本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及生產(chǎn)洛伐他汀及莫納可林J的基因工程菌的構(gòu)建與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

心腦血管疾病是一種嚴重威脅人類健康的疾病，其發(fā)病率和死亡率在許多國家和地區(qū)均排名第一，防止心腦血管疾病的一種有效途徑是抑制肝臟膽固醇的過多合成。在膽固醇生物合成途徑中，3-羥基-3-甲基戊二?；?輔酶A(HMG-CoA)還原酶是控制膽固醇合成速度的關(guān)鍵酶，催化由HMG-CoA向甲羥戊酸的轉(zhuǎn)化。因此抑制HMG-CoA還原酶的活性能達到減少或阻斷膽固醇的體內(nèi)合成的目的，從而防治高血脂病。

他汀類藥物通過抑制3-羥基-3-甲基戊二?；?輔酶A(HMG-CoA)還原酶來發(fā)揮作用，而該還原酶是細胞中催化膽固醇生物合成的限制性步驟。洛伐他汀(Lavostatin)和辛伐他汀(Simvastatin)是最常見的降低膽固醇藥物，可以有效降低原發(fā)性高脂血癥患者的TC和LDL-C，預(yù)防心臟病復(fù)發(fā)和動脈粥樣硬化的發(fā)展，降低心肌血管再形成和非致死心肌梗死手術(shù)的危險。

洛伐他汀主要用土曲霉(Aspergillus terreus)或紅曲霉(Monascus rubber)經(jīng)深層發(fā)酵制取，而辛伐他汀是非天然產(chǎn)物，其合成主要包括化學(xué)合成法和生物合成法，化學(xué)合成法包括間接甲基化(側(cè)鏈合成法)和直接甲基化；生物合成法，是莫納可林J(Monacolin J)與側(cè)鏈2，2-二甲基丁酞氯合成法。間接甲基化合成法和生物合成法都需要藥物中間體莫納可林J作為合成底物。

而莫納可林J的合成包括生物發(fā)酵法和化學(xué)水解法。生物發(fā)酵法，是通過分子手段中斷土曲霉(Aspergillus terreus)中的洛伐他汀生物合成途徑，突變后的土曲霉菌株在發(fā)酵過程中積累中間產(chǎn)物代謝物莫納可林J，經(jīng)提取、分離和純化后得到莫納可林J。化學(xué)水解法，是經(jīng)脫酯化、羥基保護、重新酯化、脫 保護四個化學(xué)反應(yīng)步驟將天然產(chǎn)物洛伐他汀經(jīng)水解得到莫納可林J。

上述方法中，生產(chǎn)菌土曲霉(Aspergillus terreus)的次級代謝產(chǎn)物背景多，目標代謝產(chǎn)物得量低、純化復(fù)雜，生產(chǎn)成本高昂；而化學(xué)合成法中，路線步驟多、生產(chǎn)時間長、底物轉(zhuǎn)化率低，且在脫酯化反應(yīng)中的副產(chǎn)物較多，總產(chǎn)率也很低。

因此，還需要進一步地研究和開發(fā)洛伐他汀或其中間產(chǎn)物的其它生產(chǎn)方法，以期簡化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供生產(chǎn)洛伐他汀及莫納可林J的基因工程菌的構(gòu)建與應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種生產(chǎn)洛伐他汀的方法，所述方法包括：

(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中轉(zhuǎn)化有外源的下組基因的表達盒：LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA，LovD，LovF；和

(2)培養(yǎng)(1)的酵母工程菌，從而生成洛伐他汀產(chǎn)物。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種生產(chǎn)洛伐他汀中間體莫納可林J的方法，所述方法包括：

(a)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中轉(zhuǎn)化有外源的下組基因的表達盒：LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA；和

(b)培養(yǎng)(a)的酵母工程菌，從而生成莫納可林J產(chǎn)物。

在一個優(yōu)選例中，所述的LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA，LovD或LovF基因來源于土曲霉。

