專利名稱：雙表達(dá)盒的表達(dá)載體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙表達(dá)盒的表達(dá)載體及其制備方法與應(yīng)用。
些旦W 胃足漢不
哺乳動(dòng)物細(xì)胞真核表達(dá)載體是基因工程技術(shù)中最常見(jiàn)的表達(dá)載體之一，被廣泛 的應(yīng)用于科研、生產(chǎn)等領(lǐng)域。與原核蛋白表達(dá)載體相比，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞翻譯的蛋 白，經(jīng)過(guò)翻譯后的加工與修飾，在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞 等真核表達(dá)系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質(zhì)。目前在科研中真核蛋白表達(dá)質(zhì)粒廣為應(yīng)用，
如研究蛋白在哺乳細(xì)胞中的定位、DNA疫苗的研制等，而且許多重要的蛋白及糖蛋 白利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)和生產(chǎn)，有些產(chǎn)品已投入臨床應(yīng)用或試用。
目前使用的真核表達(dá)蛋白質(zhì)粒在構(gòu)建表達(dá)外源基因質(zhì)粒的過(guò)程中，是通過(guò)傳統(tǒng) 的連接方法連接的，首先要選擇合適的酶切位點(diǎn)，要求連接的外源基因片段中沒(méi)有 所選擇的酶切位點(diǎn)，然后用限制性內(nèi)切酶酶切載體與外源基因片段，再用T4DNA連 接酶將載體與目的片段連接成一個(gè)完整的質(zhì)粒。傳統(tǒng)的這種酶切的連接方法存在步 驟比較煩瑣、成本高(需要購(gòu)買內(nèi)切酶與連接酶)，連接效率較低等問(wèn)題，在構(gòu)建 過(guò)程中PCR產(chǎn)物與載體都要通過(guò)反復(fù)的酶切，電泳，回收等步驟，才能進(jìn)行進(jìn)一步 的連接

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雙表達(dá)盒的表達(dá)載體及其制備方法與應(yīng)用。 本發(fā)明所提供的雙表達(dá)盒的表達(dá)載體，命名為pDP-EX-vector,是一種環(huán)狀載 體，包含原核復(fù)制起點(diǎn)、兩個(gè)真核復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因和兩個(gè)外源基因表達(dá)盒； 所述兩個(gè)外源基因表達(dá)盒分別為外源基因表達(dá)盒1和外源基因表達(dá)盒2;所述外源 基因表達(dá)盒l(wèi)自上游至下游依次含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄方向相同的啟動(dòng)子、連接片段l和多 聚腺苷酸加尾信號(hào)，所述連接片段l含有EcoRV識(shí)別序列；所述外源基因表達(dá)盒2 自上游至下游依次含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄方向相同的啟動(dòng)子、連接片段2和多聚腺苷酸加尾 信號(hào)，所述連接片段2含有StuI識(shí)別序列。
其中，所述外源基因表達(dá)盒1和所述外源基因表達(dá)盒2的轉(zhuǎn)錄方向可以相同也 可以相反，優(yōu)選所述外源基因表達(dá)盒1和所述外源基因表達(dá)盒2的轉(zhuǎn)錄方向相反。
4所述兩個(gè)轉(zhuǎn)錄方向相同的啟動(dòng)子可為多種啟動(dòng)子，具體可為巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子
和T7噬菌體啟動(dòng)子。所述真核復(fù)制起點(diǎn)可為任何現(xiàn)已知的真核生物進(jìn)行DNA復(fù)制 的起始點(diǎn)，具體可為SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)。所述多聚腺苷酸加尾信號(hào)可為具有終止 轉(zhuǎn)錄作用的所有DNA片段，具體可為牛生長(zhǎng)激素基因多聚腺苷酸加尾序列。所述原 核復(fù)制起始位點(diǎn)可為任何現(xiàn)已知的原核生物進(jìn)行DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，具體可為大腸 桿菌質(zhì)粒CoIEl復(fù)制起始位點(diǎn)。
pDP-EX-vector的核苷酸序列具體可為序列表中的序列1。 用EcoRV或Stul酶切所述雙表達(dá)盒的表達(dá)載體得到的線性載體也屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述雙表達(dá)盒的表達(dá)載體的構(gòu)建方法。 本發(fā)明所提供的雙表達(dá)盒的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟 1)以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用如下引物5' ^^r677T7T7rCT6^rar7^C46^G
3'和5' fi^77r7^C^47^7<X7T(^6CATGCATCTAG 3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段A;
2 )以pCDNA3. 0質(zhì)粒為模板，用如下引物5' C7r^6K4MM7TCAGCACAC
3'和5' OX7^7^(r"^TC^6^A^A4C^(;7 3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段B;
3) 將片段A和片段B導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)同源重組將片段A和 片段B連接，獲得重組載體I;
