本發(fā)明屬于病毒誘導(dǎo)免疫細(xì)胞氧化脅迫模型技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種PRRSV誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化脅迫模型的建立方法。

背景技術(shù)：

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致活性氧(ROS)自由基產(chǎn)生速率大于清除速率，從而引起細(xì)胞和組織損傷的一種病理狀態(tài)。氧化損傷主要包括生物膜脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變性、DNA損害，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡，并引發(fā)疾病。病毒感染是導(dǎo)致多種疾病的直接原因，并與氧化損傷密切相關(guān)；一方面，病毒感染引起ROS釋放；另一方面，感染使吞噬細(xì)胞活化并釋放如TNF和IL-1等前氧化性細(xì)胞因子。機(jī)體通過維持氧化物和抗氧化物平衡來保持正常狀態(tài)，而病毒可以影響細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，如谷胱甘肽(GSH)水平和誘生型一氧化氮合酶(MOS)活性，增加細(xì)胞的前氧化物如NO，從而引起細(xì)胞凋亡。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是豬繁殖與呼吸綜合征的主要病原，能感染誘發(fā)機(jī)體免疫抑制，造成免疫失敗、繼發(fā)感染及其他疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種PRRSV誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化脅迫模型的建立方法，為后續(xù)深入研究PRRSV的感染機(jī)制和開發(fā)應(yīng)用于PRRSV感染的制劑提供技術(shù)平臺(tái)和理論參考。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：PRRSV誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化脅迫模型的建立方法，采用PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞，病毒濃度為TCID₅₀是10^-5.5/0.1mL的PRRSV病毒原液的10⁰-10^-4，感染時(shí)間為4-48h。

所述病毒濃度為TCID₅₀是10^-5.5/0.1mL的PRRSV病毒原液的10^-2，感染時(shí)間為4h。

上述PRRSV誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化脅迫模型的建立方法，包括以下步驟：

設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和病毒組，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×10⁶個(gè)/mL，按500μL/孔加至24孔板內(nèi)，對(duì)照組加500μL培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入500μL病毒液，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)44h后每孔棄去10μL上清液，加入10μL MTT(5mg/mL)，繼續(xù)孵育4h后離心并棄掉上清液，每孔加入100μL DMSO，搖勻使顆粒溶解后靜置10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)處吸光度值；

分別收集細(xì)胞上清液或細(xì)胞，用于測(cè)定表征氧化脅迫模型的相關(guān)指標(biāo)。

病毒組中病毒濃度為TCID₅₀是10^-5.5/0.1mL的PRRSV病毒原液的10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4。

PRRSV病毒與細(xì)胞吸附時(shí)間為2h。

收集細(xì)胞上清液或細(xì)胞在培養(yǎng)后第4h、8h、12h、24h、48h。

相關(guān)指標(biāo)包括NO、ROS、GSH、GSSG、XOD、MPO和iNOS。

為研究PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞與細(xì)胞氧化應(yīng)激之間的關(guān)系，發(fā)明人以RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象，建立了一種PRRSV誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化脅迫模型的建立方法，采用PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞，病毒濃度為TCID₅₀是10^-5.5/0.1mL的PRRSV病毒原液的10⁰-10^-4，培養(yǎng)時(shí)間為4-48h。應(yīng)用本發(fā)明，利用不同濃度PRRSV作用不同時(shí)間，通過檢測(cè)細(xì)胞存活率，NO釋放，細(xì)胞內(nèi)ROS水平，GSH和GSSG含量，XOD、MPO和iNOS活性等指標(biāo)，可以確定建立PRRSV體外誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化脅迫模型的最佳條件，為闡明PRRSV體外誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激與免疫抑制之間的關(guān)系和疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了有力的理論依據(jù)，也為后續(xù)深入研究PRRSV的感染機(jī)制和開發(fā)應(yīng)用于PRRSV感染的制劑提供技術(shù)平臺(tái)和理論參考。

