本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種整合缺陷型慢病毒載體、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因治療技術(shù)在當(dāng)代越來(lái)越具有主要地位。但是基因治療的技術(shù)手段有很大的局限。而慢病毒載體的出現(xiàn)有望突破常規(guī)載體的瓶頸，慢病毒載體是目前基因治療與基因遞送中應(yīng)用最廣泛有效的工具。

以1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體具有可感染非分裂細(xì)胞、免疫反應(yīng)小、攜帶的基因片段容量大和可整合進(jìn)宿主基因組而長(zhǎng)期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，慢病毒載體能夠容納多達(dá)8kb的外源基因，在體內(nèi)體外均能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)包括DC細(xì)胞在內(nèi)廣泛的細(xì)胞類(lèi)型，能夠整合外源基因到宿主基因組中引起持續(xù)的基因表達(dá)，且沒(méi)有預(yù)存免疫，載體骨架的免疫原性弱，因而成為最理想的基因轉(zhuǎn)移載體之一。

慢病毒載體在體內(nèi)應(yīng)用，其主要挑戰(zhàn)是轉(zhuǎn)基因整合入宿主基因組所引起的安全問(wèn)題。傳統(tǒng)的慢病毒三質(zhì)粒(第1個(gè)質(zhì)粒為含有HIV病毒gag基因和pol基因的包裝質(zhì)粒；第2個(gè)為轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒，含有HIV包裝信號(hào)ψ，反轉(zhuǎn)錄及整合所需要的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)和報(bào)告基因；第3個(gè)質(zhì)粒表達(dá)包膜蛋白)共轉(zhuǎn)染許可細(xì)胞(293FT)，許可細(xì)胞提供了病毒增殖裝配的基本環(huán)境條件，顆粒的形成主要靠三質(zhì)粒系統(tǒng)完成。

然而，慢病毒的隨機(jī)性整合到靶細(xì)胞染色體中也會(huì)促使細(xì)胞基因組的一些功能基因被沉默或者引起原癌基因插入激活致細(xì)胞癌變等嚴(yán)重負(fù)面影響。作為體內(nèi)應(yīng)用，其主要挑戰(zhàn)是轉(zhuǎn)基因整合入宿主基因組所引起的安全問(wèn)題。

整合型慢病毒載體的應(yīng)用不但避免了隨機(jī)整合導(dǎo)致插入誘變致癌的危險(xiǎn)，而且保持了慢病毒載體的其它優(yōu)點(diǎn)。此外，在整合慢病毒載體的基礎(chǔ)上通過(guò)轉(zhuǎn)座子引導(dǎo)的定點(diǎn)整合機(jī)制可以進(jìn)一步改造成定點(diǎn)整合慢病毒載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足及實(shí)際的需求，本發(fā)明提供一種整合慢病毒載體，，證實(shí)其整合缺陷特性，大大提高慢病毒載體應(yīng)用的安全性，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種整合缺陷型慢病毒載體，所述慢病毒載體在pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4846-4848位堿基編碼的苯丙氨酸突變?yōu)楸彼岷?或在pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4328-4830位堿基編碼的組氨酸突變?yōu)楸彼帷?/p>

具體地，所述慢病毒載體只在pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4846-4848位堿基編碼的苯丙氨酸突變?yōu)楸彼?，?/p>

所述慢病毒載體只在pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4328-4830位堿基編碼的組氨酸突變?yōu)楸彼?，?/p>

所述慢病毒載體在pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4846-4848位堿基編碼的苯丙氨酸和4328-4830位堿基編碼的組氨酸同時(shí)突變?yōu)楸彼帷?/p>

本發(fā)明中，慢病毒載體在pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4846-4848位堿基編碼的苯丙氨酸突變?yōu)楸彼峄騪CMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4328-4830位堿基編碼的組氨酸突變?yōu)楸彼釋⑵渲幸晃话被徇M(jìn)行突變，酶活會(huì)下降，而將這兩個(gè)位置的氨基酸同時(shí)進(jìn)行突變，酶活大大降低。

優(yōu)選地，所述苯丙氨酸突變?yōu)楸彼崾峭ㄟ^(guò)pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4846-4848位的堿基由CA突變?yōu)镚C。