在另一優(yōu)選例中，所述的LovB基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或其簡并序列，或與SEQ ID NO:1序列有70％以上(較佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的編碼同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的LovC基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或其簡并序列，或與SEQ ID NO:2序列有70％以上(較佳地80％以上；更 佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的編碼同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的LovG基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或其簡并序列，或與SEQ ID NO:3序列有70％以上(較佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的編碼同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的NpgA基因具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或其簡并序列，或與SEQ ID NO:4序列有70％以上(較佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的編碼同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的LovD基因具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或其簡并序列，或與SEQ ID NO:5序列有70％以上(較佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的編碼同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的LovF基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，或其簡并序列，或與SEQ ID NO:6序列有70％以上(較佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的編碼同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的LovA基因具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，或其簡并序列，或與SEQ ID NO:7序列有70％以上(較佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的編碼同功能蛋白的核苷酸序列。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于生產(chǎn)洛伐他汀的酵母工程菌，所述酵母工程菌中包含外源的下組基因的表達盒：LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA，LovD，LovF。

在本發(fā)明的另一方面，提供一一種用于生產(chǎn)洛伐他汀中間體莫納可林J的酵母工程菌，所述酵母工程菌中包含外源的下組基因的表達盒：LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA。

在一個優(yōu)選例中，所述的酵母工程菌是畢赤酵母。

在另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母是畢赤酵母GS115。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于生產(chǎn)洛伐他汀的重組表達載體或表達構(gòu)建物，所述的重組表達載體中包含以下基因的表達盒：LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA，LovD，LovF。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于生產(chǎn)洛伐他汀中間體莫納可林J的重組表達載體或表達構(gòu)建物，所述的重組表達載體中包含以下基因的表達盒：LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種基因組合的用途，所述的基因組合包括下組基因：LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA，LovD，LovF，該基因組合用于制備洛伐他汀中間體或其中間體莫納可林J。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于生產(chǎn)洛伐他汀的試劑盒，所述的試劑盒中包含所述的酵母工程菌。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于生產(chǎn)洛伐他汀中間體莫納可林J的試劑盒，所述的試劑盒中包含所述的酵母工程菌。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、生產(chǎn)莫納可林J重組菌的發(fā)酵產(chǎn)物高效液相色譜分析圖。

A為陰性對照菌株(未轉(zhuǎn)入洛伐他汀聚酮合酶基因)發(fā)酵液樣品的高效液相色譜圖；

B為重組菌株發(fā)酵液樣品的高效液相色譜圖；

C為莫納可林J標準品的高效液相色譜圖。

圖2、生產(chǎn)洛伐他汀重組菌的發(fā)酵產(chǎn)物高效液相色譜分析圖。

A為陰性對照菌株(未轉(zhuǎn)入洛伐他汀聚酮合酶基因)發(fā)酵液樣品的高效液相色譜圖；

B為重組菌株發(fā)酵液樣品的高效液相色譜圖；

C為洛伐他汀標準品的高效液相色譜圖。

圖3、生產(chǎn)莫納可林J和洛伐他汀重組菌株的高密度發(fā)酵圖譜。

A為生產(chǎn)莫納可林J的重組菌株的高密度發(fā)酵過程，記載了隨著發(fā)酵時間變化的細胞生物量，莫納可林J產(chǎn)量。

B為生產(chǎn)洛伐他汀的重組菌株的高密度發(fā)酵圖譜，記載了隨著發(fā)酵時間變化的細胞生物量，莫納可林J產(chǎn)量。

圖4、生產(chǎn)莫納可林J和洛伐他汀重組菌株的遺傳穩(wěn)定性圖譜。

A為生產(chǎn)莫納可林J的重組菌株的傳代次數(shù)及不同代次的菌株的莫納可林J產(chǎn)量；

B為生產(chǎn)洛伐他汀的重組菌株的傳代次數(shù)及不同代次的菌株的洛伐他汀產(chǎn)量。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，通過基因重組技術(shù)在酵母工程菌株中引入了一系列外源基因，獲得可生產(chǎn)洛伐他汀或其中間產(chǎn)物的酵母工程菌。所述酵母工程菌具有代謝背景低、異源表達能力強，可全細胞合成終產(chǎn)物以及終產(chǎn)物易分離且副產(chǎn)物少等特征，為工業(yè)化生產(chǎn)他汀類藥物提供了新思路。

