本發(fā)明涉及一株過(guò)表達(dá)lae1基因的木霉工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

木霉(Trichoderma spp.)是一類重要的真菌資源，是工業(yè)上重要的酶制劑生產(chǎn)菌株，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的生防制劑和植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑的生產(chǎn)菌株。木霉能夠產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在木霉與病原生物、木霉與植物的相互作用過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

Peptaibols是絲狀真菌產(chǎn)生的一類富含α-氨基異丁酸(Aib)的特殊肽類次級(jí)代謝產(chǎn)物，其分子量通常在500～2200Da，含有5～20個(gè)氨基酸殘基，多數(shù)為15～20個(gè)殘基；其N-末端烷基化(通常乙?；?，C-末端羥基化，通常為苯丙氨醇(Benedetti et al.,1982)。Peptaibols兩親性的結(jié)構(gòu)特性使其多個(gè)分子在脂雙層膜上能夠形成電荷依賴的離子通道，是研究生物大分子與生物膜相互作用的重要生物活性肽。研究還發(fā)現(xiàn)peptaibols具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等多種生物學(xué)活性，其在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域都具有很好的應(yīng)用潛力。

木霉是peptaibols類次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要產(chǎn)生菌株，已發(fā)現(xiàn)的peptaibols 80％來(lái)源于木霉屬真菌，尤其是T.viride，T.brevicompactum，T.virens，T.parceramosum和T.harzianum。我們篩選到的木霉SMF2菌株能夠產(chǎn)生含有20個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)鏈peptaibols組分Trichokonins A和含有11個(gè)氨基酸殘基的中長(zhǎng)鏈peptaibols組分Trichokonins B，其中產(chǎn)量最高的組分是長(zhǎng)鏈peptaibols組分Trichokonin VI。研究發(fā)現(xiàn)，Trichokonin VI具有廣譜的抗菌活性，能夠抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)真菌細(xì)胞的程序化死亡；通過(guò)激活Ca²⁺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起肝癌細(xì)胞系HepG2的凋亡和自噬；通過(guò)激活以水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為主的防御反應(yīng)機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等多種生物學(xué)活性。

Peptaibols是非核糖體合成肽，含有大量的非蛋白源的氨基酸殘基，不能采用現(xiàn)有的多肽化學(xué)合成方法生產(chǎn)，因此生物合成是其主要的生產(chǎn)方法，但目前的產(chǎn)量較低，缺乏高效的生產(chǎn)菌株。Sigma aldrich公司的Alamethicin是僅有的商品化peptaibols，且價(jià)格昂貴，無(wú)法滿足peptaibols在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株過(guò)表達(dá)lae1基因的木霉工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一株過(guò)表達(dá)lae1基因的木霉工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)從木霉SMF2提取基因組DNA，然后以制得的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得lae1基因ORF區(qū)及終止子序列；所述lae1基因ORF區(qū)及終止子序列的PCR特異引物序列如下：

lae1OE-F：CATGccatggCCTCTCGAAACGCTCCCAAC；

lae1OE-R：CCCaagcttCTAGCTAACCTGTTGCTGTAC；

(2)將步驟(1)制得的lae1基因ORF區(qū)及終止子序列經(jīng)NcoI和HindIII雙酶切后，與同樣經(jīng)NcoI和HindIII雙酶切的載體pIG-1783進(jìn)行連接，制得重組質(zhì)粒；

(3)將步驟(2)制得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含氨芐青霉素Amp的LB培養(yǎng)基篩選，提取重組表達(dá)載體，制得過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pIG1783-lae1OE；

(4)將步驟(3)制得的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pIG1783-lae1OE經(jīng)HindIII酶切線性化，然后轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，經(jīng)再生、初篩、復(fù)篩，制得過(guò)表達(dá)lae1基因的木霉工程菌。

所述步驟(1)中木霉SMF2基因組DNA的提取參照真菌DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.^TMFungal DNA Mini Kit，OMEGA)說(shuō)明書進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中l(wèi)ae1基因ORF區(qū)及終止子序列的PCR擴(kuò)增體系如下，總體系為50μL：

所述PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中NcoI和HindIII雙酶切反應(yīng)體系如下，總體系為20μL：

