本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及梨轉(zhuǎn)錄因子pymyb114及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用，具體涉及從‘八月紅’梨中分離、克隆得到一個(gè)梨果皮色澤調(diào)控相關(guān)的r2r3myb基因家族成員pymyb114基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：花青苷是在高等植物中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，它使鮮花和水果呈現(xiàn)出鮮艷的顏色。在花中，這些色素能夠吸引傳粉者；在水果中，它們吸引動(dòng)物來幫助廣泛的傳播傳播種子(reganetal.,2001；schaeferetal.,2004)?；ㄇ嘬諏?duì)植物抗病性也起著重要的作用，比如在抵御紫外線，抗氧化活性方面的作用(biezaetal.,2001；veeriahetal.,2006)，還有各種有益健康的方面的作用，比如提供神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)和心血管疾病、癌癥和糖尿病等方面(konczaketal.,2004；butellietal.,2008)。花青苷的生物合成通路是由關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的控制在很多植物中已經(jīng)被充分研究(jaakolaetal.,2013)。這是由許多酶催化步驟組成的一系列催化反應(yīng)構(gòu)成的類黃酮生物合成代謝通路，包括的主要關(guān)鍵催化酶有苯丙氨酸解氨酶(pal)、查耳酮合酶(chs)、查耳酮異構(gòu)酶(chi)和黃烷酮3-羥化酶(f3h)，以及在生成花青苷過程中發(fā)生的系列反應(yīng)，包括二氫黃酮醇4-還原酶(dfr)，花青苷合成酶(ans)和udp-glucose:黃酮類3-o-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ufgt)(takosetal.,2006)。此外，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)進(jìn)而引起花青苷的生物合成方面的研究也有相關(guān)的報(bào)道(zhangetal.,2003；rowanetal.,2009)。在園藝作物中，果實(shí)中花青苷積累的分子機(jī)制也得到廣泛的研究。r2r3-myb轉(zhuǎn)錄因子在花青苷生物合成過程中具有重要的調(diào)控作用。例如蘋果(malus×domestica)，mdmyb10和mdmyb110a分別從紅色果肉蘋果‘redfield’和‘sangrado’中被克隆，它們被證明分別正向調(diào)控類型i/ii蘋果果皮的色澤(espleyetal.,2007；chagnéetal.,2013)。還有兩個(gè)蘋果中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，mdmyb1和mdmyba，是蘋果中受光誘導(dǎo)促進(jìn)花青苷生物合成的至關(guān)重要的調(diào)控因子(takosetal.,2006；banetal.,2007；lietal.,2012)。草莓(fragaria×ananassa)famyb10已經(jīng)被證明是正向調(diào)節(jié)花青苷生物合成(medina-pucheetal.,2014)。然而，關(guān)于對(duì)花青苷代謝通路的轉(zhuǎn)錄抑制也有報(bào)道。這些研究包括草莓famyb1(fragaria×ananassa)和fcmyb1(fragariachiloensis)，矮牽牛phmyb27，葡萄vvmybc2-l1和medicagotruncatulamtmyb2(aharonietal.,2001；salvatierraetal.,2013；albertetal.,2014；huangetal.,2014；junetal.,2015)。超表達(dá)的famyb1導(dǎo)致煙草(nicotianatabacum)花青苷合成的抑制，抑制fcmyb1是通過瞬時(shí)rna干擾草莓果實(shí)促進(jìn)花青苷的生物合成的增加。同樣的，rna干擾抑制phmyb27能增加矮牽牛的花和營(yíng)養(yǎng)組織中花青苷的積累(albertetal.,2014)。