一株產(chǎn)L?酒石酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用與流程

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一株產(chǎn)L?酒石酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株利用葡萄糖或木糖發(fā)酵產(chǎn)L-酒石酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

L-酒石酸廣泛存在于自然界的多種植物果實中，其中成熟葡萄中L-酒石酸含量較多，其是一種用途非常廣泛的天然有機酸，主要作為食品添加劑和醫(yī)藥拆分劑應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化學工業(yè)等領(lǐng)域，據(jù)報道，L-酒石酸還可用于納米材料的制備及作為燃料經(jīng)濟性改性劑和抗磨劑。據(jù)不完全統(tǒng)計，2000年L-酒石酸市場全世界年消費約2萬噸，主要應(yīng)用在食品行業(yè)。

目前，L-酒石酸的生產(chǎn)主要有4種方法，包括提取法、化學拆分法、酶法和發(fā)酵-催化法，目前提取法受原料限制產(chǎn)量有限，化學拆分法由于溶劑的大量使用，已基本淘汰。酶法是目前L-酒石酸最主要的生產(chǎn)方法，生產(chǎn)效率高，但該方法依賴化石原料順式環(huán)氧琥珀酸，因此面臨著依賴化石資源的問題。發(fā)酵-催化法很好地解決了原料的問題，以葡萄糖等糖質(zhì)為原料，但其生產(chǎn)過程需先采用發(fā)酵的方式將葡萄糖發(fā)酵轉(zhuǎn)化為5-酮基-D-葡萄糖酸，進一步采用金屬催化劑催化合成L-酒石酸，導(dǎo)致該方法總體催化效率仍然偏低，有待技術(shù)突破。且采用兩步催化的方式增加了放大生產(chǎn)過程的操作性難度，且生產(chǎn)成本大幅提高。

若能通過對菌株的代謝工程改造，使其能夠以葡萄糖等糖質(zhì)為原料通過一步發(fā)酵法生產(chǎn)L-酒石酸，不僅解決了原料的問題，且其相對簡單的操作方式將有效提高其生產(chǎn)效率并降低成本，更具生產(chǎn)的可能性。

本發(fā)明以野生型大腸桿菌為出發(fā)菌株，重構(gòu)了菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)，抑制碳流流向乳酸、甲酸等副產(chǎn)物，同時強化流向L-酒石酸的代謝流，并阻斷L-酒石酸的分解代謝途徑，通過系列基因操作，構(gòu)建獲得了能夠一步發(fā)酵制備L-酒石酸的基因工程菌，該創(chuàng)新性工作未見任何報道，具有顯著的創(chuàng)新性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供提供一株利用單糖發(fā)酵產(chǎn)L-酒石酸的基因工程菌。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一株利用單糖發(fā)酵產(chǎn)L-酒石酸的基因工程菌，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CM-MA-184，已于2016年9月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為：CCTCC NO：M 2016455。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因工程菌CM-MA-184的構(gòu)建方法。

所述基因工程菌CM-MA-184的構(gòu)建方法包括如下步驟：

(1)以野生型大腸埃希氏菌(Escherichia coli)K12為出發(fā)菌株，采用RED重組技術(shù)無痕敲除大腸埃希氏菌K12中的三段基因，分別為丙酮酸分解途徑中的關(guān)鍵基因丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl(EcoGene登記號為EG10701)、乳酸脫氫酶基因ldh(EcoGene登記號為EG13186)以及草酰乙酸下游分解途徑關(guān)鍵基因蘋果酸脫氫酶編碼基因mdh(EcoGene登記號為EG10576)。

(2)高活力單質(zhì)粒共表達催化磷酸烯醇式丙酮酸至草酰乙酸的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(編碼基因為pck)和催化草酰乙酸至L-酒石酸脫水酶(編碼基因為ttd1、ttd2)；具體為，將前述三段基因合成一段目的基因序列pck-ttd1-ttd2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，將目的基因序列導(dǎo)入單質(zhì)粒，獲取重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入步驟(1)中敲除了三段基因的K12菌株感受態(tài)，獲取的陽性轉(zhuǎn)化子即為本發(fā)明的基因工程菌。其中，pck核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，ttd1核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，ttd2核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