NcoI和HindIII雙酶切反應(yīng)條件為：37℃溫浴30min。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的連接采用T4連接酶進(jìn)行連接，反應(yīng)條件為：16℃連接過(guò)夜。連接反應(yīng)體系參照Promega公司的T4連接酶試劑盒，反應(yīng)體系為10μL。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞的步驟如下：

取-80℃保存的E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞冰浴融化，將重組質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min；42℃熱激90s，冰浴2～3min；然后在LB培養(yǎng)基中37℃搖床振蕩培養(yǎng)40～50min，4000rpm離心1min，棄掉上清，重懸菌體沉淀，即得。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中氨芐青霉素的濃度為100μg/mL，篩選條件為：37℃，200rpm培養(yǎng)12～20h。

所述步驟(3)中提取重組表達(dá)載體用質(zhì)粒小量提取試劑盒(E.Z.N.A Plasmid Miniprep Kit，OMEGA)提取質(zhì)粒，具體步驟見(jiàn)質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書，提取的質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證后獲得過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中HindIII酶切線性化的體系如下：

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中原生質(zhì)體的制備步驟如下：

將木霉SMF2的孢子接種于菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，28℃、160rpm培養(yǎng)13h；將菌絲培養(yǎng)物4000rpm離心5min，用0.7M NaCl洗三次，每次25mL，加入細(xì)胞壁裂解酶液，重懸，30℃、60rpm酶解2.5～3h，過(guò)濾，濾液中加入預(yù)冷的濃度為0.7M的NaCl溶液，NaCl溶液加入量為5.7mL，4℃，3800rpm離心5min收集原生質(zhì)體，收集到的原生質(zhì)體用20mL預(yù)冷的0.7M的STC溶液洗兩次后加入600μL預(yù)冷的STC溶液重懸，使原生質(zhì)體濃度為5×10⁷～5×10⁸個(gè)/mL；

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述細(xì)胞壁裂解酶液按如下方法配制：

0.24g細(xì)胞壁裂解酶，溶于5.7mL濃度為0.7M的NaCl溶液中，過(guò)濾除菌，加入0.3mL pH5.8的PBS緩沖液。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述STC溶液成分如下：

0.7M D-Sorbitol(D-S山梨糖醇)，0.05M CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH 7.5。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中的轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，步驟為：

取150μL線性質(zhì)粒溶液和150μL原生質(zhì)體混勻加入到100mL離心管底部，冰浴20min后逐滴加入1.5mL PTC溶液，冰浴20min，再室溫放置20min；加入STC溶液清洗，4℃，4000rpm離心5min后棄上清。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述PTC溶液組分如下：

600g/L PEG 4000(聚乙二醇4000)，10mMTris-HCl，10mM CaCl₂，pH 7.5；

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中再生，步驟為：

將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體經(jīng)液體再生培養(yǎng)基重懸，28℃過(guò)夜；然后轉(zhuǎn)接至含100μg/mL潮霉素B的固體再生培養(yǎng)基混勻，28℃培養(yǎng)16h；

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中初篩，步驟為：

將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入含100μg/mL潮霉素B的固體再生培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48h左右，直至出轉(zhuǎn)化子；

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中復(fù)篩，步驟為：

將轉(zhuǎn)化子由固體再生培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)入含100μg/mL潮霉素B的復(fù)篩培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)至PDA平板上；

上述培養(yǎng)基按如下方法配制：

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮，稱取200g，切塊加適量水煮沸30min，4層紗布過(guò)濾，加入葡萄糖20g，加蒸餾水定容到1L；115℃，30min滅菌。

PDA培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分比為2％瓊脂粉；115℃，30min滅菌。

菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分比為1.5％的酵母提取物；115℃，30min滅菌。

液體再生培養(yǎng)基：菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入蔗糖至濃度為1M；115℃，30min滅菌。

固體再生培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基中加入蔗糖至濃度為0.7M，加入瓊脂粉至濃度為7g/L；115℃，30min滅菌。

復(fù)篩培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中加入潮霉素B至濃度為100μg/mL。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，復(fù)篩后還包括PCR篩選步驟：