擬南芥atmybl2(matsuietal.,2008)的同源基因vvmybc2-l1會(huì)抑制原花青苷的(pa)積累和下調(diào)pa相關(guān)基因的表達(dá)通過在葡萄果實(shí)的數(shù)量性狀定位和轉(zhuǎn)錄阻遏mtmyb2調(diào)控花青苷和原花青苷積累通過mbw復(fù)合體(myb14/myb5-tt8-wd40-1)的激活劑的介導(dǎo)作用在medicagotruncatula。因此，花青苷生物合成受轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控(nesietal.,2001；hichrietal.,2011；cavallinietal.,2015)?？刂萍t皮梨著色的關(guān)鍵基因已經(jīng)被研究。在歐洲梨的研究中，dondinietal.(2008)報(bào)道，‘maxredbartlett’紅色性狀定位到連鎖群4(lg4)，而不是蘋果和梨的myb10基因位于的lg9。隨后，pierantonietal.(2010)報(bào)道，雖然圖譜定位到的pymyb10與蘋果的mdmyb10高度同源，并且mdmyb10控制蘋果果皮的色澤，但是在‘maxredbartlett’和‘williams’梨品種中，它不是直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控紅皮和黃色果皮性狀的基因，定位梨基因組的不同的區(qū)域。wuetal.(2013b)也報(bào)道，西洋梨‘早紅考密斯’及其它的綠色芽變的紅/綠果皮色澤的突變體，鑒定出mads轉(zhuǎn)錄因子可能參與了梨果皮中花青苷合成?；ㄇ嘬丈锖铣苫騧yb10和bhlh的表達(dá)和wd40并沒有表現(xiàn)出相關(guān)性，提出在梨中調(diào)控花青苷生物合成的一種更復(fù)雜的機(jī)制(yangetal.,2014)。然而，myb10也有報(bào)道調(diào)控花青苷生物合成在一些梨品種中(fengetal.,2010；zhangetal.,2011；yuetal.,2012)。myb10啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平‘maxredbartlett’的綠色芽變的形成有關(guān)(wangetal.,2013)。揭示紅皮梨著色的分子機(jī)制仍然需要研究。梨主要分為亞洲梨和歐洲梨兩種類型。紅皮亞洲梨因著色不穩(wěn)定而造成有很少的品質(zhì)佳的品種。相比較而言，歐洲梨具有較多的紅皮梨品種。通常來說，亞洲梨著色在接近成熟期(yangetal,2014)；而歐洲梨著色在果實(shí)發(fā)育前期并持續(xù)到果實(shí)成熟期。這意味著有不同的分子機(jī)制負(fù)責(zé)兩種紅皮梨類型。qtl定位在很多作物中被廣泛的和成功的運(yùn)用。例如，matsudaetal.(2012)用主效qtl解析水稻基因型和表型關(guān)聯(lián)的水稻粒重。ilketal.(2015)報(bào)道在高光照和低溫脅迫下花青苷積累的自然變異是由于hua2位點(diǎn)與擬南芥pap1和pap2相關(guān)聯(lián)。在蘋果果實(shí)中，一個(gè)多酚化合物的主效qtl定位在lg16(khanetal.,2012)。zorrilla-fontanesietal.(2011)和azumaetal.(2015)分別報(bào)道控制八倍體草莓(fragaria×ananassa)和葡萄中重要的農(nóng)藝性狀和果實(shí)品質(zhì)性狀的qtl位點(diǎn)及潛在的候選基因。隨著最近‘碭山酥梨’全基因組序列成功組裝并錨定在的17條染色體上(wuetal.,2103)，利用與ssr整合的snps構(gòu)建了高密度遺傳連鎖圖譜，用于精細(xì)定位qtl(wuetal.,2014)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)梨果花青苷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子pymyb114基因。本發(fā)明的另一目的是提供該基因的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種分離自‘八月紅’具有促進(jìn)梨果花青苷生物合成功能的轉(zhuǎn)錄因子pymyb114基因，屬于r2r3myb家族成員，其核苷酸序列為seqidno.1所示，包含687bp的開放閱讀框；編碼228個(gè)氨基酸，其編碼的氨基酸序列為序列表seqidno.2所示，等電點(diǎn)為8.93，分子量為26.54kda。含有本發(fā)明所述pymyb114基因的重組表達(dá)載體。所述的重組表達(dá)載體，優(yōu)選以psak277為出發(fā)載體，所述psak277基因的插入位點(diǎn)為ecori和xholi之間。含有本發(fā)明所述pymyb114基因的宿主菌?？