其中，所述的表達質(zhì)粒為pTrc99a質(zhì)粒。

本發(fā)明的又一目的在于上述基因工程菌在產(chǎn)L-酒石酸的應(yīng)用。尤其是在電化學反應(yīng)器中利用單糖發(fā)酵制備L-酒石酸的應(yīng)用。

本發(fā)明中提供了一種具體在電化學反應(yīng)器中利用單糖發(fā)酵制備L-酒石酸的應(yīng)用方法，電化學反應(yīng)器陽極裝發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方為煙酸0.1mM；檸檬酸3.0g/L；Na₂HPO₄·7H₂O 3.00g/L；KH₂PO₄8.00g/L；(NH₄)₂HPO₄20.00g/L；NH₄Cl 10g/L；(NH₄)₂SO₄5g/L；MgSO₄·7H₂O 1.00g/L；CaCl₂·2H₂O 10.0mg/L；ZnSO₄·7H₂O 0.5mg/L；CuCl₂·2H₂O 0.25mg/L；MnSO₄·H₂O 2.5mg/L；CoCl₂·6H₂O 1.75mg/L；H₃BO₃0.12mg/L；Al₂(SO₄)₃·xH₂O 1.77mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/L；Fe(III)citrate 16.1mg/L，中性紅0.1mM，溶劑為水，滅菌后用氨水調(diào)節(jié)pH為7.0，其中60g/L葡萄糖單獨滅菌后加入；

陰極配方為：100mM，pH＝6.8的磷酸鹽緩沖液，NaCl 6g/L。

其中，種子液培養(yǎng)過程如下：

(S1)將凍存管中保存的菌液按體積分數(shù)為1～2％從凍存管轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，有氧培養(yǎng)10～12h；

(S2)將經(jīng)S1處理后的培養(yǎng)液按體積分數(shù)為1～2％轉(zhuǎn)接到種子發(fā)酵罐的LB培養(yǎng)基中；

(S3)待菌體OD₆₀₀至2.5～4時，將培養(yǎng)液按體積比5～10％接種至電化學反應(yīng)器的陽極。

其中，種子液培養(yǎng)過程中，步驟(S1)和(S2)中，培養(yǎng)溫度為35～37℃。

其中，步驟(S3)中采用厭氧發(fā)酵模式，過程中需通二氧化碳氣體維持厭氧環(huán)境。

其中，陽極的厭氧發(fā)酵過程維持溫度在30～32℃，培養(yǎng)過程pH用氨水調(diào)節(jié)為6.8～7.0。

有益效果：

本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌能夠?qū)崿F(xiàn)一步發(fā)酵制備L-酒石酸，創(chuàng)新性地建立了L-酒石酸一步發(fā)酵的生產(chǎn)方法，徹底擺脫了依賴于石油基原料的問題，實現(xiàn)了完全采用可再生生物質(zhì)資源(如葡萄糖、木糖等)為原料發(fā)酵制備L-酒石酸的路線，該路線綠色、環(huán)保。

附圖說明

圖1是敲除了pfl基因的E.coli K12(Δpfl)突變體的菌落PCR驗證圖；

圖2是敲除了pfl基因和ldh基因的E.coli K12(Δpfl,Δldh)突變體的菌落PCR驗證圖；

圖3是敲除了pfl基因、ldh基因和mdh基因的E.coli K12(Δpfl,Δldh,Δmdh)突變體的菌落PCR驗證圖；

圖4是基于表達載體pTrc99a的重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程示意圖。

本發(fā)明所述生物材料，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CM-MA-184，已于2016年9月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為：CCTCC NO：M 2016455，保藏地址為：中國.武漢.武漢大學。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。