提取SMF2及轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出質(zhì)粒pIG-1783-lae1上啟動(dòng)子Pgpd到lae1終止子的整段序列；

所述PCR篩選的引物序列如下：

YZlae1OE-F：GATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTG；

YZlae1OE-R：CTAGCTAACCTGTTGCTGTAC；

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述PCR體系如下，反應(yīng)體系為20μL：

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述PCR反應(yīng)程序如下：

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，復(fù)篩后還包括RT-PCR篩選步驟：

提取SMF2和轉(zhuǎn)化子的RNA，用紫外微量分光光度計(jì)Nano-100測(cè)定其純度和濃度。

提取SMF2和轉(zhuǎn)化子的RNA參見(jiàn)TaKaRa的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒。

用TaKaRa的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行DNA的去除和反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)測(cè)定的RNA樣品的濃度，依照試劑盒說(shuō)明書去除樣品中的DNA，反應(yīng)體系為10μL，每個(gè)體系加入2μg總RNA，42℃溫育2min或室溫5min。將去除DNA的RNA樣品依照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20μL，37℃溫育15min，85℃，5s。反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，復(fù)篩后還包括qRT-PCR篩選步驟：

取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，tef1基因作為內(nèi)參基因(Seiboth et al.,2012)。

按照TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq^TM試劑盒進(jìn)行qRT-PCR分析，PCR儀為Roche公司的LightCycler 480II，數(shù)據(jù)分析采用LC480軟件；作圖時(shí)，tef1基因的表達(dá)量轉(zhuǎn)換為1，其它基因的表達(dá)量進(jìn)行等比例的轉(zhuǎn)換；qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行60℃～95℃熔解曲線分析。

進(jìn)一步優(yōu)選的，上述所述的qRT-PCR反應(yīng)體系如下，反應(yīng)體系為20μL：

進(jìn)一步優(yōu)選的，上述所述的qRT-PCR反應(yīng)程序如下：

95℃預(yù)變性30s；PCR反應(yīng)95℃變性5s，55℃退火20s，72℃延伸20s，45個(gè)循環(huán)。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的qRT-PCR的引物序列如下：

tef1-F：CCACATTGCCTGCAAGTTCGC；

tef1-R：GTCGGTGAAAGCCTCAACGCAC；

RTlae1-F：CATGAGCATGATGCCGATGAGTGAC；

RTlae1-R：CTAGATAGCGGTAGCATCCGAGTC。

上述構(gòu)建方法獲得的過(guò)表達(dá)lae1基因的木霉工程菌。

上述構(gòu)建方法獲得的過(guò)表達(dá)lae1基因的木霉工程菌含有強(qiáng)啟動(dòng)子Pgpd，可以實(shí)現(xiàn)絲狀真菌通用轉(zhuǎn)錄因子Lae1的過(guò)表達(dá)，木霉peptaibols的產(chǎn)量提高，長(zhǎng)鏈peptaibols和中長(zhǎng)鏈peptaibols的產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比分別提高了68.96％和42.85％，其菌落形態(tài)開(kāi)始時(shí)為白色，致密，圓形，向四周擴(kuò)展，生長(zhǎng)一段時(shí)間后從菌落中央產(chǎn)生綠色孢子，中央變成綠色，菌落生長(zhǎng)迅速、有明顯的輪紋，周圍有白色菌絲的生長(zhǎng)帶，4～5d左右整個(gè)菌落全部變成綠色，其色素產(chǎn)量及孢子產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比有所提高。

上述木霉工程菌在制備peptaibols抗菌肽中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用，步驟如下：

將構(gòu)建的過(guò)表達(dá)lae1基因的木霉工程菌接種于PDB培養(yǎng)基，在28℃，180rpm培養(yǎng)24h，制得發(fā)酵液，然后經(jīng)10000rpm離心20min，然后經(jīng)Agela C₁₈固相萃取柱提取后，濃縮，制得peptaibols抗菌肽。

有益效果

1、本發(fā)明首次通過(guò)將強(qiáng)啟動(dòng)子Pgpd、lae1序列及其終止子的功能片段插入載體pIG-1783中，并轉(zhuǎn)化木霉SMF2菌株的原生質(zhì)體，制得可以穩(wěn)定傳代的過(guò)表達(dá)lae1基因的木霉工程菌；

