本發(fā)明涉及一種動物寄生蟲細胞及這種動物寄生蟲細胞的培養(yǎng)方法，確切地說本發(fā)明涉及一種環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞，以及這種細胞的培養(yǎng)方法。

技術(shù)背景

環(huán)形泰勒蟲屬于泰勒蟲科泰勒蟲屬的一種血液原蟲，是牛熱帶泰勒蟲病的病原。該病在我國北方地區(qū)廣泛流行，多呈急性經(jīng)過，能導致牛的致死性白細胞增殖紊亂，具有較高的發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

研究表明，牛環(huán)形泰勒蟲裂殖體膠凍細胞疫苗對控制該病的流行發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)疫苗采用的細胞培養(yǎng)方法為靜置或轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方法所得到的細胞結(jié)團嚴重，呈島嶼狀、邊緣不整齊、透光性差、密度及活力低，而且需要大量的犢牛血清，增加了疫苗的生產(chǎn)成本，進而影響了該病免疫預防的大面積推廣應用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足，能實現(xiàn)環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞高質(zhì)量、高密度的增殖環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞，同時提供一種環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的一株環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞株已經(jīng)于2016年11月2日保藏于中國武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC No.C2016187，名稱為：“環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞”。

本發(fā)明的一種環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞的培養(yǎng)方法是：

(1)顯微鏡下肉眼觀察，挑選生長狀態(tài)良好的環(huán)形泰勒蟲裂殖體細胞的種細胞，將種細胞單層鋪滿于無菌的培養(yǎng)器皿內(nèi)。

(2)在無菌條件下，將步驟⑴中的細胞沿培養(yǎng)器皿的細胞生長面輕輕吹打并混勻，靜置培養(yǎng)96小時后，吸取細胞懸液并補加細胞營養(yǎng)液RPMI-1640至另一個培養(yǎng)器皿內(nèi)批式傳代培養(yǎng)，其中吸取的細胞懸液與細胞營養(yǎng)液的體積比為1:1.6～1:3.5，培養(yǎng)至細胞倍增率、細胞密度和活率等指標趨于穩(wěn)定，細胞形態(tài)正常時，表明細胞已經(jīng)適應在懸浮培養(yǎng)條件下生長，細胞馴化成功。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞的培養(yǎng)方法是：懸浮傳代培養(yǎng)至11代，得到細胞馴化成功的懸浮細胞，所用的培養(yǎng)基為購自Hyclone公司的RPMI-1640，培養(yǎng)時在恒溫、旋轉(zhuǎn)振蕩條件下進行，其培養(yǎng)溫度為37.5℃，每代的培養(yǎng)時間為72～96h。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞的培養(yǎng)方法，其懸浮培養(yǎng)的參數(shù)為：培養(yǎng)溫度37.5℃、培養(yǎng)器皿的轉(zhuǎn)速為80～120rpm、每代的培養(yǎng)時間為72～96h，細胞量與培養(yǎng)基間的的體積比為1:2—1:3。

采用本發(fā)明制備的環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞，形態(tài)良好、增殖速度快，與傳統(tǒng)的靜置培養(yǎng)或轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法相比，其在降低生產(chǎn)成本的同時，很大程度地提高了生產(chǎn)效率，而且還可大幅度地提高后期培養(yǎng)細胞的收獲密度和活率。本發(fā)明提供的環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞懸浮培養(yǎng)方法，不僅提升了細胞質(zhì)量和產(chǎn)量，而且降低了培養(yǎng)成本、操作方便、勞動強度低和便于生產(chǎn)，為該病的免疫預防提供了有力的技術(shù)支持。

附圖說明

圖1為環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞懸浮培養(yǎng)馴化過程中F14、F20、F25細胞形態(tài)照片。

圖2為環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞培養(yǎng)參數(shù)優(yōu)化過程中F30、F35、F41細胞形態(tài)照片。

圖3為環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞適應懸浮培養(yǎng)至F41后的細胞培養(yǎng)生長曲線。

圖4為根據(jù)細胞分析儀CASY TT對細胞的生長情況，如存活細胞、死亡細胞及細胞碎片的數(shù)量進行統(tǒng)計、分析，最終繪制出的細胞大小分布圖。本圖所示的細胞密度為3.59×10⁶cells/mL，活率為92.83％。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施過程對本發(fā)明進行詳細說明。

一、基本方法

1.材料和方法

1.1所用的細胞為中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈的第14代環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞。

營養(yǎng)液為購自Hyclone公司的RPMI-1640。

新生牛血清購自合格供應商。

1.2儀器和設備恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海蘇坤實業(yè)有限公司)；細胞分析儀(德國INNOVATIS公司)；移液器(Eppendorf)；倒置顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)；生物潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1靜置培養(yǎng)種細胞及篩選