寺”景l(fā)明所述pymyb114基因cdna序列的引物對(duì)，上游引物pymyb114-f1序列如seqidno.7所示，下游引物pymyb114-r1序列如seqidno.8所示。本發(fā)明所述pymyb114基因在促進(jìn)梨果花青苷生物合成中的應(yīng)用。所述的pymyb114基因聯(lián)合輔助因子pybhlh3基因在促進(jìn)梨果皮花青苷生物合成中的應(yīng)用；其中所述的輔助因子pybhlh3基因核苷酸序列如seqidno.3所示，氨基酸序列如seqidno.4所示。本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體在促進(jìn)梨果花青苷生物合成中的應(yīng)用。所述的重組表達(dá)載體聯(lián)合含輔助因子pybhlh3基因的重組表達(dá)載體在促進(jìn)梨果皮花青苷生物合成中的應(yīng)用。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：1.pymyb114基因的發(fā)現(xiàn)，為促進(jìn)梨果花青苷生物合成的分子育種提供新的基因資源，為實(shí)施綠色農(nóng)業(yè)提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發(fā)利用有利于降低農(nóng)業(yè)成本和實(shí)現(xiàn)環(huán)境友好。2.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法將轉(zhuǎn)錄因子瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草，草莓和梨果實(shí)，有效的促進(jìn)花青苷的合成，經(jīng)生物學(xué)功能驗(yàn)證，表明本發(fā)明克隆的pymyb114基因具有促進(jìn)梨果皮花青苷生物合成的功能。附圖說明圖1為紅/綠皮梨品種花色苷含量及與花青苷相關(guān)的基因的表達(dá)水平分析。其中：a，c，e，g表明在幼果期不同紅皮/綠皮梨品種中花色苷含量和轉(zhuǎn)錄因子pymyb114,pybhlh3和pymyb10的表達(dá)模式。b、d、f、h表明在接近成熟期不同紅皮/綠皮梨品種中花色苷含量和轉(zhuǎn)錄因子pymyb114,pybhlh3和pymyb10的表達(dá)模式。圖2為瞬時(shí)pymyb114和其它的轉(zhuǎn)錄因子共轉(zhuǎn)化煙草促進(jìn)花青苷生物合成。其中：a.瞬時(shí)轉(zhuǎn)化7天后煙草葉片的花青苷積累的表型圖。a：psak277(空載作為陰性對(duì)照)；b.pymyb114+pymyb10,c.pymyb10+pybhlh3；d.pymyb114+pybhlh3；b.通過色差儀測(cè)量煙草葉片花青苷著色區(qū)域的色素積累，a*/b*的比值從負(fù)值轉(zhuǎn)為正值表示草莓的顏色由綠色變?yōu)榧t色。誤差線是測(cè)量6個(gè)著色區(qū)域比值的平均值。c.測(cè)定總花色苷的含量利用分光光度計(jì)。大寫表示差異顯著性水平p<0.01，小寫表示差異顯著性水平p<0.05。圖3為pymyb114和其它的轉(zhuǎn)錄因子瞬時(shí)共轉(zhuǎn)化草莓促進(jìn)花青苷生物合成。其中：a.通過注射轉(zhuǎn)化的yw5af7的草莓果實(shí)的著色的表型圖。a和b.psak277及縱切面；c和d.pymyb10及縱切面；e和f.pymyb114及縱切面；g和h.pymyb114+pymyb10及縱切面；i和j.pymyb10+pybhlh3及縱切面；k和l.pymyb114+pybhlh3及縱切面。b.通過色差儀在草莓果實(shí)的著色區(qū)域檢測(cè)色素的變化，a*/b*的比值從負(fù)值轉(zhuǎn)為正值表示煙草葉片的顏色由綠色變?yōu)榧t色。誤差線是測(cè)量6個(gè)著色區(qū)域比值的平均值。c.對(duì)草莓果實(shí)總花色苷含量的測(cè)定。d.uplc對(duì)草莓果實(shí)花色苷組分和含量。矢車菊3-阿拉伯糖苷，芍藥素3-半乳糖苷。大寫字母表明差異顯著性水平p<0.01，小寫字母表明差異顯著性水平p<0.05。圖4為pymyb114和pybhlh3轉(zhuǎn)化梨對(duì)果皮花青苷生物合成的影響。其中：a.是瞬時(shí)轉(zhuǎn)化梨果實(shí)花青苷著色的表型圖。i：psak277(空載作為陰性對(duì)照)，ii.pymyb114+pybhlh3。b.瞬時(shí)轉(zhuǎn)化梨果皮著色位置通過uplc測(cè)定色素含量。c和d.