4) 以重組載體I為模板，用如下引物5' GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC 禾Q 5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG 3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段D;
5) 以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用如下引物
5， GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3，或5， CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC J， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段C;
6) 將片段C和片段D導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)同源重組將片段C和 片段D連接，獲得重組載體II;
7) 以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用如下引物5， CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC 3，和5，
CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC J， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段F;
8) 以重組載體II為模板，用如下引物5' GAGTTAGGGGCGGGATCGCCGCTACAGGGCG 和5， GGAGGCCTAGGCTTTTGCAGGAAAGAACATGTGAG 3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段E;
9) 將片段E和片段F導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)同源重組將片段E和片段F連接，獲得重組載體III;
10) 以重組載體III為模板用如下引物5'
CAATAATCAATGTCAACGCCTAGGCTTTTGCAGGA J，和5，
GGTGGGCTCTATGGCTTCCCTCCAAAAAAGCCTCCTC3， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段H;
11) 以PCDNA3. 0為模板，用如下引物5， GAGGAGGCTTTTTTGGAGG GAAGCCATAGAGCCCACCJ，與5' TCCTGCAAAAGCCTAGGCGTTGACATTGATTATTG3，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到片段G;
12)將片段G和片段H導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)同源重組將片段G 和片段H連接，獲得重組載體IV;
13) 以重組載體IV為模板，以引物如下
5, AAAGCAGGCCTTGTTTCTACTCTCGAGCATGCATCTJ，與5， AACAAGGCCTGCTTTCGCTGATATCTGCAGAATTC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段I;
14) 將片段I導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)同源重組獲得所述的載體。 本發(fā)明的pDP-EX-vector含有兩個(gè)外源基因表達(dá)盒，每個(gè)表達(dá)盒都能表達(dá)蛋
白，可選擇其中一個(gè)表達(dá)盒構(gòu)建重組表達(dá)載體，也可同時(shí)使用兩個(gè)表達(dá)盒構(gòu)建重組 表達(dá)載體，兩個(gè)表達(dá)盒中的外源基因可以相同也可以不同。
以本發(fā)明的pDP-EX-vector為出發(fā)載體，利用同源重組構(gòu)建表達(dá)外源基因的重 組載體，避免了傳統(tǒng)的酶切，連接等環(huán)節(jié)，整個(gè)構(gòu)建過(guò)程中不使用任何內(nèi)切酶與連 接酶，且比傳統(tǒng)的連接過(guò)程省略了2-3個(gè)步驟，連接的效率也較理想。使用本發(fā)明 的pDP-EX-vector構(gòu)建表達(dá)外源基因的重組載體的過(guò)程簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效， 可以快速完成大量外源基因的表達(dá)載體的構(gòu)建。本發(fā)明的pDP-EX-vector含有兩個(gè) 外源基因表達(dá)盒、兩個(gè)真核復(fù)制起點(diǎn)，可以在i達(dá)T抗原的細(xì)胞中大量增值，從而 提高蛋白表達(dá)的水平，具有很好的應(yīng)用前景。


圖1為pDP-EX-vector的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2為熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中如無(wú)特殊說(shuō)明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可從商業(yè)途徑 獲得。
實(shí)施例1、 pDP-EX-vector的構(gòu)建1) 重組載體I的構(gòu)建
設(shè)計(jì)引物重組載體I (1)上游和重組載體I (1)下游、重組載體I (2)上游 和重組載體I (2)下游，引物的序列如下
重組載體I (1)上游5'^^7^77T7776r7^C^r6tT^^6^6 3'; 重組載體I (1)下游5'fi^77r7^^"7^70Ta^6CATGCATCTAG 3'。 重組載體I (2) 上游5' C7Tg贏超nd超r6CAGCACAC 3'(劃線部分為 EcoR V酶識(shí)別位點(diǎn))；
重組載體I (2) 下游5'ar7^7^r6^a^46^4^^i4C47^7 3'。
以pEGFP-Nl(Invitrogen)質(zhì)粒為模板，用引物重組載體I (1)上游和重組載體
1(1)下游PCR擴(kuò)增片段A，以pCDNA3.0質(zhì)粒為模板，用引物重組載體I (2)上