實施例中所用出發(fā)菌株Escherichia coli K12購自ATCC(NO.53678)；所用pIJ773質(zhì)粒和pKD46質(zhì)粒由英國約翰恩尼斯中心(John Innes Centre,Norwich Research Park,Colney,Norwich NR47UH,UK)提供；所用pTrc99a質(zhì)粒購自Addgene公司。

實施例1

本實施例說明利用RED重組技術(shù)敲除pfl，ldh和mdh三基因后，重組菌與出發(fā)菌株Escherichia coli K12在菌落PCR鑒定時，電泳圖譜的區(qū)別，說明三基因的敲除成功，其大致過程如下：

(1)以pIJ773質(zhì)粒為模板，pKD46為重組酶誘導(dǎo)表達質(zhì)粒，采用RED重組技術(shù)，無痕敲除pfl，ldh和mdh三基因，pfl，ldh和mdh三基因的敲除順序不影響技術(shù)效果；

基因敲除步驟及過程參考“Gust B,Kieser T,Chater K(2002)PCR targeting system in Streptomyces coelicolor A3(2).The John Innes Foundation,Norwich”。

(2)采用Escherichia coli K12為對照菌株，分別采用三對引物對基因敲除過程中的陽性菌進行菌落PCR鑒定，驗證pfl，ldh和mdh三基因時采用的引物序列如下：

(I)驗證pfl基因：上游引物5’-GAGGATGCGGAAAAAATTCAACTC-3’，

下游引物5’-TAGTAGTGCAAATGTCCTAATACGG-3’；

PCR體系(20uL體系)：H₂O 13.3uL，Buffer 2uL，dNTP 1.6uL，MgCl₂1.6uL，上下游引物各0.5uL，Ex-Taq 0.5uL，牙簽點取單菌落；

PCR條件：95℃，10分鐘；(94，45秒，54，45秒，72，100秒，30次循環(huán))；72，10分鐘。

(II)驗證ldh基因：上游引物5’-CTTAAATGTGATTCAACATCACTG-3’，

下游引物5’-CGTAACAGCAATTTTGTCATTAC-3’；

PCR體系(20uL體系)：H₂O 13.3uL，Buffer 2uL，dNTP 1.6uL，MgCl₂1.6uL，上下游引物各0.5uL，Ex-Taq 0.5uL，牙簽點取單菌落；

PCR條件：95℃，10分鐘；(94，45秒，52，45秒，72，100秒，30次循環(huán))；72，10分鐘。

(III)驗證mdh基因：上游引物5’-CTTGCGTGACTACACATTCTTGAG-3’，

下游引物5’-AAGGGATCGTGGTTAATGAAGTGT-3’；

PCR體系(20uL體系)：H₂O 13.3uL，Buffer 2uL，dNTP 1.6uL，MgCl₂1.6uL，上下游引物各0.5uL，Ex-Taq 0.5uL，牙簽點取單菌落；

PCR條件：95℃，10分鐘；(94，45秒，55，45秒，72，100秒，30次循環(huán))；72，10分鐘。

菌落PCR的電泳鑒定圖依次如圖1，圖2，圖3所示，圖1E.coli K12(Δpfl)突變體的菌落PCR驗證，圖2E.coli(Δpfl,Δldh)突變體的菌落PCR驗證，圖3E.coli(Δpfl,Δldh,Δmdh)突變體的菌落PCR驗證。

實施例2

本實施例說明構(gòu)建具有高活性磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和L-酒石酸脫水酶重組菌株的過程，其大致過程如圖4，包括：

(1)采用化學合成的方式人工合成一段如SEQ ID NO：1所示的序列，合成的序列上下游分別帶有EcoR I和Xba I酶切位點，并依次含有來源于枯草芽孢桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因(pck基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)和來源于大腸桿菌的L-酒石酸脫水酶基因的序列(ttd1、ttd2基因，ttd1、ttd2基因分別為L-酒石酸脫水酶基因的兩個亞基，敲除了兩個亞基中原有的一段序列后獲取ttd1、ttd2基因，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示)。序列的化學合成由金斯瑞公司完成。