花青苷生物合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量分析。e.rna干擾抑制梨果皮花青苷的生物合成的表型圖。f和g.rna抑制花青苷含量及組分的測(cè)定。h.采用rt-qpcr分析梨果皮中花色苷相關(guān)基因的表達(dá)水平。圖5雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)pymyb114，pybhlh3共轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體激活花青苷代謝通路啟動(dòng)子的活性。圖6轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之間相互作用的酵母雙雜交試驗(yàn)驗(yàn)證。其中：a.i-v分別代表基因pymyb114c-端，或者n-端的氨基酸殘基的長(zhǎng)度。b.通過酵母雙雜交體外驗(yàn)證基因pymyb114的自激活區(qū)域以及pymyb114和pybhlh3之間相互作用的位點(diǎn)。c.通過酵母雙雜交體外驗(yàn)證基因pymyb114的自激活區(qū)域以及pymyb114和pymyb10之間相互作用的位點(diǎn)。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出詳細(xì)的描述。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實(shí)施例1pymyb114的表達(dá)與紅皮梨的花青苷的含量的相關(guān)性分析梨果實(shí)有兩種類型的著色模式，花青苷著色在果實(shí)發(fā)育早期或者接近成熟期。發(fā)明人基于qtl定位鑒定出與紅皮梨相關(guān)的候選基因pymyb114。在本發(fā)明中，我們篩選幾個(gè)紅/綠皮的梨品種果實(shí)在發(fā)育早期和接近成熟期來評(píng)價(jià)花青苷含量和基因的表達(dá)模式，候選基因pymyb114，它的輔助因子pybhlh3。rt-qpcr分析所用pymyb114特異性正向引物序列是：5’-gccacatccgtcataagacctc-3’(seqidno.9)；反向引物序列是：5’-gccactcatgtgtaacccttc-3’(seqidno.10)；輔助因子pybhlh3特異性正向引物序列是：5’-ttgtggagggaagtggcggt-3’(seqidno.13)；反向引物序列是：5’-agctccctaagtgtttgcatcac-3’(seqidno.14)；pymyb10特異性正向引物序列是：5’-gaccaatgtgataagacctcagcc-3’(seqidno.17)；反向引物序列是：5’-ccgttctttgttgacgacgac-3’(seqidno.18)；在整個(gè)發(fā)育過程中，在不同的梨品種，紅皮梨的花青苷含量都明顯高于綠皮梨。其中，三個(gè)西洋梨品種表現(xiàn)出花青苷含量最高在果實(shí)發(fā)育的早期(圖1)。在接近成熟期，6個(gè)亞洲梨紅皮梨呈現(xiàn)顯著的花青苷含量比其他梨品種(圖3)。相關(guān)分析表明，花青苷含量與pymyb114表達(dá)呈顯著正相關(guān)(果實(shí)發(fā)育早期的相關(guān)系數(shù)0.777**，果實(shí)發(fā)育后期的相關(guān)系數(shù)0.825**)。與此同時(shí)，pymyb114和pybhlh3的表達(dá)水平顯著相關(guān)在果實(shí)發(fā)育早期和接近成熟期(相關(guān)系數(shù)分別是0.524*和0.539*)(圖1；表1)。另外，我們又分析花青苷相關(guān)基因pymyb10(fengetal.，2010)。pymyb10與花青苷呈正相關(guān)(0.56*為果實(shí)發(fā)育早期，0.501*為果實(shí)發(fā)育成熟階段)。pymyb114的表達(dá)與pymyb10的表達(dá)顯著相關(guān)；果實(shí)發(fā)育早期相關(guān)系數(shù)為0.867**，果實(shí)發(fā)育接近成熟期為0.578*(圖1；表1)。因此，pymyb10和pymyb114都可能有助于調(diào)節(jié)花青苷的生物合成。表1紅皮/綠皮梨的花青苷含量與轉(zhuǎn)錄因子之間的相關(guān)性分析實(shí)施例2pymyb114和輔助因子pybhlh3基因克隆及重組載體構(gòu)建從‘八月紅’梨果皮中提取rna，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cdna用于擴(kuò)增pymyb114基因全長(zhǎng)。