游和重組載體I (2)下游PCR擴(kuò)增片段B。
PCR反應(yīng)體系10XPCR Buffer 5ML，上游、下游引物各1ML， DNA模板lpL，
MgCl2 (25raM) 3叱，dNTPs (各2. 5mM) 3ML， Pfu-Taq (5U/A) 0. 5!^L，最后補(bǔ)水至
反應(yīng)條件94。C熱變性5min; 94。C變性45s， 53。C退火45s， 72。C延伸6min， 共30個(gè)循環(huán)；72。C最后延伸10min。
PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說(shuō)明書(shū)。
50pl感受態(tài)細(xì)胞中加入片段A和B后混勻，片段A和B質(zhì)量比為100 ng: 500 ng?；靹蚝篌w系冰浴30 min。 42。C水浴熱激90秒，然后冰上放置3 min，加入預(yù) 熱的LB培養(yǎng)基900 jil，置于37'C下，180 rpm振搖90 min，收集菌體，用LB液 體培養(yǎng)基重懸菌體，取200 jal重懸液涂布LB板上(含有氨芐青霉素)，37'C培養(yǎng) 12 h。挑取單克隆提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒為重組載體I。
2) 重組載體II的構(gòu)建
設(shè)計(jì)引物SV40 (1)上游和SV40 (1)下游、重組載體II上游和重組載體II下游， 引物SV40(1)上游和SV40(1)下游、重組載體II上游和重組載體II下游序列如下 SV40 (1)上游5， GTGCCACCTGACGTCCMAAGCCTAGGCCTCCJ，； SV40 (1)下游5， CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTCJ，。 重組載體II上游5， GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC3，； 重組載體II下游5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG3，。
以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用引物SV40(1)上游和SV40(1)下游PCR擴(kuò)增片段C;
7以重組載體I質(zhì)粒為模板，用引物重組載體II上游和重組載體II下游PCR擴(kuò)增片段D。
PCR反應(yīng)體系10XPCR Buffer 5叱，上游、下游引物各1叱，DNA模板1叱， MgCl2 (25 mM) 3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3 HL， Pfu-Taq(5 U/叱)0.5叱，最后補(bǔ) 水至50叱。
反應(yīng)條件94。C熱變性5 min; 94。C變性45 s， 53 。C退火45s， 72 。C延伸6 min， 共30個(gè)循環(huán)；72 。C最后延伸10 min。
PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說(shuō)明書(shū)。
50pl感受態(tài)細(xì)胞中加入片段C和D后混勻，片段C和D質(zhì)量比為100ng: 500ng。 混勻后體系冰浴30 min。 42"C水浴熱激90秒，然后冰上放置3 min，加入預(yù)熱的 LB培養(yǎng)基900 |il，置于37。C下，180rpm振搖90 min，收集菌體，用LB液體培養(yǎng) 基重懸菌體，取200 )al重懸液涂布LB板上(含有氨,青霉素)，37。C培養(yǎng)12h。 挑取單克隆提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為重組載體II。
3)重組載體m的構(gòu)建
設(shè)計(jì)引物SV40(2)上游和SV40(2)下游、重組載體III上游和重組載體III下游， 引物SV40(2)上游和SV40(2)下游、重組載體m上游和重組載體III下游序列如下 SV40(2)上游5， CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC3，； SV40(2)下游5， CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC3，。 重組載體III上游5， GAGTTAGGGGCGGGATCGCCGCTACAGGGCG3，； 重組載體III下游5， GGAGGCCTAGGCTTTTGCAGGAAAGAACATGTGAG3，。 以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用引物SV40(2)上游和SV40(2)下游PCR擴(kuò)增片段F; 以重組載體II質(zhì)粒為模板，用引物重組載體III上游和重組載體III下游PCR擴(kuò)增片段E。
PCR反應(yīng)體系10XPCRBuffer5叱，上游、下游引物各1叱，DNA模板1叱， MgCl2(25 mM) 3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3叱，Pfu-Taq (5U/叱)0.5叱，最后補(bǔ)水 至50叱。
反應(yīng)條件94 "C熱變性5 min; 94 "變性45 s， 53 "C退火45 s， 72 。C延伸 6 min，共30個(gè)循環(huán)；72 。C最后延伸10 min。
PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說(shuō)明書(shū)。
50pl感受態(tài)細(xì)胞中加入片段E和F后混勻，片段E和F質(zhì)量比為100ng: 500ng?；靹蚝篌w系冰浴30min。 42。C水浴熱激90秒，然后冰上放置3rain，加入預(yù)熱的LB 培養(yǎng)基900|11，置于37t:下，180rpm振搖90min，收集菌體，用LB液體培養(yǎng)基重 懸菌體，取200pl重懸液涂布LB板上(含有氨芐青霉素)，37。C培養(yǎng)12h。挑取單 克隆提取質(zhì)粒，該載體為重組載體III
4) 重組載體IV的構(gòu)建
設(shè)計(jì)引物pCDNA上游和pCDNA下游、重組載體IV上游和重組載體IV下游，引物 序列如下