術(shù)語

如本文所用，所述的“表達盒”或“基因表達盒”是指包含有表達目的多肽所需的所有必要元件的基因表達系統(tǒng)，通常其包括以下元件：啟動子、編碼多肽的基因序列，終止子；此外還可選擇性包括信號肽編碼序列等；這些元件是操作性相連的。

如本文所用，所述的“可操作地連接(相連)”或“操作性連接(相連)”是指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如：啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上。

如本文所用，所述的“表達構(gòu)建物”是指重組DNA分子，它包含預(yù)期的核酸編碼序列，其可以包含一個或多個基因表達盒。所述的“構(gòu)建物”通常被包含在表達載體中。

如本文所用，所述的“外源”或“異源”是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系，或者來自不同來源的蛋白(或核酸)與宿主細胞之間的關(guān)系。例如，如果核酸與宿主細胞的組合通常不是天然存在的，則核酸對于該宿主細胞來說是外源的。特定序列對于其所插入的細胞或生物體來說是“外源的”。

基因及其表達系統(tǒng)

本發(fā)明中，通過在酵母工程菌中轉(zhuǎn)化入五基因組合或七基因組合來實現(xiàn)洛伐他汀或其中間體在酵母工程菌中的高效生產(chǎn)。所述的五基因組合包括如下基因：LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA；所述的七基因組合包括如下基因：LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA，LovD和LovF。上述的基因均是本領(lǐng)域已知的基因。

在本發(fā)明中，上述的基因可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自動植物或微生物。此外，所述的基因也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來獲得所述的基因，或者通過人工合成的方法來獲得所述的基因。

上述的基因的核苷酸序列可以與SEQ ID NO:1～7所示的列相同，也可以是它們的簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有同功能的蛋白質(zhì)，但與選自SEQ ID NO:1～7所示的序列有差別的核酸序列。

所述的基因可以包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。

本發(fā)明還涉及所述的基因的變異體，其編碼的多肽與其相應(yīng)的野生型多肽在氨基酸序列上不同，是野生型多肽的片段、類似物或衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。

本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指：(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與相應(yīng)的野生型多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。

應(yīng)理解，雖然本發(fā)明的各基因優(yōu)選獲自土曲霉，但是獲自其它微生物的與土曲霉中相應(yīng)的基因高度同源(如具有70％以上，如80％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。比對序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，例如BLAST。

本發(fā)明的各基因的全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，可以進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。

本發(fā)明也涉及包含所述的多核苷酸的載體，以及用所述的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞。

本發(fā)明中，各基因的序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語“重組表達載體”指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動 物細胞病毒或其他載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。

各基因的序列可以分別插入到重組表達載體中，多個重組表達載體共轉(zhuǎn)宿主細胞；多個基因的表達盒也可以以串聯(lián)的方式插入到同一重組表達載體中，轉(zhuǎn)入宿主細胞。所述的重組表達載體還可包含與所述基因的序列操作性相連的表達調(diào)控序列，以便于蛋白的表達。應(yīng)理解，在本領(lǐng)域人員了解了本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容后，可以方便地構(gòu)建重組表達載體。獲得的重組表達載體也包含在本發(fā)明中。

表達調(diào)控序列或表達盒中，根據(jù)不同的需要，可以應(yīng)用誘導(dǎo)型或組成型的啟動子，誘導(dǎo)型的啟動子可實現(xiàn)更可控的蛋白表達以及化合物生產(chǎn)，有利于工業(yè)化應(yīng)用。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供了一種表達載體(表達構(gòu)建物，)其包括以下基因的表達盒：LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA；并且還提供了種表達載體(表達構(gòu)建物，)其包括以下基因的表達盒：LovD和LovF基因。

表達載體(表達構(gòu)建物)的建立目前已經(jīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的技術(shù)。因此，在得知了所需選擇的基因之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于進行表達構(gòu)建物的建立?；蛐蛄锌梢员徊迦氲讲煌谋磉_構(gòu)建物(如表達載體)中，也可以被插入到同一表達構(gòu)建物中，只要在轉(zhuǎn)入到細胞后其編碼的多肽能夠被有效地表達和發(fā)揮活性即可。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的表達載體是pPIC Z，pPIC3.5K和pAG32。

包含上述的適當基因序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，所述的宿主細胞優(yōu)選的是酵母工程菌，更優(yōu)選的是畢赤酵母，如畢赤酵母GS115。