顯微鏡下肉眼觀察，挑選生長狀態(tài)良好，形態(tài)一致的第14代環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞，單層鋪滿于無菌方瓶，得到作為懸浮培養(yǎng)的種細胞。

1.3.2環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞的懸浮培養(yǎng)馴化

將中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈的F14代細胞靜置培養(yǎng)96小時后，細胞鋪滿T25方瓶。挑選出生長狀態(tài)良好、形態(tài)一致，無污染的F14代T25方瓶細胞為懸浮培養(yǎng)的種細胞，將細胞輕輕吹打并混勻，吸取適量細胞懸液，補加適量細胞營養(yǎng)液RPMI-1640至滅菌處理的250mL錐形細胞培養(yǎng)瓶恒溫振蕩培養(yǎng)，其中1份體積的細胞懸液加入1.6～3.5倍體積的培養(yǎng)基，相關(guān)試驗表明最佳的比例為1：2～1：3。細胞批式傳代培養(yǎng)后，取樣觀察并檢測細胞密度及活率。當細胞倍增率、細胞密度和活率等指標趨于穩(wěn)定，細胞形態(tài)正常(圓形、邊緣整齊、飽滿透亮、大小均勻、不結(jié)團)時，表明細胞已經(jīng)適應在懸浮培養(yǎng)條件下生長，即細胞馴化成功。

2.結(jié)果

細胞由靜置培養(yǎng)轉(zhuǎn)為懸浮培養(yǎng)后，F(xiàn)14-F15細胞結(jié)團較多，團塊大小不一，多呈10個細胞粘連的小團塊，單個細胞形態(tài)不均勻、不透亮，細胞懸液中可見裂解的細胞碎片；F15-F17細胞結(jié)團較少，多呈3個細胞松散粘連的小團塊，單個細胞呈圓形、透亮；F17-F20細胞多呈單個，2-4個串狀，團塊明顯減少，細胞懸液變得透亮；F20-F25細胞邊緣整齊，飽滿透亮，大小均勻，細胞懸液變得透亮。細胞從F14-F25懸浮培養(yǎng)馴化過程中，細胞團塊明顯減少，單個細胞形態(tài)逐漸趨于圓形，飽滿透亮，細胞懸液變得透亮，表明該細胞已經(jīng)適應在懸浮培養(yǎng)條件下生長，參見表1。

表1細胞懸浮培養(yǎng)馴化過程中密度與活率檢測結(jié)果

所述馴化過程中F14、F20、F25細胞形態(tài)參見附圖1。附圖1中，左圖為T25方瓶靜置培養(yǎng)環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞F14。鏡下觀察：細胞呈島嶼狀分布、分散不均勻、大小不一、透光性差及死細胞多；中圖為懸浮培養(yǎng)馴化細胞F20。鏡下觀察：細胞圓潤、透亮、分散均勻，細胞間營養(yǎng)液清亮。與靜置培養(yǎng)相比，結(jié)團嚴重的現(xiàn)象有所改善，但密度不高，表明細胞增殖仍較慢；右圖懸浮培養(yǎng)馴化細胞F25。鏡下觀察：細胞結(jié)團明顯減少，細胞飽滿透亮，邊緣整齊。

二、最佳培養(yǎng)條件

為了摸索細胞生長過程中的關(guān)鍵參數(shù)(如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速及培養(yǎng)時間)對細胞密度及活力的影響，本發(fā)明利用正交試驗進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，最終確定了環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞懸浮培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)條件。試驗中所用材料、培養(yǎng)基及所用儀器設備同上。

試驗方法

1.試驗設計

選用L9(3⁴)正交表進行試驗設計，試驗因素及水平分別為培養(yǎng)溫度(36.5℃、37.0℃、37.5℃)、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速(40rpm、80rpm、120rpm)、培養(yǎng)時間(72h、96h、120h)，最后一列為空白列。

2.細胞培養(yǎng)方法

將馴化的細胞轉(zhuǎn)移至250mL錐形細胞培養(yǎng)瓶，并補加適量細胞營養(yǎng)液至初始培養(yǎng)密度為0.5×10⁶cells/ml后，恒溫振蕩培養(yǎng)箱懸浮培養(yǎng)，隨后每隔24h取懸浮培養(yǎng)細胞，觀察其形態(tài)及生長情況，以活細胞最大密度及活率為指標，從而確定環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞懸浮培養(yǎng)的最佳溫度、轉(zhuǎn)速及培養(yǎng)時間。

3.結(jié)果及分析

3.1結(jié)果

表2試驗結(jié)果(一)

表3試驗結(jié)果(二)