(2)合成的基因序列和表達質(zhì)粒pTrc99a分別用EcoR I和Xba I雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-pck-ttd1-ttd2。

2、將質(zhì)粒pTrc99a-pck-ttd1-ttd2導(dǎo)入實施例1中E.coli(Δpfl,Δldh,Δmdh)感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為本發(fā)明的新構(gòu)建菌株。

其中，感受態(tài)的構(gòu)建方法、具體導(dǎo)入步驟、陽性轉(zhuǎn)化子獲取步驟包括：

(a)接種E.coli(Δpfl,Δldh,Δmdh)單菌落于5mL LB培養(yǎng)液，37℃，200r/min培養(yǎng)8h或過夜。

(b)將2.5mL培養(yǎng)液加到裝有500mL LB培養(yǎng)液的2L三角瓶中，37℃，200r/min培養(yǎng)，每隔20min測量一次OD₆₀₀值。

(c)當OD₆₀₀為0.3～0.4時，迅速將細菌培養(yǎng)液放在冰水浴中冷卻10～15min，然后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1L離心瓶中，于4℃，5,000r/min離心20min，沉淀用5mL預(yù)冷的水溶解。

(d)加入500mL冰冷的水，重懸并混勻，按步驟(c)重復(fù)離心1次，立即將上清倒掉，用殘余的液體重新懸浮細胞。

(e)取50μL感受態(tài)細胞，質(zhì)粒pTrc99a-pck-ttd1-ttd2約50～100ng，電擊條件：200Ω，25μF，電擊電壓1.25kV，電擊時間4～5ms，電擊后迅速加入預(yù)冷的1mL SOC，37℃，200r/min培養(yǎng)1h，之后涂于帶氨芐青霉素抗性的平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

3、用甘油保存的方式保存陽性轉(zhuǎn)化子，其過程包括：

(a)用牙簽取能在氨芐青霉素抗性的平板上生長的陽性轉(zhuǎn)化子單菌落，5mL LB培養(yǎng)液，37℃，200r/min培養(yǎng)8h或過夜。

(b)將2.5mL培養(yǎng)液加到裝有500mL LB培養(yǎng)液的2L三角瓶中，37℃，200r/min培養(yǎng)，每隔20min測量一次OD₆₀₀值。

(c)當OD₆₀₀為0.8～1.2時，與500mL甘油含量為30％的無菌水混合，1.5mL分裝后于-80℃凍存管保存。

實施例3

本實施例說明新構(gòu)建的重組大腸桿菌在電化學反應(yīng)器中發(fā)酵制備L-酒石酸的應(yīng)用，發(fā)酵過程包括：

(S1)取實施例2中保存的凍存管，按體積分數(shù)為1～2％從凍存管取菌液轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，有氧培養(yǎng)10～12h；

(S2)將S1獲取的培養(yǎng)液按體積分數(shù)為1～2％轉(zhuǎn)接到種子發(fā)酵罐的LB培養(yǎng)基中；

(S3)待菌體OD₆₀₀至2.5～4時，將培養(yǎng)液按體積比5～10％接種至電化學反應(yīng)器的陽極，陽極裝發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：煙酸0.1mM；檸檬酸3.0g/L；Na₂HPO₄·7H₂O 3.00g/L；KH₂PO₄ 8.00g/L；(NH₄)₂HPO₄ 20.00g/L；NH₄Cl 10g/L；(NH₄)₂SO₄ 5g/L；MgSO₄·7H₂O 1.00g/L；CaCl₂·2H₂O 10.0mg/L；ZnSO₄·7H₂O 0.5mg/L；CuCl₂·2H₂O 0.25mg/L；MnSO₄·H₂O 2.5mg/L；CoCl₂·6H₂O 1.75mg/L；H₃BO₃ 0.12mg/L；Al₂(SO₄)₃·xH₂O 1.77mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/L；Fe(III)citrate 16.1mg/L；中性紅0.1mM，溶劑為水，滅菌后用氨水調(diào)節(jié)pH為7.0，其中60g/L葡萄糖單獨滅菌后加入。