pCDNA上游5' GAGGAGGCTTTTTTGGAGGGAAGCCATAGAGCCCACCJ，； pC薩下游5， TCCTGCAAAAGCCTAGGCGTTGACATTGATTATTGJ'。 重組載體IV上游5， CAATAATCAATGTCAACGCCTAGGCTTTTGCAGGAJ，； 重組載體IV下游5， GGTGGGCTCTATGGCTTCCCTCCAAAAAAGCCTCCTCJ，。 以PCDNA3. 0質(zhì)粒為模板，用引物pCDNA上游和pCDNA下游PCR擴(kuò)增片段G;以
重組載體ni質(zhì)粒為模板，用引物重組載體W上游和重組載體IV下游PCR擴(kuò)增片段H。 PCR反應(yīng)體系10XPCR Buffer 5叱，上游、下游引物各1 ML， DNA模板1叱，
MgCl2(25 mM) 3叱，dNTPs (各2. 5 mM) 3叱，Pfu-Taq (5U/叱)0.5叱，最后補(bǔ)水
至50叱。
反應(yīng)條件94 。C熱變性5 min; 94 。C變性45 s， 53 。C退火45 s， 72 。C延伸 6 min，共30個(gè)循環(huán)；72 。C最后延伸10 min。
PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說(shuō)明書(shū)。
5(^1感受態(tài)細(xì)胞中加入片段G和H后混勻，片段G和H質(zhì)量比為100ng: 500ng。 混勻后體系冰浴30min。 42'C水浴熱激90秒，然后冰上放置3min，加入預(yù)熱的LB 培養(yǎng)基900pl，置于37t:下，180rpra振搖90min，收集菌體，用LB液體培養(yǎng)基重 懸菌體，取200pl重懸液涂布LB板上(含有氨芐青霉素)，37。C培養(yǎng)12h。挑取單 克隆提取質(zhì)粒，該載體為重組載體IV
5) pDP-EX-vector的構(gòu)建
設(shè)計(jì)引物pDP-EX-vector上游和pDP-EX-vecto下游，引物序列如下 pDP-EX-vector上游AAAGCAGGCCTTGTTTCTACTCTCGAGCATGCATCT ; pDP-EX-vector下游AACAAGGCCTGCTTTCGCTGATATCTGCAGAATTC。 以重組載體IV質(zhì)粒為模板，用引物pDP-EX-vector上游和pDP-EX-vector下游 PCR擴(kuò)增片段I。PCR反應(yīng)體系10XPCR Buffer 5叱，上游、下游引物各1吣，DNA模板1叱， MgCl2(25 mM) 3禮，dNTPs(各2. 5 raM) 3 ML， Pfu-Taq(5U/叱)0.5叱，最后補(bǔ)水 至50叱。
反應(yīng)條件94 t:熱變性5 rain; 94 t)變性45 s， 53 'C退火45 s， 72 'C延伸 6 min，共30個(gè)循環(huán)；72 。C最后延伸10 min。
PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說(shuō)明書(shū)。
50|il感受態(tài)細(xì)胞中加入片段I后混勻。混勻后體系冰浴30min。 42。C水浴熱激 90秒，然后冰上放置3min，加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)基900pl，置于37。C下，180rpm 振搖90min，收集菌體，用LB液體培養(yǎng)基重懸菌體，取200nl重懸液涂布LB板上 (含有氨芐青霉素)，37X:培養(yǎng)12h。挑取單克隆提取質(zhì)粒，該載體為pDP-EXiector， PDP-EX-vector圖譜如圖1所示。
將pDP-EX-vector測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，pDP-EX-vector的核苷酸序列如序列表 中的序列1，序列1自5'末端第1-629位為CMV啟動(dòng)子，自5'末端第630-648 位為T7啟動(dòng)子，自5'末端第713-718位為EcoR V酶的識(shí)別序列，自5'末端第 719-1071位為BGH Ploy A，，自5'末端第1072-1223位為SV40 Origin,自5' 末端第1224-1515為BGH Ploy A，自5'末端第1516-1521位為Stul酶切位點(diǎn)， 自5'末端第1522-1539位為T7啟動(dòng)子，自5'末端第1540-2261為CMV啟動(dòng)子， 自5'末端第2262-2880位為C0IE1 Origin,自5'末端第2881-4071位為氨節(jié)青 霉素抗性基因，自5'末端第4072-4239位為SV40 0rigin。序列1的自5'端第 700-715位的核苷酸序列和序列1的自5'端第716-730位的核苷酸序列為能與外源 基因上的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生同源序列重組的序列。序列1的自5'端第1504-1519 和序列1的自5'端第1520-1534能與外源基因上的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生同源序列重組 的序列。
實(shí)施例2、 pDP-EX-vector表達(dá)蛋白的能力 1)表達(dá)綠色熒光蛋白的pDP-EX-EGFPl的構(gòu)建
設(shè)計(jì)引物EGFP (1)上游和EGFP (1)下游，引物EGFP (1)上游和EGFP (1) 下游序列如下
EGFP (1)上游WA4ntTGC4^4r TCGCCACCATGGTGAG;
EGFP (1)下游J7^C47^70Z46^r TTACTTGTACAGCTCG。
引物中GGAATTCTGCAGAT和ATGCATGCTCGAGGAT序列為能與序列1的自5'端第
10700-715位的核苷酸序列和序列1的自5'端第716-730位的核苷酸序列發(fā)生同源重 組的序列。
以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用引物EGFP(1)上游和EGFP(1)下游PCR擴(kuò)增EGFP1 基因片段。