2、本發(fā)明構(gòu)建的過(guò)表達(dá)lae1基因的木霉工程菌能夠顯著提高木霉peptaibols的產(chǎn)量，其中長(zhǎng)鏈peptaibols和中長(zhǎng)鏈peptiabols的產(chǎn)量分別比出發(fā)菌株提高68.96％和42.85％，有助于木霉peptaibols在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1 lae1基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pIG1783-lae1OE圖譜；

圖2、lae1基因過(guò)表達(dá)菌株的PCR電泳結(jié)果照片；

圖3、lae1基因過(guò)表達(dá)菌株lae1OE-16菌落形態(tài)照片；

其中，左圖為培養(yǎng)3天后菌落形態(tài)照片，右圖為培養(yǎng)5天后菌落形態(tài)照片；

圖4 lae1OE-16菌株中l(wèi)ae1基因表達(dá)量的qRT-PCR分析柱狀圖；

圖5 SMF2菌株和lae1OE-16菌株peptaibols的HPLC分析峰值圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

生物材料來(lái)源：

木霉(Trichoderma)SMF2來(lái)源于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種編號(hào)CCTCC NO:M209031；

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α購(gòu)自寶生物公司；

過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建質(zhì)粒pIG-1783的構(gòu)建按照Stefanie Poggeler等和Peter W.Inglis等(Curr.Genet.,(2003)43:54–61；J.Gen.Appl.Microbiol.,(1999)45,63–67)中構(gòu)建獲得；

真菌基因提取試劑盒：E.Z.N.A Fungal DNA Kit，OMEGA公司，美國(guó)；

質(zhì)粒小量提取試劑盒：E.Z.N.A Plasmid Miniprep Kit，OMEGA公司，美國(guó)；

瓊脂糖凝膠回收試劑盒：E.Z.N.A Gel Extraction Kit，OMEGA公司，美國(guó)；

T4連接酶試劑盒：pGEM-T ligation kit，Promega公司，美國(guó)；

Southern雜交試劑盒：DIG High Prime DNA Labeling and Dectection Starter Kit I，Roche公司，德國(guó)；

RT-PCR試劑盒：PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)，TaKaRa公司，日本；

qPCR試劑盒：SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)，TaKaRa公司，日本；

pMD^TM-19T，TaKaRa公司，日本；

普通瓊脂糖、抗生素：上海生工，中國(guó)；

Fast Pfu DNA Polymerase、DNA Marker、dNTP mix等：TransGen Biotech公司，中國(guó)；

限制性核酸內(nèi)切酶：Fermentas公司，美國(guó)；

裂解酶：Sigma公司；

潮霉素B：Roche公司，德國(guó)；

Trizol Reagent：invitrogen公司，美國(guó)；

DEPC水：生工生物，中國(guó)；

所用抗生素購(gòu)自Merck公司；

甲醇購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

培養(yǎng)基配制原料均為本領(lǐng)域常用原料，可市場(chǎng)購(gòu)得；

DNA測(cè)序在北京博尚生物技術(shù)有限公司完成；

引物合成在華大基因完成；

實(shí)施例1

lae1基因ORF區(qū)及終止子序列的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建，步驟如下：

1lae1基因ORF區(qū)及終止子序列的克隆

1.1木霉SMF2基因組DNA的提取

參照真菌DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.^TM Fungal DNA Mini Kit，OMEGA)說(shuō)明書提取基因組DNA。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)lae1基因序列設(shè)計(jì)兩條引物：

lae1OE-FCATGccatggCCTCTCGAAACGCTCCCAAC

lae1OE-RCCCaagcttCTAGCTAACCTGTTGCTGTAC

由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.3利用PCR進(jìn)行基因序列擴(kuò)增及產(chǎn)物回收

(1)以F和R為引物，以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。

PCR擴(kuò)增體系(50μL)如下：

(2)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果獲得一條約2169bp的DNA片段(圖1)。然后用Omega公司的DNA回收試劑盒按照其說(shuō)明回收擴(kuò)增出的DNA片段，獲得基因lae1的ORF區(qū)及終止子序列。