rna提取使用planttotalrnaisolationkitplus(foregene，re-05022)，按照該試劑盒提供的操作說明書操作。第一鏈cdna的合成用firstscriptstrandcdnasynthesissupermix(transgene，ae301-02)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(按照該試劑盒提供的說明書操作)。擴(kuò)增基因pymyb114引物序列pymyb114-f1：5’-actagtggatccaaagaattcatgaggaagggtgcctgg-3’(seqidno.7)；pymyb114-r1:5’-caggactctagaagtactctcgagctaaatcttagttatctcttcttctagattcca-3’(seqidno.8)。此外，pymyb10克隆的模板是‘八月紅’梨，引物序列pymyb10-f1:5’-cgcggtggcggccgcggatccatggagggatataacgttaacttg-3’(seqidno.15),pymyb10-r1:5’-gggccccccctcgagaagcttctattcttcttttgaatgattccaa-3’(seqidno.16)；。超保真dna聚合酶super-fidelitydnapolymerase(p505-d1)購(gòu)自諾唯贊生物科技公司。擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50μl中包括200ngcdna，2×phantamaxbuffer25μl，10mmdntp1μl，phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase(1u/μl)1μl，10μm2μl上述引物，加ddh2o至50μl。pcr反應(yīng)在eppendorf擴(kuò)增儀上按以下程序完成：95℃，預(yù)變性3分鐘，95℃變性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸40秒,35個(gè)熱循環(huán)，72℃延伸5分鐘，4℃保存。每個(gè)基因都只產(chǎn)生一條單一pcr條帶產(chǎn)物。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用axygen小量膠回收試劑盒(購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)杭州有限公司，中國(guó))回收dna片段，步驟參照使用說明?；厥占兓膁na溶液與psak277載體進(jìn)行連接反應(yīng)，重組酶iionestepcloningkit(貨號(hào)：c112-01)購(gòu)自諾唯贊生物科技公司，并按說明書步驟操作。連接反應(yīng)體系總體積是10μl，其中包括2μl的5×ceiibuffer，50～200ng線性化克隆載體，50～200ng插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物，1μlii。37℃連接30min。待反應(yīng)完成后，立即將反應(yīng)罐置于冰水浴中冷卻5min，反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化采用熱擊法(參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版，科學(xué)出版社，2002)轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，在含有50mg/l壯觀霉素的lb固體平板中篩選陽性克隆，挑取5個(gè)陽性克隆測(cè)序(由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成)。測(cè)序結(jié)果表明，pymyb114基因全長(zhǎng)為687bp，其核苷酸序列為seqidno.1所示，blast的結(jié)果分析證明從梨中新得到的基因?yàn)橐粋€(gè)myb基因家族成員，申請(qǐng)人將這個(gè)基因命名為pymyb114。重組載體命名為psak277-pymyb114。pymyb10基因全長(zhǎng)為735bp，其核苷酸序列為seqidno.5所示，重組載體命名為psak277-pymyb10。輔助因子pybhlh3的克隆的模板是‘八月紅’梨，所用的正向引物序列是：5‘-actagtggatccaaagaattcatggctgcaccgccgccaag-3’(seqidno.11)；反向引物序列是:5’-caggactctagaagtactctcgagttaagagtcagattggggtataatttgatttatc(seqidno.12)。pcr擴(kuò)增所用的超保真dna聚合酶super-fidelitydnapolymerase(p505-d1)購(gòu)自諾唯贊生物科技公司。擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50μl中包括200ngcdna，2×phantamaxbuffer25μl，10mmdntp1μl，phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase(1u/μl)1μl，10μm2μl上述引物，加ddh2o至50μl。pcr反應(yīng)在eppendorf擴(kuò)增儀上按以下程序完成：95℃，預(yù)變性3分鐘，95℃變性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸2min,35個(gè)熱循環(huán)，72℃延伸5分鐘，4℃保存。產(chǎn)生一條單一pcr條帶產(chǎn)物。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用axygen小量膠回收試劑盒(購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)杭州有限公司，中國(guó))回收dna片段，步驟參照使用說明?；厥占兓膁na溶液與psak277載體進(jìn)行連接反應(yīng)，重組酶iionestepcloningkit(貨號(hào)：c112-01)購(gòu)自諾唯贊生物科技公司，并按說明書步驟操作。連接反應(yīng)體系總體積是10μl，其中包括2μl的5×ceiibuffer，50～200ng線性化克隆載體，50～200ng插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物，1μlii。37℃連接30min。待反應(yīng)完成后，立即將反應(yīng)罐置于冰水浴中冷卻5min，反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化采用熱擊法(參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版，科學(xué)出版社，2002)轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，在含有50mg/l壯觀霉素的lb固體平板中篩選陽性克隆，挑取5個(gè)陽性克隆測(cè)序(由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成)。測(cè)序結(jié)果表明，pybhlh3基因全長(zhǎng)為2130bp，其核苷酸序列為seqidno.3所示，重組載體命名為psak277-pybhlh3。應(yīng)用凍融法將重組載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌gv3101中。實(shí)施例4pymyb114與它的共作用因子pybhlh3共轉(zhuǎn)化導(dǎo)致煙草花青苷合成瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片試驗(yàn)是為了驗(yàn)證候選超表達(dá)基因的功能。結(jié)果表明，單獨(dú)轉(zhuǎn)化pymyb114或者pybhlh3并不能觀察到花青苷含量的積累，而需要共同轉(zhuǎn)化pymyb114和pybhlh3才能觀察到花青苷在煙草葉片的積累。此外，pymyb114與pymyb10共轉(zhuǎn)化也能有微弱的色素沉積(圖2a)。花青苷積累的煙草葉片通過色差儀和分光光度計(jì)檢測(cè)色素含量(圖2b和2c)，結(jié)果與表型圖一致。因此，pymyb114和輔助轉(zhuǎn)錄因子pybhlh3可以促進(jìn)煙草葉片花青苷生物合成；pymyb114和pymyb10也能促進(jìn)花青苷的生物合成。實(shí)施例5pymyb114與它的共作用因子pybhlh3異源表達(dá)導(dǎo)致草莓花青苷合成瞬時(shí)轉(zhuǎn)化黃色草莓‘yellowwonder’5af7(yw5af7)果實(shí)(花后2周)。結(jié)果表明，共轉(zhuǎn)化pymyb114和pybhlh3能觀察到少量花青苷的積累?？蛰dpsak277轉(zhuǎn)化后沒有觀察到色素積累，單獨(dú)轉(zhuǎn)化pymyb114或者pybhlh3或者pymyb10也沒有色素積累。有趣的是，共轉(zhuǎn)化pymyb114和pymyb10也能促進(jìn)草莓花托中花青苷的生物合成(圖3a)。進(jìn)一步用色差儀，分光光度計(jì)和uplc測(cè)定花青苷的含量,結(jié)果與表型圖一致(圖3b,c)。