反應(yīng)體系10XPCR Buffer 5叱，上游、下游引物各1叱，DNA模板1叱， MgCl2(25 mM)3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3叱，Pfu-Taq (5U/叱)0.5 PL，最后補(bǔ)水 至50叱。
反應(yīng)條件94 。C熱變性5 rain; 94 。C變性45 s， 50 。C退火45 s， 72 。C延伸 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 。C最后延伸10 min。
PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說(shuō)明書(shū)。
pDP-EX-vector用EcorV內(nèi)切酶酶切線性化，回收線性化的pDP-EX-vector。 酶切體系如下
10XDbufferl0pl， BSAlpl, EcoR V 2 y 1 (20U PROMEGA公司)，pDP-EX-vector 50ul，補(bǔ)水至100ul， 37° C酶切過(guò)夜。
酶切產(chǎn)物在1XTAE配制的瓊脂糖凝膠中電泳，120v，電泳30分鐘，DNA回收 試劑盒回收目的片段。
50|il感受態(tài)細(xì)胞中加入線性化的pDP-EX-vector和EGFP1基因片段后混勻，線 性化的pDP-EX-vector和EGFP1基因片段質(zhì)量比為100ng: 500ng?；靹蚝篌w系冰浴 30min。 42。C水浴熱激90秒，然后冰上放置3min，加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)基900^1， 置于37。C下，180rpm振搖90min，收集菌體，用LB液體培養(yǎng)基重懸菌體，取200jil 重懸液涂布LB板上(含有氨芐青霉素)，37t:培養(yǎng)12h。挑取單克隆提取質(zhì)粒，命 名為pDP-EX-EGFP1。
2)表達(dá)綠色熒光蛋白的pDP-EX-2EGFP的構(gòu)建
設(shè)計(jì)引物EGFP (2)上游和EGFP (2)下游，引物EGFP (2)上游和EGFP (2) 下游序列如下
EGFP (2)上游TGAGTAGAAACAAGG TCGCCACCATGGTGAG;
EGFP (2)下游GAGAGCGAAAGCAGG TTACTTGTACAGCTCG。
引物中TGAGTAGAAACAAGG和GAGAGCGAAAGCAGG序列為能與序列1的自5'端第 1504-1519位的核苷酸序列和序列1的自5'端第1520-1534位的核苷酸序列發(fā)生同 源重組的序列。以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用引物EGFP(2)上游和EGFP(2)下游PCR擴(kuò)增EGFP2 基因片段。
反應(yīng)體系10XPCR Buffer 5 ^L，上游、下游引物各1吣，DNA模板1叱， MgCl2(25 raM)3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3叱，Pfu-Taq(5U/nL) 0.5叱，最后補(bǔ)水 至50 1^L。
反應(yīng)條件94 。C熱變性5 min; 94 。C變性45 s， 50 。C退火45 s， 72 。C延伸 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 。C最后延伸10 min。
PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說(shuō)明書(shū)。
pDP-EX-EGFP用Stul內(nèi)切酶酶切線性化，回收線性化的pDP-EX-EGFP。
酶切體系如下
10XD bufferlOfil， BSA l|ul， Stul 2 u 1 (20U PROMEGA公司)，pDP-EX-vector 50ul，補(bǔ)水至100ul， 37° C酶切過(guò)夜。
酶切產(chǎn)物在1XTAE配制的瓊脂糖凝膠中電泳，120v，電泳30分鐘，DNA回收 試劑盒回收目的片段。
50jul感受態(tài)細(xì)胞中加入線性化的pDP-EX-EGFP和EGFP2基因片段后混勻，線性 化的pDP-EX-EGFP和EGFP2基因片段質(zhì)量比為100ng: 500ng。混勻后體系冰浴30min。 42t:水浴熱激90秒，然后冰上放置3min，加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)基900|al，置于37 。C下，180rpm振搖90min，收集菌體，用LB液體培養(yǎng)基重懸菌體，取20(^1重懸 液涂布LB板上(含有氨芐青霉素)，37。C培養(yǎng)12h。挑取單克隆提取質(zhì)粒，命名為 pDP-EX-2EGFP。
3)綠色熒光蛋白的的檢測(cè)
取10 ul lipof ectamine 2000 (Invitrogen公司)加入到250 ul的OPTI-MEMI 培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中，室溫放置5分鐘，獲得溶液1;將5ug pDP-EX-EGFP1， pDP-EX-2EGFP質(zhì)粒分別加入到250 ul的OPTI-MEMI培養(yǎng)基中，獲得溶液2和溶液 3;將溶液1和2混合，室溫孵育20分鐘，再加入500 ul的OPTI-MEMI培養(yǎng)基， 得到溶液4;將溶液1和3混合，室溫孵育20分鐘，再加入500 ul的OPTI-MEMI 培養(yǎng)基，得到溶液5。
將293T細(xì)胞置于6孔細(xì)胞板中培養(yǎng)，等待細(xì)胞長(zhǎng)至60%時(shí)將細(xì)胞用PBS洗滌兩 次，然后分別加入溶液4和溶液5， 37t;孵育5個(gè)小時(shí)，分別吸出溶液4和溶液5， 加入新鮮的OPTI-MEMI培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)情況。
以pEGFP-Nl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，以轉(zhuǎn)染pDP-EX-vector的 293T細(xì)胞作為陰性對(duì)照。
