因子(Tissuefactor，TF)。到20世紀80年代，組織因子被證實是生理性凝血過程中最重要的啟動因子。人們借助重組DNA、人工致突變及基因剔除等現代分子生物學技術，進一步在分子水平和基因水平研究TF，發(fā)現TF與全身炎癥反應綜合癥及休克、DIC、血栓性疾病、移植排斥反應、惡性腫瘤等的發(fā)生、發(fā)展有著密切關系，近年來又研究發(fā)現TF還具有參與愈傷組織修復、新生血管形成及胚胎發(fā)育等多種生理功能。因此，組織因子在生物制藥領域有著良好的應用發(fā)展前景。一種人重組組織因子，該組織因子的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。普通的人組織因子由263個氨基酸組成，包含三個結構域：胞外結構域(1-219)，跨膜結構域(220-242)和胞內結構域(243-263)。在普通的組織因子的C端融合一段由6個組氨酸組成的His-tag蛋白標簽，且去掉了組織因子的信號肽序列，得到本發(fā)明提供的組織因子。一般地，在蛋白質序列合成后，胞外蛋白會在信號肽的引導下發(fā)生轉運；然后，信號肽會被切除掉，實際發(fā)生作用的時候也是不包括信號肽序列的；所以，在表達蛋白的時候將信號肽去掉，是不會影響蛋白的功能的。同時在蛋白的C端添加一個由6個組氨酸組成的His-tag蛋白標簽，也不會對蛋白的空間結構和生物學功能產生影響，也不會影響蛋白的功能。編碼上述的人重組組織因子的基因。進一步地，上述基因的堿基序列如SEQIDNO.2所示。上述堿基序列是表達人重組組織因子原基因序列去掉信號肽序列的基礎上做的密碼子優(yōu)化。該基因序列是專門針對畢赤酵母表達系統對人組織因子的密碼子進行的優(yōu)化，得到的表達基因序列；并在序列的末端引入編碼6個組氨酸的核苷酸序列：CATCACCATCACCACCAC，然后再加上終止密碼子：TAA。在序列上引入編碼6個組氨酸的核苷酸序列：CATCACCATCACCACCAC；可以很方便的在蛋白表達完成后，對蛋白進行純化操作。組氨酸標簽(Histidine-tag)，基因工程構建的純化標記最通行的標記之一，是在蛋白質的氨基端加上His-tag標簽，在一般或者變性條件下可與多種金屬離子發(fā)生特殊的相互螯合作用，這些金屬離子包括Ca2+、Mg2+、Ni2+和Co2+等，其中尤其是以鎳離子使用最為廣泛，因為鎳離子和組氨酸標簽的結合效率最高。通常將菌體破壁后，將含有人重組組織因子的溶液通過Ni吸附柱，Ni吸附柱中的鎳離子將與目的蛋白上的His-tag蛋白標簽螯合，達到將目的蛋白分離出來的目的，然后用高濃度的咪唑溶液洗脫Ni吸附柱，就能將目的蛋白洗脫出來。由于做蛋白異源表達的時候，不同的表達系統，會存在密碼子的偏好性；具有多個密碼子的氨基酸，在翻譯的時候會使用一個單一的轉運rRNA；如果20種氨基酸中的一種或多種氨基酸的轉運rRNA使用過多，會影響蛋白的合成，可能導致蛋白合成的提前終止，使蛋白的氨基酸鏈不完整，導致蛋白質后續(xù)的加工和折疊等過程也被影響，進而影響蛋白的功能。另外甚至一些表達系統還存在一些很少使用的稀有密碼子，一旦在異源表達的序列中出現稀有密碼子，或者異源表達的序列中出現過多的稀有密碼子，這兩種情況都可能會導致蛋白表達失敗。所以需要對基因序列進行優(yōu)化。成功表達出目的蛋白后也還需要進一步的驗證蛋白的是否為具有相應的生物活性，因為有時候表達出蛋白會存在沒有生物活性的情況發(fā)生。另外，在序列的末尾加上終止密碼子，在表達的基因序列表達結束即用終止密碼子將序列終止，避免表達載體序列；如果表達出載體序列的氨基酸，引起蛋白的一級結構的改變，進而有可能導致蛋白的二結構、三級結構以及空間取向和活性位點被改變；或者是活性部位被遮蓋，導致功能的喪失。所以需要加上終止密碼，及時終止蛋白的表達。含有上述基因的載體。通過表達載體連接能表達上述蛋白的基因序列，可以通過異源表達的方法，大量表達目的蛋白；通過大量表達目的蛋白，然后可以大規(guī)模的應用。含有上述基因的宿主菌。一種人重組組織因子的表達方法，其包括：將上述的基因克隆到第一載體，獲得第一克隆載體；酶切第一克隆載體并轉化到宿主細胞，獲得表達菌株；培養(yǎng)表達菌株并用誘導劑誘導表達菌株表達組織因子。在表達組織因子的時候，用SalI限制性內切酶將第一克隆載體酶切線性化，然后將線性化的第一克隆載體通過電穿孔法轉化到酵母感受態(tài)細胞。