此外，uplc進(jìn)一步分析了著色草莓中花青苷組分和含量。誘導(dǎo)草莓果實(shí)中花青苷含量最高的矢車菊3-半乳糖苷，占總花青苷含量的68％以上(圖3d)。實(shí)施例6pymyb114與它的共作用因子pybhlh3同源表達(dá)促進(jìn)梨花青苷合成選取花后30天左右的‘早酥梨’為試驗(yàn)材料，參考cloughetal.(1998)真空滲透方法將超表達(dá)的載體pymyb114和pybhlh3轉(zhuǎn)入梨果皮。結(jié)果表明，共同侵染轉(zhuǎn)化pymyb114和pybhlh3后發(fā)現(xiàn)有花青苷的積累在梨果皮侵染的區(qū)域(圖4a)。此外，uplc測(cè)定花青苷的含量表明與表型數(shù)據(jù)趨勢(shì)一致，它的主要成分是矢車菊3-半乳糖苷，并且花青苷含量的增加主要是矢車菊3-半乳糖苷含量的升高(圖4b)?；ㄇ嘬丈锖铣上嚓P(guān)基因的表達(dá)模式也進(jìn)一步分析(圖4c和d)，結(jié)果表明花青苷生物合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因pydfr，pyans和pyufgt表達(dá)量提高，促進(jìn)梨果皮花青苷生物合成。因此，pymyb114起著重要的作用在轉(zhuǎn)錄調(diào)控花青苷生物合成的過程中，而pybhlh3是它的輔助因子。pymyb114基因的功能進(jìn)一步通過驗(yàn)證rna干擾基因表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。為了避免沉默其它同源基因，選取轉(zhuǎn)錄因子接近3’端的特異性的氨基酸片段被克隆，插入到psak277瞬時(shí)表達(dá)載體，構(gòu)建了重組載體：pymyb114-rnai，pybhlh3-rnai。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化psak277(空載)，pymyb114-rnai和pybhlh3-rnai分別注射到接近成熟期的‘紅早酥’梨果皮。轉(zhuǎn)化7天后觀察到pymyb114-rnai和pybhlh3-rnai的梨果皮侵染的位置周圍著色減少，psak277(空載)梨果皮并沒有發(fā)現(xiàn)果皮顏色的變化(圖4e)。總花青苷含量的測(cè)定表現(xiàn)出類似的趨勢(shì)(圖4g)，uplc測(cè)定花青苷的主要成分是矢車菊3-半乳糖苷，并且花青苷含量的減少也主要是矢車菊3-半乳糖苷含量的降低(圖4f)。此外，rt-qpcr分析花青苷合成的關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，與空載psak277相比，pymyb114-rnai，pybhlh3-rnai的表達(dá)量都有不同程度的下降(圖4h)。這些結(jié)果表明pymyb114，pybhlh3參與梨果皮花青苷生物合成的調(diào)控。實(shí)施例7雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證pymyb114和pybhlh3之間的互作為了驗(yàn)證共轉(zhuǎn)化2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是否能激活花青苷生物合成通路后期的結(jié)構(gòu)基因pydfr，pyans和pyufgt的啟動(dòng)子區(qū)域通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，并用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，pymyb114能夠轉(zhuǎn)錄激活啟動(dòng)子，尤其是當(dāng)與其它轉(zhuǎn)錄因子pybhlh3共轉(zhuǎn)化，當(dāng)啟動(dòng)子是pydfr，和pyufgt時(shí)，pymyb114具有更高的轉(zhuǎn)錄激活活性。相反，當(dāng)啟動(dòng)子是pyans時(shí)，pymyb10與pybhlh3共轉(zhuǎn)化具有更高的活性(圖5)。此外，pymyb114和pymyb10共轉(zhuǎn)化也能激活pydfr，pyans和pyufgt的啟動(dòng)子活性，進(jìn)而促進(jìn)花青苷的生物合成(圖5)。實(shí)施例8酵母雙雜交驗(yàn)證pymyb114和pybhlh3之間的互作酵母雙雜交試驗(yàn)是為了驗(yàn)證3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子之間是否存在相互作用。