熒光顯微鏡結(jié)果如圖2所示，pDP-EX-EGFP1轉(zhuǎn)染后24小時(shí)293T細(xì)胞(圖2C) 有熒光信號(hào)，pDP-EX-2EGFP轉(zhuǎn)染后24小時(shí)293T細(xì)胞的熒光信號(hào)比pDP-EX-EGFPl 轉(zhuǎn)染后24小時(shí)293T細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)(圖2C)，陽(yáng)性對(duì)照也有熒光出現(xiàn)(圖2B)， 而陰性對(duì)照(圖2A)沒(méi)有熒光。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，以pDP-EX-vector作為出發(fā)載體構(gòu)建的重組表達(dá)載體，具 有良好的蛋白表達(dá)能力。序列表
<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
〈120〉雙表達(dá)盒的表達(dá)載體及其制備方法與應(yīng)用
<130> CGGNARW92031
<160> 1
<210> 1
<211〉 4239
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220> <223>
<400> 1
ac已ttg3tta^ttgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagccc60
atatatggagttccgcgttacataacttacgg他3tggCccgcctggctgaccgcccaa120
cgacccccgcccattgacgtC3ata^tgacgtatgttccc3t8gt^CgCC^t3ggg3C180
cgtcaatgggtggactatttacggta犯ctgcccacttggcagtacatca240
agtgtatcatcgccccctattgacgtcaatg3cggt犯a1:ggcccgcctg300
gcattatgccca^gt3catggiccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtatt360
agtcatcgct3ttacc3tgg"tgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtgg血gcg420
gtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtc犯tgggagtttgttttg■
caacgggactttccaaaatg"tcgt^ca^ctxcgccccattgacgc犯at540
gggcggtaggcgtgtacggtggg鄉(xiāng)tctSLta^ta^gcagagctctctggc600
acccactgcttactggcttatcga犯ttaatacgactcactat鄉(xiāng)g卿ccc肌gcttg660
gtaccgagctcggatccactagtaacggccgccagtgtgctggaattctgcagata1:cct720
cgagcatgcatct卿gggccctattctatagtgtcaccta^atgctagagctcgctgat780
cagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgcctt840
14ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat 900
cgcsttgtct gagt郷tgt c^ttc城tc "tggggggtgg ggtggggcag gacagc鄉(xiāng)g 960
gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcttctg 1020
aggcggaaag aaccagctgg ggctctaggg ggtatcccca cgcgccctgt agcggcgatc 1080
ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt 1140
atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc 1200
ttttttggag ggaagccata gagcccaccg catccccagc atgcctgcta tt.gtcttccc 1260
aatcctcccc cttgctgtcc tgccccaccc caccccccag aatagaatga cacctactca 1320
gacaatgcga tgcaatttcc tcattttatt agga肌ggac agtgggagtg gcaccttcca 1380
gggtcaagga aggcax:gggg gaggggca^ c^c鄧a"tgg ctggc肌cta g^ggcacag 1440
tcgaggctg3 tcagcgagct ctagcattta ggtgacac"t3 tagaataggg ccctctagat 1500
gcatgagtag aaacaaggcc tgctttcgct ctcgagggat atctgcagaa ttccagcaca 1560
ctggcggccg ttactagtgg atccgagctc ggtaccaagc ttgggtctcc ctatagtgag 1620
tcgtattaat ttcgataagc cagtaagcag tgggttctct agttagccag agagctctgc 1680
ttatatagac ctcccaccgt acacgcctac cgcccatttg cgtcaatggg gcggagttgt 1740
tacgacattt tgga犯gtcc cgttgatttt ggtgcc犯a^ ca犯ctccca "ttgacgtcaa 1800
tggggtggag acttggaaat ccccgtgagt caaaccgcta tccacgccca ttgatgtact 1860
gccaaaaccg catcaccatg gtaatagcga tgactaatac gtagatgtac tgccaagtag 1920
gaaagtccca t犯ggtcatg t￡tctgggcat aatgccaggc gggccWtta ccgtcattga 1980
cgtcaatagg gggcgtactt ggcatatgat acacttgatg tactgccaag tgggcagttt 2040