附圖說明

圖1是PRRSV對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響圖。

圖2是PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞對(duì)NO分泌的影響圖。

圖3是PRRSV體外處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響圖。

圖4是PRRSV體外處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響圖。

圖5是PRRSV體外處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)GSSG含量的影響圖。

圖6是PRRSV體外處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG的影響圖。

圖7是PRRSV體外處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)XOD活力的影響圖。

圖8是PRRSV體外處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)MPO活力的影響圖。

圖9是PRRSV體外處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)iNOS活力的影響圖。

具體實(shí)施方式

一、研究思路

本發(fā)明通過PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞分泌一氧化氮(NO)的水平、細(xì)胞內(nèi)總活性氧(ROS)水平、還原型谷胱甘肽(GSH)含量、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量、黃嘌呤氧化酶(XOD)活性、髓過氧化物酶(MPO)活性、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)活性，探討PRRSV體外誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激與免疫抑制之間的關(guān)系，建立RAW264.7細(xì)胞氧化脅迫體外模型。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(1)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組和5個(gè)不同梯度病毒組(10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×10⁶個(gè)/mL，按500μL/孔加至24孔板內(nèi)，對(duì)照組加500μL培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入500μL不同濃度病毒液，使病毒終濃度分別為10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)44h后每孔棄去10μL上清液，加入10μL MTT(5mg/mL)，繼續(xù)孵育4h后離心并棄掉上清液，每孔加入100μL DMSO，搖勻使顆粒溶解后靜置10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)處吸光度值。其中，PRRSV病毒原液的TCID₅₀為10^-5.5/0.1mL。

(2)分別在培養(yǎng)后第4h、8h、12h、24h、48h分別收集細(xì)胞上清液或細(xì)胞，用于測(cè)定表征氧化脅迫模型的相關(guān)指標(biāo)(肝臟丙二醛含量、谷胱甘肽含量、谷胱甘肽過氧化物酶活力、T-SOD、總抗氧化力)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，Griess法檢測(cè)NO水平，DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)ROS水平，熒光光度法檢測(cè)GSH、GSSG水平，分光光度法檢測(cè)XOD、MPO、iNOS酶活力。

(3)所測(cè)得數(shù)據(jù)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析及Duncan多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P＜0.05表示為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.PRRSV體外處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

結(jié)果如圖1所示，不同稀釋度PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞，隨著病毒濃度升高，細(xì)胞存活率逐漸下降，其中病毒原液的抑制作用最為明顯，與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)。而10^-4～10^-1稀釋度病毒液體外感染的細(xì)胞存活率較大，分別為93.7％、86.3％、82.9％和82.7％，適用于造模的后續(xù)試驗(yàn)。

2.PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞對(duì)NO分泌的影響

NO分泌結(jié)果如圖2所示，PRRSV體外感染RAW264.7細(xì)胞引起細(xì)胞NO分泌增加，且隨著作用時(shí)間增加逐漸升高。與對(duì)照組相比，10^-2稀釋度病毒液體外處理RAW264.7細(xì)胞8h、12h、24h均能極顯著升高細(xì)胞NO的分泌(P＜0.01)，48h能顯著升高(P＜0.05)；10^-4稀釋度病毒液體外感染RAW264.7細(xì)胞8h和48h分別能極顯著(P＜0.01)和顯著(P＜0.05)升高細(xì)胞NO的分泌；10^-3稀釋度病毒液體外感染8h能極顯著(P＜0.01)細(xì)胞NO的分泌，12h和24h顯著升高；10^-1稀釋度病毒液體外處理8h、24h和12h、48h分別能極顯著(P＜0.01)和顯著(P＜0.05)升高細(xì)胞NO的分泌；病毒原液體外感染8h和48h能極顯著(P＜0.01)細(xì)胞NO的分泌。

3.PRRSV體外處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

細(xì)胞內(nèi)活性氧水平如圖3所示，PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞能升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，一定范圍內(nèi)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ROS水平逐漸降低，但始終高于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，10^-2稀釋度病毒液體外感染4h、12h和8h、24h分別能顯著(P＜0.05)和極顯著(P＜0.01)升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平；10^-4稀釋度病毒液體外感染RAW264.7細(xì)胞4h和24h能顯著升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P＜0.05)；10^-3稀釋度病毒液體外感染8h能極顯著升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P＜0.01)；10^-1稀釋度病毒液體外感染8h能極顯著升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P＜0.01)；病毒原液體外感染8h和4h、24h分別能極顯著(P＜0.01)和顯著(P＜0.05)升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

4.PRRSV體外處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)GSH和GSSG含量的影響

細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量如圖4所示，與對(duì)照組相比，不同稀釋度PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞4h和24h均能極顯著升高細(xì)胞內(nèi)GSH含量(P＜0.01)；其中10^-2稀釋度病毒液感染8h和12h均能極顯著升高細(xì)胞內(nèi)GSH含量(P＜0.01)；10^-3稀釋度病毒液感染48h能極顯著升高細(xì)胞內(nèi)GSH含量(P＜0.01)。

細(xì)胞內(nèi)氧化型谷胱甘肽含量如圖5所示，PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞能升高細(xì)胞內(nèi)GSSG含量。與對(duì)照組相比，10^-2稀釋度病毒液體外處理4h、12h和24h均能顯著升高細(xì)胞內(nèi)GSSG含量(P＜0.05)；10^-1稀釋度病毒液體外處理8h、12h和48h均能極顯著升高細(xì)胞內(nèi)GSSG含量(P＜0.01)；病毒原液體外處理48h能極顯著升高細(xì)胞內(nèi)GSSG含量(P＜0.01)。

細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)如圖6所示，PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞能降低細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG比值，且隨著作用時(shí)間的增加呈先降低后上升的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，不同稀釋度PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞4h均能極顯著降低細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG比值(P＜0.01)；其中10^-2稀釋度病毒液感染24h和48h均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG比值(P＜0.05)；10^-1稀釋度病毒液和病毒原液體外感染細(xì)胞8h、48h均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG比值(P＜0.05)。

5.PRRSV體外處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)XOD、MPO和iNOS活力的影響

XOD活力如圖7所示，PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞能升高細(xì)胞內(nèi)黃嘌呤氧化酶活力，且與病毒濃度呈一定的濃度依賴性。其中與對(duì)照組相比，10^-2稀釋度病毒液在培養(yǎng)各個(gè)時(shí)間段均能顯著升高細(xì)胞內(nèi)XOD活力(P＜0.05)；10^-3稀釋度病毒液在感染4h、8h和24h均能顯著升高細(xì)胞內(nèi)XOD活力(P＜0.05)；10^-4稀釋度病毒液在培養(yǎng)24h時(shí)能顯著升高細(xì)胞內(nèi)XOD活力(P＜0.05)。

MPO活力如圖8所示，PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞能升高細(xì)胞內(nèi)髓過氧化物酶活力，且與病毒濃度呈一定的濃度依賴性。其中與對(duì)照組相比，10^-2稀釋度病毒液處理4h能極顯著升高細(xì)胞內(nèi)MPO活力(P＜0.01)，處理8h、12h能顯著升高細(xì)胞內(nèi)MPO活力(P＜0.05)；處理4h，10^-1稀釋度病毒液和病毒原液聚能顯著升高細(xì)胞內(nèi)MPO活力(P＜0.05)。

iNOS活力如圖9所示，PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞能升高細(xì)胞內(nèi)誘生型一氧化氮合酶活力，且隨培養(yǎng)時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，培養(yǎng)8h時(shí)達(dá)到峰值，當(dāng)培養(yǎng)24h時(shí)，iNOS活力降至最低值。其中與對(duì)照組相比，培養(yǎng)4h時(shí)，各稀釋度病毒液均能極顯著升高細(xì)胞內(nèi)iNOS活力(P＜0.01)；處理8h，10^-2、10^-1稀釋度病毒液分別能極顯著(P＜0.01)和顯著(P＜0.05)升高細(xì)胞內(nèi)iNOS活力。

四、研究結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著病毒濃度的增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，RAW264.7細(xì)胞存活率下降，NO分泌水平和細(xì)胞內(nèi)XOD、MPO、iNOS活力逐漸升高，細(xì)胞內(nèi)GSH和GSSG含量逐漸增加，GSH/GSSG比值和ROS水平逐漸下降。其中，在10^-2PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞4h條件下，細(xì)胞分泌的NO含量極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、GSSG含量、MPO活力和iNOS活力均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，GSH/GSSG比值顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，細(xì)胞內(nèi)XOD活力顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，且該條件下細(xì)胞有較高存活率(86.31％)。因此，PRRSV體外能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，選擇10^-2PRRSV體外處理RAW264.7細(xì)胞4h是建立RAW264.7細(xì)胞氧化脅迫模型的最佳條件。