利用真核生物中同源重組機制，通過同源臂重組，將表達序列整合到酵母染色體上，通過篩選獲得陽性表達菌株，方便進行組織因子的表達。進一步地，第一載體為pPIC9K載體。進一步地，上述基因位于pPIC9K載體EcoRI和NotI位點之間。進一步地，宿主細胞為酵母細胞。由已有的研究顯示組織因子的正常糖基化對組織因子的活性非常重要，所以此重組組織因子蛋白的活性與正常糖基化的組織因子仍然存在差距。采用大腸桿菌進行原核表達，導致大腸桿菌中表達的組織因子不能被糖基化，進而影響組織因子的功能；同時異源的膜蛋白在原核系統中表達常常存在表達量低和蛋白因不正確折疊而形成包涵體的問題，增加了表達和純化重組蛋白的難度。又因為酵母蛋白表達系統屬于真核蛋白系統，能夠一定程度上的規(guī)避這些問題，同時相比于哺乳細胞和昆蟲表達系統有著周期短、成本低、操作簡單的優(yōu)點。所以選用酵母表達系統進行組織因子的表達。同時，將組織因子針對酵母表達系統進行密碼子優(yōu)化，并且選用酵母表達系統能提高表達的組織因子的生物活性。進一步地，誘導劑為甲醇。在酵母表達的時候，在沒有外界刺激的情況下，蛋白的表達量會很低；但是，如果通過添加誘導劑，就能刺激宿主細胞快速、高效的表達出大量的目的蛋白。pPIC9K載體具有強有力的乙醇氧化酶(AlocholOxidase，AOX1)基因啟動子，可嚴格調控外源蛋白的表達；本發(fā)明中，誘導劑優(yōu)選為甲醇，使用甲醇大量誘導目的蛋白的表達。以下結合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述。實施例1本實施例提供一種人重組組織因子，該組織因子的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。該組織因子由269個氨基酸組成，包含三個結構域：胞外結構域(1-219)，跨膜結構域(220-242)和胞內結構域(243-263)；并在C端融合一段由6個組氨酸組成的His-tag蛋白標簽。該組織因子可以與血液凝結因子FVIIa互作形成TF-FVIIa復合體啟動外源性凝血過程。實施例2本實施例提供編碼人重組組織因子的基因，該基因的堿基序列如SEQIDNO.2所示。該序列是在NCBI核算數據庫中編碼人組織因子的原表達序列，通過生物信息學的方法針對畢赤酵母表達系統進行密碼子優(yōu)化；使優(yōu)化的基因序列能在畢赤酵母中高效的、穩(wěn)定的表達出人重組組織因子蛋白，且保持其生物活性。該堿基序列是表達組織因子原基因序列去掉信號肽序列的基礎上做的密碼子優(yōu)化，并在序列的末端引入編碼6個組氨酸的核苷酸序列：CATCACCATCACCACCAC，然后再加上終止密碼子：TAA。添加編碼6個組氨酸組成的His-tag蛋白標簽，方便后續(xù)的蛋白純化實驗，末尾添加終止密碼子，是和自然表達狀態(tài)一致，避免有多余的氨基酸存在影響蛋白的功能。實施例3本實施例提供含有實施例2所示的編碼人重組組織因子的基因序列的表達載體和宿主菌。本實施例中以pPIC9K載體作為表達載體，載體示意圖見圖1。經過對優(yōu)化的組織因子表的基因的序列以及結合pPIC9K載體序列的多克隆位點的分析，選用多克隆位點EcoRI和NotI位點作為組織因子的表達基因在載體上插入位點，構建成第一克隆載體pPIC9K-TF。pPIC9K-TF載體構建方法，具體過程如下：1.1以線性化pEASY-Blunt載體3μL和目的片段1μL混合于200μL的離心管中，快速離心后將混合反應液置在25℃條件下反應30min，然后冰浴；1.2取TOP10感受態(tài)細胞置于冰浴中，待感受態(tài)細胞融化后，取501μL的TOP10感受態(tài)細胞，并加入1.1中的連接產物反應液，移液器輕輕吹打混勻，冰浴30min；1.3在42℃件下熱激45s，迅速將離心管轉移冰浴2-3min；1.4向冰浴過的離心管中加入500μL無菌的不含抗生素的LB培養(yǎng)基，混勻后在37℃的搖床上150rpm震蕩培養(yǎng)45min；1.5去適量的轉化的TOP10感受態(tài)細胞，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基(Amp+)上，待培養(yǎng)基表面吹干后蓋上培養(yǎng)皿，37℃倒置培養(yǎng)8h；1.6待平板長出單菌落后，挑取單菌落并鑒定出陽性克隆，然后擴大培養(yǎng)陽性克隆；1.7提取陽性克隆的質粒；1.8用EcoRI和NotI雙酶切提取的陽性克隆質粒和pPIC9K載體質粒，并回收純化酶切片段；1.9加2μL回收的pPIC9K載體片段，6μL目的基因片段，T4連接酶1μL，T4連接酶buffer2μL，用ddH2O補足到15μL，16℃連接過夜，得到pPIC9K-TF載體質粒；1.10將連接產物轉化TOP10感受態(tài)細胞，并涂布于LB固體培養(yǎng)基(Kan+)上，37℃倒置培養(yǎng)8h，重復1.6和1.7的操作；1.11用限制性內切酶SalI酶切1.10提取的pPIC9K-TF載體質粒，并通過1％的瓊脂糖凝膠電泳回收純化線性化的pPIC9K-TF載體片段；1.12將線性化的pPIC9K-TF載體片段用無菌超純水溶解后通過電穿孔法轉化GS115酵母感受態(tài)細胞；1.13通過MD平板篩選出陽性克隆后，選取10個克隆利用PCR進行進一步陽性驗證，將確認陽性的酵母接入液體培養(yǎng)基并利用甲醇進行蛋白誘導表達。當然本實施例提供的是pPIC9K-TF載體構建的一種方法，依然還有其他的構建方法可以得到pPIC9K-TF表達載體。實驗例1本實驗例提供對實施例3提供的載體和宿主菌表達的人重組組織因子的純度的分析。人重組組織因子的純度分析，具體方法如下：1.1將確認陽性的酵母接入液體培養(yǎng)基并利用甲醇進行蛋白誘導表達；1.2表達后菌液經過離心后取上清，并對上清液進行Dot-Blot(Anti-His抗體)進行蛋白表達驗證，驗證蛋白表達量較高的3株菌株進一步通過SDS-PAG蛋白凝膠電泳和Western-Blot進行進一步確認，并鑒定出蛋白表達量最高的菌株；1.3將表達最為明顯的菌株接種到BMGY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，重新接種到BMMY液體培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)，每隔24小時補加5％的甲醇；1.4在72小時后收集上清培養(yǎng)液，72小時的發(fā)酵液經過濃縮后利用融合蛋白的His-tag蛋白標簽進行純化；1.5純化后的蛋白放入透析袋中，使用PBS(PH＝7.4)透析過夜去除純化蛋白殘留的鹽離子；1.6表達后的人重組組織因子蛋白通過BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度，并通過SDS-PAGE蛋白凝膠電泳檢測純度。通過以上步驟鑒定，監(jiān)測結果顯示純化的人重組組織因子蛋白純度在95％以上。實驗例2本實驗例提供對對實施例3提供的載體和宿主菌表達的人重組組織因子的生物活性的測定。人重組組織因子的生物活性的測定的具體方法如下：1.1人凝血酶原復合物溶液的制備：取0.1mol/LTris-HCl緩沖液10ml(含0.012mol/LCaCl2，PH＝7.4)，加入凍干人凝血酶原復合物10U，人凝血酶原復合物溶液的濃度為1U/ml；1.2將標準組織凝血活酶原液定義稀釋105倍為1U，稀釋104為10U，并以此類推；1.3向酶標板中每個酶標孔加入不同稀釋度組織凝血活酶100μL，然后加入100μl的人凝血酶原復合物溶液(1U/ml)及100μlS2222(2.0mg/ml)，37℃孵育30min,用酶標儀(405nm)測定吸光度；1.4將我們表達純化的人重組組織因子原液進行發(fā)色底物法實驗測得吸光度mA405＝2786。表1發(fā)色底物發(fā)測定組織因子活性數據PCA(U)稀釋倍數lgPCAmA405(標準TF)105051983104104749103102324810210328910104131實驗結果如表1和圖2所示，不同稀釋倍數的凝血活酶和吸光度的對數成線性關系，得到凝血活酶和吸光度的標準曲線公式y＝10.972e1.0447x；將所得的標準曲線公式求出表達的人重組組織因子的活性PCA＝199526U，因可以看出，實施例2表達的人重組組織因子有很高的活性。以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。