accgtaaata gtcc3cccat tgacgtcaat ggaaagtccc tattggcgtt actatgggaa 2100
catacgtcat tattgacgtc aatgggcggg gg"tcgttggg cggtcagcca ggcgggccat 2160
ttaccgtaag ttatgtaacg cggaactcca t.atatgggct atgaactaat gaccccgtaa 2220
ttgattacta ttaataacta gtcaataatc aatgtcaacg cctaggcttt tgcaggsaag 2280
aacatgtgeig ca^aaggccei gca^aeiggcc aggaaccgta犯aaggccgc gttgctggcg 2340
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 2400
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 2460
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 2520
agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 2580
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 2640
aactatcgtc t.tgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 2700
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta c卿gttctt gaagtggtgg 2760
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 2820
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 2880
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa etaggatctca agaagatcct 2940
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacga犯actcacgtta agggattttg 3000
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt ta^attaaaa atgaagtttt 3060
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatxagt 3120
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 3180
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 3240<formula>formula see original document page 16</formula>
權(quán)利要求
1、一種環(huán)狀載體，包含原核復(fù)制起點(diǎn)、兩個(gè)真核復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因和兩個(gè)外源基因表達(dá)盒；所述兩個(gè)外源基因表達(dá)盒分別為外源基因表達(dá)盒1和外源基因表達(dá)盒2；所述外源基因表達(dá)盒1自上游至下游依次含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄方向相同的啟動(dòng)子、連接片段1和多聚腺苷酸加尾信號(hào)，所述連接片段1含有EcoRV識(shí)別序列；所述外源基因表達(dá)盒2自上游至下游依次含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄方向相同的啟動(dòng)子、連接片段2和多聚腺苷酸加尾信號(hào)，所述連接片段2含有StuI識(shí)別序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于所述外源基因表達(dá)盒1和所述外 源基因表達(dá)盒2的轉(zhuǎn)錄方向相反。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的載體，其特征在于所述兩個(gè)轉(zhuǎn)錄方向相同的啟 動(dòng)子為巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和T7噬菌體啟動(dòng)子。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于所述真核復(fù)制起點(diǎn)為sv40病毒復(fù) 制起點(diǎn)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于所述原核復(fù)制起始位點(diǎn)為大腸桿 菌質(zhì)粒CoIEl復(fù)制起始位點(diǎn)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于所述多聚腺苷酸加尾信號(hào)為牛生 長(zhǎng)激素基因多聚腺苷酸加尾序列。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于所述載體的核苷酸序列為序列表中的序列1。
8、 一種線性的載體，是用EcoRV或Stul酶切權(quán)利要求1至7中任一所述的載體 得到的線性載體。
9、 在表達(dá)sv40大t抗原的腫瘤細(xì)胞中，權(quán)利要求1至8中任一所述載體在表達(dá) 外源蛋白中的應(yīng)用。