其中，種子液培養(yǎng)過程中，步驟(S1)和(S2)中，培養(yǎng)溫度為35～37℃。步驟(S3)中采用厭氧發(fā)酵模式，過程中需通二氧化碳氣體維持厭氧環(huán)境。陽極的厭氧發(fā)酵過程維持溫度在30～32℃，培養(yǎng)過程pH用氨水調(diào)節(jié)為6.8～7.0。電化學反應(yīng)裝置陰極的配方為：磷酸鹽緩沖液(100mM，pH 6.8)，NaCl 6g/L。

重組菌株CM-MA-184在普通發(fā)酵罐和電化學反應(yīng)器中厭氧發(fā)酵48h后的結(jié)果見表1。

表1重組菌株不同發(fā)酵條件下發(fā)酵產(chǎn)酸情況

序列表

<110> 南京工業(yè)大學

<120> 一株產(chǎn)L-酒石酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

<130> xb16121201

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3968

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 1

ttgacgtttt gttgcctatt gtccgaatgt taagtgttaa tggtgggaaa tctgggaaag 60

ttgccccctg gaatgtgtga taattgccca aatctgaacc caatggccat ggacggggaa 120

tgaactgtcg ggggacggtt gaggttaatt cttgaaacca cccccaaaat aggctattaa 180

aacgggtgct ctcatattaa agaaagtgtg tagatgcgtg tgggcagggg gtaggtccac 240

tggtaatgac aaatgtgtcc gttgtctcac ctaaagtttt aactagttct gtatctgaaa 300

gctacgctag ggggcgagaa ctctgtcgaa tgacacaaaa tctggagaag taatgactac 360

tgctgcaatc aggggccttc agggtgaggc gccgaccaag aataaggaac tgctgaactg 420

gatcgcagac gccgtcgagc tcttccagcc tgaggctgtt gtgttcgttg atggatccca 480

ggctgagtgg gatcgcatgg cggaggatct tgttgaagcc ggtaccctca tcaagctcaa 540

cgaggaaaag cgtccgaaca gctacctagc tcgttccaac ccatctgacg ttgcgcgcgt 600

tgagtcccgc accttcatct gctccgagaa ggaagaagat gctggcccaa ccaacaactg 660

ggctccacca caggcaatga aggacgaaat gtccaagcat tacgctggtt ccatgaaggg 720

gcgcaccatg tacgtcgtgc ctttctgcat gggtccaatc agcgatccgg accctaagct 780

tggtgtgcag ctcactgact ccgagtacgt tgtcatgtcc atgcgcatca tgacccgcat 840

gggtattgaa gcgctggaca agatcggcgc gaacggtagc ttcgttaagt gcctccactc 900

cgttggtgct cctttggagc caggccagga agacgttgca tggccttgca acgacaccaa 960

gtacatcacc cagttcccag agaccaagga aatttggtcc tacggttccg gctacggcgg 1020

aaacgcaatt ctggcaaaga agtgctacgc actgcgtatc gcatctgtca tggctcgcga 1080

agaaggctgg atggctgagc acatgctcat cctgaagctg atcaacccag agggcaaggc 1140

gtaccacatc gcagcagcat tcccatctgc ttgtggcaag accaacctcg ccatgatcac 1200

tccaaccatc ccaggctgga ccgctcaggt tgttggcgac gacattgctt ggctgaagct 1260

gcgcgaggac ggcctctacg cagttaaccc agaaaacggt ttcttcggtg ttgctccagg 1320

caccaactac gcatctaacc caatcgcgat gaagaccatg gaaccaggca acaccctgtt 1380

caccaacgtg gcactcaccg acgacggcga catctggtgg gagggcatgg atggcgacgc 1440

ccccgctcac ctcattgact ggaagggtaa cgactggacc ccagagtccg acgaaaacgc 1500

tgctcaccct aactcccgtt actgcgtagc aatcgaccag tccccagcag cagcacctga 1560