優(yōu)選地，所述組氨酸突變?yōu)楸彼崾峭ㄟ^(guò)pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4828-4830位的堿基由TT突變?yōu)镚C。

本發(fā)明中，pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的4846-4848位的堿基和4828-4830位的堿基突變后的序列如SEQ ID NO.7所示。

第二方面，本發(fā)明提供一種重組慢病毒，如第一方面所述的慢病毒載體與pFUGW表達(dá)載體及包膜載體pVSV-G載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞得到的重組慢病毒。

第三方面，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，包括如第一方面所述的慢病毒載體或如第二方面的重組慢病毒；

優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為293T細(xì)胞。

第四方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的慢病毒載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物，以pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到一個(gè)突變的基因片段；

任選地，(2)將步驟(1)擴(kuò)增得到的基因片段作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到具有兩個(gè)突變的基因片段；

(3)將步驟(1)或步驟(2)擴(kuò)增得到的基因片段連接到pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒；

(4)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克?。?/p>

其中，所述步驟(2)可選擇性的進(jìn)行，即只突變一個(gè)位點(diǎn)時(shí)直接將步驟(1)突變的基因片段連接到pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒中，若同時(shí)突變兩個(gè)位點(diǎn)時(shí)，再進(jìn)行步驟(2)，將步驟(2)突變的基因片段連接到pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒中。

優(yōu)選地，步驟(1)所述引物為SEQ ID NO.1-6所示的序列。

所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的上游引物如下：cagaacgtctcagtaccagttagagaaagaacccata；

所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的下游引物如下：tactgtgatatttctcagcttcttcttgggcct；

所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的上游引物如下：aggcccaagaagaagctgagaaatatcacagta；

所述SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的下游引物如下：ccttttcttttaagcttgtggatgaatactg；

所述SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的上游引物如下：cagtattcatccacaagcttaaaagaaaagg；

所述SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的下游引物如下：ttgcagaattccatgtgttaatcctcatc.

優(yōu)選地，步驟(2)擴(kuò)增的引物為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6所示的序列。

所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的上游引物如下：cagaacgtctcagtaccagttagagaaagaacccata；

所述SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的上游引物如下：ttgcagaattccatgtgttaatcctcatc.

優(yōu)選地，步驟(3)所述將擴(kuò)增得到的基因片段連接到pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒的Acc65I和EcoRI克隆位點(diǎn)。

第五方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的慢病毒載體或如第二方面所述的重組慢病毒在制備基因治療藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明制備的突變后的pCMV-dR8.91慢病毒載體酶活性大大喪失，但不影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，更安全更高效；

(2)本發(fā)明制備的突變后的pCMV-dR8.91慢病毒載體具有整合性，同整合型慢病毒對(duì)比，整合型慢病毒顆粒在第6天還有85％的活性，而本發(fā)明的整合缺陷型慢病毒顆粒只有30％；到第21天時(shí)，整合型慢病毒顆粒有80％的活性，而本發(fā)明的整合缺陷型慢病毒顆粒已經(jīng)沒(méi)有活性了。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明pCMV-dR8.91慢病毒載體圖譜；

圖2是本發(fā)明pCMV-dR8.91慢病毒載體4328-4329位的堿基突變的序列圖；

圖3是本發(fā)明pCMV-dR8.91慢病毒載體4846-4848位的堿基突變的序列圖；

圖4是本發(fā)明pCMV-dR8.91慢病毒載體的4328-4329位的堿基突變陽(yáng)性克隆測(cè)序比對(duì)結(jié)果；

圖5是本發(fā)明pCMV-dR8.91慢病毒載體的4846-4848位的堿基突變陽(yáng)性克隆測(cè)序比對(duì)結(jié)果；

圖6是本發(fā)明pCMV-dR8.91慢病毒載體PCR二次點(diǎn)突變后的擴(kuò)增條帶；

圖7是本發(fā)明pCMV-dR8.91慢病毒載體在Acc65I/EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶的作用下切成的328+950+10.8K 3個(gè)片段；

圖8是本發(fā)明慢病毒感染細(xì)胞的GFP表達(dá)百分比和平均熒光強(qiáng)度，其中，為野生型，為突變型。

具體實(shí)施方式

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。

實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過(guò)正規(guī)渠道商購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：構(gòu)建突變后的pCMV-dR8.91慢病毒載體