2.過(guò)表達(dá)載體及過(guò)表達(dá)菌株的構(gòu)建

(1)DNA片段與表達(dá)載體酶切

將回收得到的包含lae1ORF區(qū)和lae1終止子序列的DNA片段和載體pIG-1783用NcoI和HindIII雙酶切，酶切反應(yīng)體系如下：

蓋緊蓋子，手指輕彈離心管，混勻樣品，在離心機(jī)上瞬時(shí)離心2sec，把樣品集中在管底，37℃溫浴30min。

(2)對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切膠，然后用Omega公司的DNA回收試劑盒按照其說(shuō)明書回收目的DNA片段。

(3)DNA片段與表達(dá)載體連接

連接反應(yīng)體系參照Promega公司的T4連接酶試劑盒，反應(yīng)體系為10μL。

蓋緊蓋子，手指輕彈離心管，混勻樣品，在離心機(jī)上瞬時(shí)離心2sec，把樣品集中在管底，16℃連接過(guò)夜。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取-80℃保存的E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞冰浴融化，將10μL連接體系全部加入50μL的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42℃熱激90s，立刻轉(zhuǎn)入冰上冰浴2～3min，加入500μL液體淡水LB培養(yǎng)基，37℃水浴15～20min，然后轉(zhuǎn)至37℃搖床振蕩培養(yǎng)40～50min，培養(yǎng)結(jié)束后，4000rpm離心1min，棄掉400μL上清，用留存的100μL上清重懸菌體沉淀。將重懸后的菌液全部涂布到含100μg/mL氨芐青霉素LB平板上，37℃培養(yǎng)12～20h。

挑取LB轉(zhuǎn)化平板上的菌落轉(zhuǎn)接到含100μg/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)12～20h。

用質(zhì)粒小量提取試劑盒(E.Z.N.A Plasmid Miniprep Kit，OMEGA)提取質(zhì)粒，具體步驟見(jiàn)質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書，提取的質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證后獲得過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。上述重組過(guò)表達(dá)質(zhì)粒包含有強(qiáng)啟動(dòng)子Pgpd、lae1序列及其終止子的功能片段，如圖1所示。

實(shí)施例2

過(guò)表達(dá)菌株的構(gòu)建，步驟如下：

(1)木霉SMF2菌株的原生質(zhì)體制備

將木霉SMF2的孢子接種于菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，28℃，160rpm培養(yǎng)13h；然后4000rpm離心5min，用濃度0.7M的NaCl溶液水洗三次，，每次25mL，加入細(xì)胞壁裂解酶液6mL(0.24g細(xì)胞壁裂解酶，溶于5.7mL 0.7M NaCl溶液中，過(guò)濾除菌，加入0.3mL PBS緩沖液，pH＝5.8)，重懸，30℃，60rpm酶解3h。酶解液用三層顯微鏡擦鏡紙過(guò)濾，在濾過(guò)液中加入20mL濃度0.7M的NaCl溶液，4℃，3800rpm離心5min收集原生質(zhì)體，收集到的原生質(zhì)體用濃度0.7M的STC溶液水洗兩次，每次15mL，后加入600μLSTC溶液重懸，使原生質(zhì)體濃度為5×107～5×10⁸個(gè)/mL備用。以上操作均置于冰上進(jìn)行，濃度0.7M的NaCl溶液、濃度0.7M的STC溶液均應(yīng)提前預(yù)冷。

(2)原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化與再生

載體線性化：用HindIII酶切l(wèi)ae1基因過(guò)表達(dá)載體pIG1783-lae1OE并使其線性化，酶切后用預(yù)冷的濃度為0.7M的STC溶液稀釋；

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：取150μL線性質(zhì)粒溶液和150μL原生質(zhì)體混勻后加入到100mL離心管底部，冰浴20min后逐滴加入1.5mL PTC，冰浴20min，在室溫放置20min，取500μL～600μL液體再生培養(yǎng)物均勻的加入到90mm平皿中，然后倒入適量的固體再生培養(yǎng)基(含100μg/mL潮霉素B)混勻后28℃培養(yǎng)。