SEQUENCELISTING<110>青島古高生物技術有限公司<120>一種人重組組織因子及其基因、表達載體、宿主菌和表達方法<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>269<212>PRT<213>Homosapiens<400>1SerGlyThrThrAsnThrValAlaAlaTyrAsnLeuThrTrpLysSer151015ThrAsnPheLysThrIleLeuGluTrpGluProLysProValAsnGln202530ValTyrThrValGlnIleSerThrLysSerGlyAspTrpLysSerLys354045CysPheTyrThrThrAspThrGluCysAspLeuThrAspGluIleVal505560LysAspValLysGlnThrTyrLeuAlaArgValPheSerTyrProAla65707580GlyAsnValGluSerThrGlySerAlaGlyGluProLeuTyrGluAsn859095SerProGluPheThrProTyrLeuGluThrAsnLeuGlyGlnProThr100105110IleGlnSerPheGluGlnValGlyThrLysValAsnValThrValGlu115120125AspGluArgThrLeuValArgArgAsnAsnThrPheLeuSerLeuArg130135140AspValPheGlyLysAspLeuIleTyrThrLeuTyrTyrTrpLysSer145150155160SerSerSerGlyLysLysThrAlaLysThrAsnThrAsnGluPheLeu165170175IleAspValAspLysGlyGluAsnTyrCysPheSerValGlnAlaVal180185190IleProSerArgThrValAsnArgLysSerThrAspSerProValGlu195200205CysMetGlyGlnGluLysGlyGluPheArgGluIlePheTyrIleIle210215220GlyAlaValValPheValValIleIleLeuValIleIleLeuAlaIle225230235240SerLeuHisLysCysArgLysAlaGlyValGlyGlnSerTrpLysGlu245250255AsnSerProLeuAsnValSerHisHisHisHisHisHis260265<210>2<211>810<212>DNA<213>Homosapiens<400>2tccggtactaccaacactgttgctgcctacaacttgacttggaagtccaccaacttcaag60accatcttggaatgggagccaaagccagttaaccaggtttacactgttcagatctccacc120aagtctggtgactggaagtctaagtgtttctacactaccgacaccgagtgtgacttgact180gacgaaatcgttaaggacgtcaagcagacctacttggccagagttttttcttaccctgcc240ggtaacgttgagtctactggttctgctggtgaaccactgtacgaaaactctccagagttc300accccatacttggagactaacttgggtcagccaactatccaatccttcgagcaggttggt360actaaggttaacgttactgtcgaggacgagagaaccctggtcagaagaaacaacaccttc420ttgtccctgagggacgttttcggtaaggacttgatctacaccctgtactactggaaatcc480agctcctccggtaaaaagactgctaagactaacaccaacgagttcttgatcgacgtggac540aagggtgagaactactgtttctccgttcaggctgttatcccatccagaaccgttaacaga600aagtccactgactccccagttgagtgtatgggtcaagaaaagggtgagttcagagagatc660ttctacatcatcggtgccgtcgttttcgtcgtcatcatcttggttattatcctggccatc720tccttgcacaagtgcagaaaagctggtgttggtcagtcctggaaagagaactctccattg780aacgtttctcatcaccatcaccaccactaa810當前第1頁1 2 3