1)pCMV-dR8.91慢病毒載體及要突變的位點(diǎn)，如圖1和圖2所示：

(1)根據(jù)已知pCMV-dR8.91慢病毒載體序列設(shè)計(jì)引物如下：

上游引物：cagaacggtctcagtaccagttagagaaagaacccata(SEQ ID NO.1)；

下游引物：tactgtgatatttctcagcttcttcttgggcct(SEQ ID NO.2)；

上游引物：aggcccaagaagaagctgagaaatatcacagta(SEQ ID NO.3)；

下游引物：ccttttcttttaagcttgtggatgaatactg(SEQ ID NO.4)；

上游引物：cagtattcatccacaagcttaaaagaaaagg(SEQ ID NO.5)；

下游引物：ttgcagaattccatgtgttaatcctcatc(SEQ ID NO.6)

以pCMV-dR8.91慢病毒載體為模板，直接用于第一個(gè)突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

其中，引物的濃度為1OD的引物溶于400μL ddH2O，引物為SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.5-6同時(shí)進(jìn)行PCR，總共設(shè)置三組反應(yīng)組，一組以水為樣本的陰性對(duì)照。

反應(yīng)條件如下：

所獲得PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收純化。將得到的PCR產(chǎn)物再進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，直接用于第二個(gè)突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

其中，引物的濃度為1OD的引物溶于400μL ddH2O，設(shè)置一組以水為樣本的陰性對(duì)照。

反應(yīng)條件如下：

獲得PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收純化，結(jié)果如圖6所示，擴(kuò)增條帶的大小為1278kb。

2)酶切連接pCMV-dR8.91慢病毒質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，反應(yīng)體系如下：

37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3h，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠純化回收，pCMV-dR8.91慢病毒載體在Acc65I/EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶的作用下切成的328+950+10.8K 3個(gè)片段如圖7所示。

將酶切后的載體與基因進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下：

輕輕混勻組分，置于16℃水浴鍋反應(yīng)2h，得到重組載體。

(2)將重組載體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果如圖4-5所示，克隆序列與原始序列完全一致。

實(shí)施例2：慢病毒的包裝與滴定

(1)將測(cè)序獲得的目的突變載體即為pCMV-dR8.91m，然后將pCMV-dR8.91，pCMV-dR8.91m分別與pFUGW表達(dá)載體及包膜載體pVSV-G載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48-72h收上清，上清中分別含有整合型慢病毒顆粒FGR和整合缺陷型慢病毒顆粒FGRm；

(2)將上清3000rpn，離心10min，取上清，用0.45μm的濾器進(jìn)行過(guò)濾；

(3)取100uL檢測(cè)感染滴度，取200uL進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)，取16mL進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)，取1mL進(jìn)行內(nèi)毒檢測(cè)，將剩余的液體，進(jìn)行100000G超速離心2h，沉淀用相應(yīng)的培養(yǎng)基重懸。

得到的重懸液可直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-70℃保存，用BIOMERIEUX的Vironostika HIV-1抗原微量ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，取慢病毒收獲上清，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行p24抗原定量，同時(shí)進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定，經(jīng)過(guò)調(diào)整為1×10⁹TU/mL。

實(shí)施例3：整合缺陷型慢病毒顆粒的整合特性分析

按1×10⁷接種293T細(xì)胞于25cm²小方瓶中，次日將同等p24含量的FGR(整合型慢病毒顆粒)和FGRm(整合缺陷型慢病毒顆粒)分別感染293T細(xì)胞，感染后會(huì)出現(xiàn)GFP的表達(dá)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，感染后的第3、6、9、12和15天等用流式細(xì)胞術(shù)比較整合和整合慢病毒顆粒感染細(xì)胞的GFP表達(dá)百分比和平均熒光強(qiáng)度，如圖8所示，可以看出，整合型慢病毒顆粒在第6天還有85％的活性，而本發(fā)明的整合缺陷型慢病毒顆粒只有30％；到第21天時(shí)，整合型慢病毒顆粒有80％的活性，而本發(fā)明的整合缺陷型慢病毒顆粒已經(jīng)沒(méi)有活性。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴(lài)上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。