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子的自激活活性，克隆pymyb114cds全長(zhǎng)序列和c-或n-端殘基氨基酸序列，并插入到pgbkt7載體，同時(shí)克隆了pybhlh3和pymyb10cds全長(zhǎng)序列插入pgadt7載體目的是檢測(cè)與pymyb114是否存在蛋白互作。首先共轉(zhuǎn)化pybhlh3與pymyb114在二缺sd-trp-leu的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，再把轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到四缺sd-trp-leu-his-ade的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，pymyb114cds全長(zhǎng)的氨基酸序列(v)和c-端160個(gè)氨基酸殘基(169-229)(iv)表現(xiàn)出很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性，n-端氨基端殘基myb1141-93(i)和myb1141-160(ii)和c-端氨基酸殘基myb114136-229(iii)不存在轉(zhuǎn)錄激活活性。共同轉(zhuǎn)化酵母時(shí)，n-端氨基端殘基myb1141-160(ii)與pybhlh3不但能在在二缺sd-trp-leu的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而且能在四缺sd-trp-leu-his-ade培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這說明pymyb114與pybhlh3之間互作的位點(diǎn)在n-端氨基端殘基myb1141-160(ii)位點(diǎn)(圖6a，b)。pymyb114與pymyb10之間的互作分析發(fā)現(xiàn)，pymyb114的c-端殘基myb114136-229(iii)與pymyb10存在互作(圖6c)。主要參考文獻(xiàn)aharoni,a.,devos,c.h.,wein,m.,sun,z.,greco,r.,kroon,a.,mol,j.n.ando’connell,a.p.(2001)thestrawberryfamyb1transcriptionfactorsuppressesanthocyaninandflavonolaccumulationintransgenictobacco.plantj28:319-332.albert,n.w.,davies,k.m.,lewis,d.h.,zhang,h.b.,montefiori,m.,brendolise,c.,boase,m.r.,ngo,h.,jameson,p.e.andschwinn,k.e.(2014)aconservednetworkoftranscriptionalactivatorsandrepressorsregulatesanthocyaninpigmentationineudicots.plantcell26:962–980.bany,hondac,hatsuyamay,igarashim,besshoh,moriguchit(2007)isolationandfunctionalanalysisofamybtranscriptionfactorgenethatisakeyregulatorforthedevelopmentofredcolorationinappleskin.plantcellphysiol48:958–970ban,y.,mitani,n.,hayashi,t.,sato,a.,azuma,a.,kono,a.andkobayashi,s.(2014)exploringquantitativetraitlociforanthocyanincontentininterspecifichybridgrape(vitislabruscanaxvitisvinifera).euphytica.198:101–114.bieza,k.andlois,r.(2001)anarabidopsismutanttoleranttolethalultraviolet-blevelsshowsconstitutivelyelevatedaccumulationofflavonoidsandotherphenolics.plantphysiol126:1105–1115.butelli,e.,titta,l.,giorgio,m.,mock,h.p.,matros,a.andpeterek,s.(2008)enr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