用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。

獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域熟知的酵母培養(yǎng)基。在適于酵母細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。

本發(fā)明通過基因重組技術(shù)獲得的重組畢赤酵母菌株具有代謝背景低、異 源表達能力強，可全細胞合成終產(chǎn)物以及終產(chǎn)物易分離且副產(chǎn)物少等特征，將在很大程度上解決傳統(tǒng)生物、化學(xué)方法合成存在的問題，為工業(yè)化生產(chǎn)他汀類藥物提供新思路。

合成洛伐他汀或其中間體的方法

洛伐他汀的結(jié)構(gòu)式如下式(I)所示，其中間體莫納可林J的結(jié)構(gòu)式如下式(II)所示。

本發(fā)明公開一種利用微生物異源合成生產(chǎn)洛伐他汀或其中間體的方法。所述方法包括：將五種基因(LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA)轉(zhuǎn)化酵母工程菌，從而生產(chǎn)洛伐他汀中間體莫納可林J；或者，將七種基因(LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA，LovD，LovF)轉(zhuǎn)化酵母工程菌，從而生產(chǎn)洛伐他汀。

重組酵母工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)可以采用本領(lǐng)域已知的酵母發(fā)酵方法，一種較為優(yōu)選的方法是：于30℃、轉(zhuǎn)速200r/min的液體YPD培養(yǎng)中，將重組菌培養(yǎng)至對數(shù)期，收集菌體使用無菌水洗滌兩次后轉(zhuǎn)移至MM培養(yǎng)基，于30℃、轉(zhuǎn)速200r/min培養(yǎng)72-96h。發(fā)酵過程中每24h向液體培養(yǎng)基中添加0.5％的甲醇。

在獲得了發(fā)酵產(chǎn)物后，從發(fā)酵產(chǎn)物中提取洛伐他汀或其中間體可以采用本發(fā)明已知的技術(shù)?？梢圆捎酶咝б合嗌V來對產(chǎn)物進行分析鑒定，以確定獲得了所需的化合物。

本專利運用重組畢赤酵母異源生產(chǎn)洛伐他汀及其莫納可林J，不僅解決了 生物發(fā)酵法中天然產(chǎn)生菌——土曲霉次級代謝背景大、產(chǎn)物難分離等問題，也避免了化學(xué)合成法中副產(chǎn)物多、純化困難、環(huán)境污染大等不利因素，為工業(yè)生產(chǎn)降血脂藥物洛伐他汀及辛伐他汀合成中間體莫納可林J開辟了新途徑。因此，本發(fā)明的重組畢赤酵母菌株具備工業(yè)化生產(chǎn)洛伐他汀及他汀類藥物前體莫納可林J的潛力。

本發(fā)明實現(xiàn)了利用重組酵母菌進行全細胞生物合成莫納可林J和洛伐他汀的技術(shù)突破，為生產(chǎn)降血脂藥物洛伐他汀、辛伐他汀及其他降血壓藥物衍生物提供了新途徑。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L；

YPD固體培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L，瓊脂20g/L；

MM液體培養(yǎng)基：甲醇5mL/L，YNB 13.4g/L。

實施例1、表達質(zhì)粒的構(gòu)建

1、聚酮合成酶各相關(guān)基因整合入AOX1啟動子表達質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計特異性引物，以土曲霉基因組為模板，以表1中相應(yīng)引物，通過PCR擴增得到洛伐他汀聚酮合成酶相關(guān)基因(LovB，LovC，LovG，NpgA，LovD，LovF)，使用EcoRI和XhoI雙酶切質(zhì)粒pPIC Z及各個基因片段，采用連接酶將各基因分別整合入質(zhì)粒pPIC ZB(Invitrogen)中AOX1啟動子下游，測序正確后即可得到具有AOX1啟動各基因表達的質(zhì)粒。

其中，LovB的基因序列如SEQ ID NO:1所示；

LovC的基因序列如SEQ ID NO:2所示；

LovG的基因序列如SEQ ID NO:3所示；

NpgA的基因序列如SEQ ID NO:4所示；

LovD的基因序列如SEQ ID NO:5所示；

LovF的基因序列如SEQ ID NO:6所示。

PCR擴增所用的引物如表1所示。

表1

2、質(zhì)粒pPIC Z_BCGN的構(gòu)建

使用BamH I和BglⅡ分別雙酶切前面“1”中構(gòu)建的質(zhì)粒，分別回收得到包括啟動子和終止子的LovB，LovC，LovG，NpgA各基因完整的表達盒。