10、 權(quán)利要求7所述載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟1) 以pegfp-ni質(zhì)粒為模板，用如下引物5':r677aT7ra^arc"x4(^"w 3'和5' fi^7T6T60WZ4rOTC6^6catgcatctag 3'進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到片段A;2) 以pCDNA3. 0質(zhì)粒為模板，用如下引物5' 6TO席JM7TTgC扁M7TCAGCACAC 3'和5' OT7^Z^a^C6K^6^^fii4(^7^r 3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段B;3) 將片段A和片段B導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)同源重組將片段A和片 段B連接，獲得重組載體I;4) 以重組載體I為模板，用如下引物5， GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC 3，和5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG J'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段D;5) 以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用如下引物5， GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC ，或5' CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC < ' 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段C;6) 將片段C和片段D導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)同源重組將片段C和片 段D連接，獲得重組載體II;7) 以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，用如下引物5， CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC < ，和5， CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC ， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段F;8) 以重組載體II為模板，用如下引物5， GAGTTAGGGGCGGGATCGCCGCTACAGGGCG 和5' GGAGGCCTAGGCTTTTGCAGGAAAGAACATGTGAG 3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段E;9) 將片段E和片段F導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)同源重組將片段E和片 段F連接，獲得重組載休m;10) 以重組載體m為模板用如下引物5'CAATAATCAATGTCAACGCCTAGGCTTTTGCAGGA ^和5， GGTGGGCTCTATGGCTTCCCTCCAAAAAAGCCTCCTC3， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段H;11) 以PCDNA3. 0為模板，用如下引物5， GAGGAGGCTTTTTTGGAGG GAAGCCATAGAGCCCACCJ，與5， TCCTGCAAAAGCCTAGGCGTTGACATTGATTATTG3'進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到片段G;12) 將片段G和片段H導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)同源重組將片段G和片 段H連接，獲得重組載體IV;13) 以重組載體IV為模板，以引物如下5' AAAGCAGGCCTTGTTTCTACTCTCGAGCATGCATCTJ，與5' AACAAGGCCTGCTTTCGCTGATATCTGCAGAATTC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段I;14) 將片段I導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)同源重組獲得權(quán)利要求7所述的 載體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種雙表達(dá)盒的表達(dá)載體及其制備方法與應(yīng)用。該表達(dá)載體是一種環(huán)狀載體，包含原核復(fù)制起點(diǎn)、兩個(gè)真核復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因和兩個(gè)外源基因表達(dá)盒；所述兩個(gè)外源基因表達(dá)盒分別為外源基因表達(dá)盒1和外源基因表達(dá)盒2；所述外源基因表達(dá)盒1自上游至下游依次含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄方向相同的啟動(dòng)子、連接片段1和多聚腺苷酸加尾信號(hào)，所述連接片段1含有EcoRV識(shí)別序列；所述外源基因表達(dá)盒2自上游至下游依次含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄方向相同的啟動(dòng)子、連接片段2和多聚腺苷酸加尾信號(hào)，所述連接片段2含有StuI識(shí)別序列。本發(fā)明的pDP-EX-vector含有兩個(gè)外源基因表達(dá)盒、兩個(gè)真核復(fù)制起點(diǎn)，可以在表達(dá)T抗原的細(xì)胞中大量增值，從而提高蛋白表達(dá)的水平，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101463361SQ20091007638
公開(kāi)日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2009年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月14日
發(fā)明者傅光華, 劉芹防, 劉金華, 畢玉海, 娟 蒲, 馬婧姣 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)