3.2分析

由試驗結(jié)果(一)、(二)可知，環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞懸浮培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速及培養(yǎng)時間在其懸浮培養(yǎng)過程中起著關(guān)鍵的作用。正交試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速及培養(yǎng)時間分別為37.5℃、120rpm、96h時，細胞密度較高，但活率呈下降趨勢；當培養(yǎng)參數(shù)變?yōu)?7.5℃、80rpm、72h時細胞密度雖不是最高水平，但活率呈上升趨勢，從而確定出三個關(guān)鍵參數(shù)的最優(yōu)組合為溫度37.5℃、轉(zhuǎn)速80-120rpm、培養(yǎng)時間72-96h。

對經(jīng)上述試驗所得到的F27代產(chǎn)物，送交位于中國武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，進行保藏，其保藏號為：CCTCC NO:C2016187，其名稱為：“環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞”。

三、馴化細胞的傳代培養(yǎng)

試驗中所用材料、培養(yǎng)基及所用儀器設備同上。

1方法

吸取適量馴化至F25的細胞懸液，補加適量細胞營養(yǎng)液至初始密度為0.5×10⁶cells/mL,250mL錐形細胞培養(yǎng)瓶懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)參數(shù)為溫度37.5℃、轉(zhuǎn)速80-120rpm、培養(yǎng)時間72-96h。每傳代一次，取樣觀察及檢測細胞生長情況(細胞形態(tài)、密度、活率)后，取適量細胞種子并補加適量細胞營養(yǎng)液進行細胞批式傳代培養(yǎng)。當細胞密度及活率均逐漸提高且趨于穩(wěn)定，細胞形態(tài)正常(圓形、邊緣整齊，飽滿透亮，大小均勻)時，表明馴化的細胞在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下可依次連續(xù)傳代培養(yǎng)。

2結(jié)果

由圖2及表4可知，馴化的細胞在優(yōu)化的條件下培養(yǎng)，F(xiàn)25-F30細胞團塊明顯減少，細胞邊緣整齊，飽滿透亮；F30-F35細胞呈1-2個花生狀，細胞間營養(yǎng)液清亮；F35-F41細胞呈單個圓形，大小均勻，排列緊密。細胞從F25-F41培養(yǎng)過程中，細胞密度從2.13×10⁶cells/mL增加到4.2×10⁶cells/mL；細胞活率從88.7％上升到93.4％，表明細胞在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下密度及活率逐漸增加、可穩(wěn)定傳代，而且經(jīng)本發(fā)明優(yōu)化馴化的細胞其密度及活率還有明顯的上升。

表4培養(yǎng)參數(shù)優(yōu)化過程中細胞密度與活率檢測結(jié)果

通過細胞培養(yǎng)生長曲線(圖3)，可見懸浮培養(yǎng)至F41后，細胞培養(yǎng)生長曲線。文獻記載，環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞培養(yǎng)至96h后，活率明顯下降。本實驗在細胞培養(yǎng)的0、24、48、72、96、120、144h分別取樣，利用細胞分析儀CASY TT檢測細胞密度及活率。根據(jù)檢測結(jié)果繪制的細胞培養(yǎng)生長曲線表明，細胞培養(yǎng)至96h后，密度從3.43×10⁶cells/mL降至2.4×10⁶cells/mL；活率從93.18％降至88.5％，實驗結(jié)果與文獻記載一致。

圖4為根據(jù)細胞分析儀CASY TT對細胞的生長情況，如存活細胞、死亡細胞及細胞碎片的數(shù)量進行統(tǒng)計、分析，最終繪制出細胞大小分布圖。其工作原理為：死細胞具有一個可滲透的細胞膜，它允許等滲緩沖溶液CASYton進入。因此，死細胞內(nèi)的細胞質(zhì)同胞外的等滲緩沖液具有相同的電導率，可以被電極所忽略，所測得的僅僅是緊密結(jié)構(gòu)的細胞核的體積。而活細胞擁有完整的細胞膜，CASY技術(shù)分析的是全細胞的體積。利用兩者的相對差異即可區(qū)分活細胞與死細胞。如圖所示①在以虛線表示的光標左側(cè)(≤6.3μm)為細胞碎片峰。②在左側(cè)的標準光標和以實線表示的賦值光標(6.3μm to 9.1μm)之間出現(xiàn)的是死細胞峰。死細胞的細胞膜不完整，不能屏蔽電脈沖，因此圖像表現(xiàn)的死細胞的大小實際是細胞核的大小。③在賦值光標的右側(cè)是活細胞峰和細胞團塊峰。由圖可知，活細胞及細胞團塊峰的峰形陡峭，表明細胞大小均勻，且大部分細胞直徑在11.00μm左右；死細胞峰低，但仍存在較多的細胞碎片。本圖所示的細胞密度為3.59×10⁶cells/mL，活率為92.83％。