原生質(zhì)體再生與初篩：固體再生培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)接到復(fù)篩培養(yǎng)基，挑取生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基。

(3)轉(zhuǎn)化子的篩選與驗(yàn)證，獲得過(guò)表達(dá)菌株lae1OE。

將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證采用采用單孢分離的方法進(jìn)行純化。

YZlae1OE-F：GATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTG

YZlae1OE-R：CTAGCTAACCTGTTGCTGTAC

PCR反應(yīng)體系為20μL，具體反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參見(jiàn)GenStar2×Taq PCR StarMix說(shuō)明書。

上述培養(yǎng)基按如下方法配制：

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮，稱取200g，切塊加適量水煮沸30min，4層紗布過(guò)濾，加入葡萄糖20g，加蒸餾水定容到1L；115℃，30min滅菌。

PDA培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分比為2％瓊脂粉；115℃，30min滅菌。

菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分比為1.5％的酵母提取物；115℃，30min滅菌。

液體再生培養(yǎng)基：菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入蔗糖至濃度為1M；115℃，30min滅菌。

固體再生培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基中加入蔗糖至濃度為0.7M，加入瓊脂粉至濃度為7g/L；115℃，30min滅菌。

復(fù)篩培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中加入潮霉素B至濃度為100μg/mL。

實(shí)施例3

過(guò)表達(dá)菌株lae1表達(dá)量及peptaibols產(chǎn)量的分析，步驟如下：

(1)過(guò)表達(dá)菌株的的發(fā)酵培養(yǎng)

從培養(yǎng)5d左右的平板上刮取適量的孢子，配制成孢子懸液，使孢子濃度達(dá)到10⁸個(gè)/mL，然后接種到含有100mL PDB培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，每瓶接種1mL孢子懸液，每個(gè)菌株接種5瓶，28℃，180rpm培養(yǎng)24h。

(2)過(guò)表達(dá)菌株中l(wèi)ae1表達(dá)量的qPCR分析

使用TRizol試劑提取真菌總RNA。用TaKaRa的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20μL，方法參照說(shuō)明書。

按照TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq^TM試劑盒進(jìn)行qRT-PCR分析，實(shí)驗(yàn)程序參照說(shuō)明書。

1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于隨后的qRT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20μL，tef1基因作為內(nèi)參基因。qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行60℃～95℃熔解曲線分析。

用于qRT-PCR分析的引物如下：

tef1-F：CCACATTGCCTGCAAGTTCGC；

tef1-R：GTCGGTGAAAGCCTCAACGCAC；

RTlae1-F：CATGAGCATGATGCCGATGAGTGAC；

RTlae1-R：CTAGATAGCGGTAGCATCCGAGTC。

qPCR反應(yīng)體系如下：

qRT-PCR反應(yīng)條件如下：

95℃預(yù)變性30s；PCR反應(yīng)95℃變性5s，55℃退火20s，72℃延伸20s，45個(gè)循環(huán)。

(3)過(guò)表達(dá)菌株peptaibols產(chǎn)量的HPLC分析

將培養(yǎng)液10000rpm離心20min得到的用Agela C₁₈固相萃取柱(500mg/6mL)進(jìn)行的peptaibols提取與濃縮。濃縮后的發(fā)酵液用0.22μm的針頭濾器過(guò)濾后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，流動(dòng)相為甲醇和超純水(加入0.1％TFA)，甲醇與水的比例為84:16，流速為1mL/min，選用watersC₁₈反相色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm，上樣量為15μL。

比較分析結(jié)果表明，木霉SMF2菌株長(zhǎng)鏈peptaibols的產(chǎn)量為0.29mg/mL，短鏈peptaibols的產(chǎn)量為0.18mg/mL，lae1過(guò)表達(dá)菌株peptaibols的產(chǎn)量達(dá)到0.49mg/mL，短鏈peptaibols的產(chǎn)量達(dá)到0.3mg/mL，分別提高了68.96％和42.85％。

上述所用PDB培養(yǎng)基組分如下：馬鈴薯去皮，稱取200g，切塊加適量水煮沸30min，4層紗布過(guò)濾，加入葡萄糖20g，加蒸餾水定容到1L。115℃，30min滅菌。