同樣采用BamH I和BglⅡ雙酶切質(zhì)粒pPIC Z，利用連接酶將各個基因完 整的表達盒依次頭尾相連整合入質(zhì)粒，即可得到包含有LovB，LovC，LovG，NpgA基因的質(zhì)粒pPIC Z_BCGN。

3、質(zhì)粒pPIC 3.5K_A的構(gòu)建

以土曲霉基因組為模板，以表1中相應(yīng)引物，通過PCR擴增得到基因LovA片段，使用Not I和Bln I雙酶切PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒pPIC 3.5K，利用連接酶將二者接合，即可得到質(zhì)粒pPIC 3.5K_A。

LovA的基因序列如SEQ ID NO:7所示。

4、質(zhì)粒pAZh_DF的構(gòu)建

以質(zhì)粒pAG 32(獲自美國加州理工大學(xué))為模板，以表1中相應(yīng)引物，通過PCR擴增得到潮霉素基因(Hyg)抗性表達盒片段，使用BamH I和Bgl II酶切質(zhì)粒pPIC ZB及PCR產(chǎn)物，利用連接酶將二者接合，即得到質(zhì)粒pAZh。

使用BamH I和BglⅡ雙酶切前面“1”中構(gòu)建的分別包含基因LovD和LovF表達盒的質(zhì)粒，以及使用BamH1單酶切質(zhì)粒pAZh，利用連接酶將酶切后的LovD和LovF表達盒頭尾相連整合入質(zhì)粒pAZh，即可得到質(zhì)粒pAZh_DF。

實施例2、目標重組酵母菌的制備

1、重組菌株的PCR驗證

各表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS 115，復(fù)蘇后，涂布于具有抗性的YPD固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3天后挑取新鮮的菌落在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用酵母基因組提取試劑盒提取各轉(zhuǎn)化子的基因組，經(jīng)克隆PCR反應(yīng)鑒定聚酮合酶基因整合入畢赤酵母基因組的情況。

克隆PCR反應(yīng)條件：

(1)初始變性95℃5min；

(2)變性95℃30s，退火50℃30s，延伸72℃1min/kb，循環(huán)反應(yīng)30次；

(3)最后延伸72℃7min。

2、包含5種外源基因的重組菌的獲得

將質(zhì)粒pPIC Z_BCGN和pPIC 3.5K_A經(jīng)線性化回收后，先后經(jīng)電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母感受態(tài)，使用具有博來霉素和遺傳霉素抗性的YPD固體培養(yǎng)篩選重組子，獲得轉(zhuǎn)化入5種外源基因(LovB，LovC，LovG，NpgA，LovA基因)的畢赤酵母基因工程菌。

3、包含7種外源基因的重組菌的獲得

將前述2獲得的包含5種外源基因的重組酵母菌制備成感受態(tài)，線性化后的質(zhì)粒pAZh_DF經(jīng)電轉(zhuǎn)化入該感受態(tài)，使用具有潮霉素抗性的固體YPD培養(yǎng)基篩選重組子，獲得轉(zhuǎn)化入7種外源基因(LovB，LovC，LovG，NpgA，LovA，LovD和LovF)的畢赤酵母基因工程菌。

實施例3、重組工程菌5L罐高密度發(fā)酵工藝及產(chǎn)物定量分析

1、搖瓶(250mL錐形瓶)水平發(fā)酵

于30℃、轉(zhuǎn)速200r/min的液體YPD培養(yǎng)基中，將重組菌培養(yǎng)至對數(shù)期，收集菌體使用無菌水洗滌兩次后轉(zhuǎn)移至裝有100mL MM液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于30℃、轉(zhuǎn)速200r/min培養(yǎng)72-96h。發(fā)酵過程中每24h向液體培養(yǎng)基中添加0.5％(v/v)的甲醇。