gttcaacgac tgggaaggcg tcaagatcga cgcaatcctc ttcggtggac gtcgcgcaga 1620

caccgtccca ctggttactc agacctacga ctgggagcac ggcaccatgg ttggtgcact 1680

gctcgcatcc ggtcagaccg cagcttccgc agaagcaaag gtcggcacac tccgccacga 1740

cccaatggca atgctcccat tcattggcta caacgctggt gaatacctgc agaactggat 1800

tgacatgggc aacaagggtg gcgacaagat gccatccatc ttcctggtca actggttccg 1860

ccgtggcgaa gatggacgct tcctgtggcc tggcttcggc gacaactccc gcgttctgaa 1920

gtgggtcatc gaccgcatcg aaggccgcgt tggcgcagac gagaccgttg ttggacacac 1980

cgctaaggct gaagacctcg acctcgacgg cctcgacacc ccaattgagg atgtcaagga 2040

agcactgacc gctcctgcag agcagtgggc gaacgacgtt caagacaacg ccgagtacct 2100

cactttcctc ggaccacgtg ttcctgcaga ggttcacagc cagttcgatg ctctgaaggc 2160

ccgcatttca gcagctcacg cttaaagttc acgcttaaga actgctaaat aacaagaaag 2220

gctcccgaaa gggagccttt cttgtcgtta agcgatgaat tcctcaaaac ctcagtgctt 2280

tttaaacacc aacaccaagt tacttaccgc gaattctcgg agcactggga ctttaaccat 2340

ccaccaggcc caatacgggt ggtagcgggg aaaagcggca accaattccg cattgcccac 2400

ggaggctccc cattccagcc cctcccggca ggacacatta aacagtgaca tgatgagcga 2460

aagtaataag caacaggcag tgaataagtt gacagagatt gtcgctaact ttaccgccat 2520

gatttctacc cgaatgcctg atgacgtggt ggataaacta aaacagctaa aggatgccga 2580

aacgtcgtcg atggggaaaa ttatctacca tacgatgttc gacaacatgc aaaaagcgat 2640

tgacctgaat cgtcctgcct gtcaggacac cggggagatt atgttcttcg ttaaagtcgg 2700

ttcccgcttc ccactgcttg gcgagctgca aagcatactc aaacaagccg tggaagaggc 2760

aaccgtcaaa gcgccactac gtcacaatgc ggtagaaatt tttgacgaag taaacaccgg 2820

caaaaatacc ggtagcggcg taccgtgggt cacctgggac atcatccccg acaatgacga 2880

tgcggaaatc gaagtttaca tggcaggcgg cggctgcacg ctacctggcc gctcgaaagt 2940

gttaatgccg tcagaaggct acgaaggcgt ggtgaaattc gtcttcgaaa atatctccac 3000

cctcgccgta aacgcctgtc caccggtact ggtgggcgtg ggcatcgcca cctcggtgga 3060

aaccgccgcc gtactctcgc gtaaagccat tttgcgcccg attggcagcc gccatcccaa 3120

tccaaaagcg gcagaactgg agctacgcct ggaagaagga ctcaaccgtc tggggattgg 3180

tccacaaggg ctgaccggca acagttcagt gatgggcgta catatcgaat ctgccgcccg 3240

ccatccgtca accatcggcg ttgctgtctc taccggctgc tgggcgcatc gtcgcggcac 3300

gctgctggtt catgccgatc tcacctttga aaatctgtct cacacccgga gcgcgttaat 3360

gaaaaagatc ctgacaaccc cgatcaaagc tgaagatctg caagatattc gcgtcggcga 3420

tgtgatctac ctgaccggta cgctggtgac ctgccgcgac gtttgtcacc gccgtttgat 3480

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atagatct 3968

<210> 2

<211> 2449

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 2