2、5L發(fā)酵罐發(fā)酵

采用上罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基BSM(配方已由Invitrogen公司商業(yè)化)作為培養(yǎng)基，發(fā)酵過程分為分批階段和補料階段，其中補料階段前期為甘油補料(流加)，中后期為甲醇流加補料。其間控制發(fā)酵罐中攪拌轉(zhuǎn)速在1000rpm；提供氧氣供應(yīng)，保證發(fā)酵液溶氧在30％～60％之間；連接氨水補料，維持發(fā)酵液pH為5.0左右。在發(fā)酵初始期，以甘油為碳源促進菌體生長，并提供甘油補料直至菌體生長到250g/L濕重時，停止甘油補料并切換至甲醇補料，逐步提高甲醇流加速率至16mL/h后維持穩(wěn)定，在甲醇補料72h后發(fā)酵結(jié)束。

實施例4、重組菌株發(fā)酵產(chǎn)物的提取鑒定

經(jīng)前述驗證后的重組菌株，經(jīng)YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，取100OD(注：OD值為酵母菌濃單位，1OD約為5x10⁷個酵母細胞。OD值由紫外 分光光度計于600nm波長測得)菌體，利用無菌水洗兩次后轉(zhuǎn)入100mL MM液體培養(yǎng)基中，溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為200r/min進行誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，時間為72-96h，其中每24h添加0.5％的無水甲醇。經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液，取20mL使用等體積乙酸乙酯萃取樣品三次。收集上層乙酸乙酯有機相，蒸餾后再溶于2mL甲醇，稀釋十倍用于高效液相色譜(HPLC)分析。

高效液相色譜法分析，由反向高效液相色譜Agilent 1100完成，色譜柱使用C18柱，柱溫30℃，紫外檢測波長為238nm，洗脫條件如表2。

表2、目標產(chǎn)物HPLC流動相條件

包含5種外源基因的重組菌的發(fā)酵產(chǎn)物的高效液相鑒定圖見圖1B，圖1A為陰性對照高效液相色譜圖，圖1C為標準品高效液相色譜圖。由圖可見，該重組酵母菌株可生產(chǎn)莫納可林J。

包含7種外源基因的重組菌的發(fā)酵產(chǎn)物的高效液相色譜鑒定圖見圖2B，圖2A為陰性對照高效液相色譜圖，圖2C為標準品高效液相色譜圖。由圖可見，該重組酵母菌株可生產(chǎn)洛伐他汀。

實施例5、發(fā)酵期間的細胞生物量和產(chǎn)物產(chǎn)量

根據(jù)實施例3的5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)方法進行發(fā)酵。發(fā)酵期間間隔12h取樣，測定細胞生物量和莫納可林J產(chǎn)物量。

結(jié)果見圖3，由圖3A可見，隨著發(fā)酵時間的增加，細胞生物量逐漸增加，同時莫納可林J的產(chǎn)量也發(fā)生逐漸增加，在約發(fā)酵100小時的時候達到最高值，產(chǎn)量約215mg/L。

由圖3B可見，起始階段隨著發(fā)酵時間的增加細胞生物量逐漸增加，發(fā)酵至約32小時后不再增加。洛伐他汀從發(fā)酵約23小時后產(chǎn)生，其產(chǎn)量發(fā)生逐 漸增加，在發(fā)酵約60-65小時的時候達到最高值，產(chǎn)量180-185mg/L。

實施例6、重組工程菌遺傳穩(wěn)定性的鑒定

將其前述獲得的包含5種外源基因的重組酵母菌和包含7種外源基因的重組酵母菌活化后接種于含有100mL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，進行搖瓶培養(yǎng)(30℃，200rpm)，如實施例3中所述。并且，進行傳代培養(yǎng)10代，測定每一代重組菌株的莫納可林J產(chǎn)量和洛伐他汀產(chǎn)量，確定重組菌株的遺傳穩(wěn)定性。

結(jié)果見圖4，每一代菌株均能穩(wěn)定地生產(chǎn)莫納可林J和洛伐他汀，且隨著傳代數(shù)的增加，產(chǎn)物產(chǎn)量還略有增加，搖瓶培養(yǎng)條件下，傳代的菌株的莫納可林J產(chǎn)量約為30mg/L；傳代的菌株洛伐他汀產(chǎn)量約在20mg/L。

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