專(zhuān)利名稱(chēng)：含有IGF2b基因的慢病毒載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚(yú)類(lèi)生物工程育種領(lǐng)域，尤其涉及一種含有IGF2b基因的慢病毒載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的魚(yú)類(lèi)育種一直采用雜交育種技術(shù)，雜交可以使雜交種后代增加變異性和異質(zhì)性，綜合雙親的優(yōu)良性狀，產(chǎn)生某些雙親所沒(méi)有的新性狀，使后代獲得較大的遺傳改良， 出現(xiàn)可利用的雜種優(yōu)勢(shì)，是魚(yú)類(lèi)育種的基本途徑之一，也是為培育出優(yōu)質(zhì)魚(yú)種的有效措施。 但這種技術(shù)用來(lái)固定目的基因需要較長(zhǎng)的時(shí)間。基因工程是20世紀(jì)70年代開(kāi)展起來(lái)的一項(xiàng)遺傳育種新技術(shù)。我國(guó)學(xué)者朱作言率先提出了魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因研究。由于魚(yú)類(lèi)具有它自身的有利條件，如屬較低等的脊椎動(dòng)物、可對(duì)多種高等脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)激素作出反應(yīng)，因此繼1985年第一批轉(zhuǎn)基因魚(yú)在中國(guó)問(wèn)世以后， 世界上許多國(guó)家相繼開(kāi)展了魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因研究。在短短幾年中，取得了很大的成績(jī)。我國(guó)是水產(chǎn)大國(guó)，而且又有魚(yú)類(lèi)核移植的良好基礎(chǔ)，在許多單位開(kāi)展了魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因研究，并取得較好成績(jī)?；蚬こ逃N是在目的基因及其決定的目標(biāo)性狀確定的情況下，將該基因分離出來(lái)，構(gòu)建表達(dá)載體后轉(zhuǎn)入到個(gè)體中，就可能使其遺傳性狀在短期內(nèi)轉(zhuǎn)給個(gè)體，可在短期內(nèi)確定具有目的基因的品系。因此，開(kāi)發(fā)一個(gè)可用于轉(zhuǎn)基因鯉開(kāi)發(fā)的新載體及其構(gòu)建方法將是解決生產(chǎn)實(shí)踐中育種時(shí)間長(zhǎng)的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是一種含有IGF2b基因的慢病毒載體的構(gòu)建方法，以解決針對(duì)目的基因生長(zhǎng)功能的實(shí)踐驗(yàn)證和轉(zhuǎn)基因魚(yú)開(kāi)發(fā)新方法的問(wèn)題。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)
一種含有IGF2b基因的慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟 獲取鯉的肝臟組織，提取RNA，后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)基因庫(kù)中公布的鯉IGF2b基因序列開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物；在目的片段的5’端和3’端設(shè)計(jì)內(nèi)切酶，測(cè)序檢測(cè)是IGF2b基因后， 用BamHI和NheI雙酶切含有IGF2b基因的PCR回收產(chǎn)物及載體pLenti6. 3- IRES-EGFP, 然后回收酶切后的載體pLenti6. 3- IRES-EGFP及IGF2b基因片段；將酶切回收的IGF2b基因片段與pLenti6. 3- IRES-EGFP連接，獲得含有IGMb基因的慢病毒載體。所述的鯉IGF2b基因開(kāi)放閱讀框的獲得包括從表達(dá)目的基因的鯉魚(yú)組織中，用 RT-PCR的方式從cDNA上擴(kuò)增出IGMb基因，并克隆到pMD-lOTsimple載體進(jìn)行測(cè)序鑒定， 其中所用上下游引物如下上游引物
5，—>3' GATCATACGGATCCGCCACCATGGAGGACCAACTAAAACATCA ；下游引物5，—>3' CAGT TGACGCTAGCTCATCGACTCTGTGCAAAAAGG ；在目的序列的5'端添加BamHI酶切位點(diǎn)，3'端添加 NheI酶切位點(diǎn)。本發(fā)明的有益效果為含有鯉IGF2b基因的慢病毒載體的病毒液不僅能感染分裂細(xì)胞，且能轉(zhuǎn)染終末分化細(xì)胞和非分裂細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞、干細(xì)胞、肌纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜和肝細(xì)胞等)，并且使整合于靶細(xì)胞基因組的目的基因能夠長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)，初期感染可觀(guān)察綠色熒光來(lái)確定感染與否；是獲取轉(zhuǎn)基因鯉的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，可在短期內(nèi)確定具有目的基因的品系，縮短魚(yú)類(lèi)育種時(shí)間。
具體實(shí)施例方式1、獲取鯉的肝臟組織，提取RNA，后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)基因庫(kù)中公布的鯉IGF2b 基因序列開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物用RT-PCR的方式從cDNA上擴(kuò)增出IGF2b基因，并克隆到 pMD-19Tsimple載體進(jìn)行測(cè)序鑒定；其中，所用上下游引物如下
上游引物
權(quán)利要求
1.一種含有IGF2b基因的慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟獲取鯉的肝臟組織，提取RNA，后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)基因庫(kù)中公布的鯉IGF2b基因序列開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物；在目的片段的5’端和3’端設(shè)計(jì)內(nèi)切酶，測(cè)序檢測(cè)是IGF2b基因后，用BamHI和NheI 雙酶切含有IGF2b基因的PCR回收產(chǎn)物及載體pLenti6. 3- IRES-EGFP，然后回收酶切后的載體 pLenti6. 3- IRES-EGFP 及 IGF2b 基因片段；將酶切回收的IGMb基因片段與pLenti6. 3- IRES-EGFP連接，獲得含有IGMb基因的慢病毒載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有IGF2b基因的慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的鯉IGF2b基因開(kāi)放閱讀框的獲得包括從表達(dá)目的基因的鯉魚(yú)組織中，用RT-PCR的方式從cDNA上擴(kuò)增出IGF2b基因，并克隆到pMD-lOTsimple載體進(jìn)行測(cè)序鑒定，其中所用上下游引物如下上游引物5' —>3' GATCATACGGATCCGCCACCATGGAGGACCAACTAAAACATCA ；下游引物5，一>3，CAGT TGACGCTAGCTCATCGACTCTGTGCAAAAAGG ；在目的序列的5'端添加BamHI酶切位點(diǎn)，3’端添加 NheI酶切位點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有IGF2b基因的慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟獲取鯉的肝臟組織，提取RNA，后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)基因庫(kù)中公布的鯉IGF2b基因序列開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物；在目的片段的5’端和3’端設(shè)計(jì)內(nèi)切酶，測(cè)序檢測(cè)是IGF2b基因后，用BamHI和NheI雙酶切含有IGF2b基因的PCR回收產(chǎn)物及載體pLenti6.3-IRES-EGFP，然后回收酶切后的載體pLenti6.3-IRES-EGFP及IGF2b基因片段；將酶切回收的IGF2b基因片段與pLenti6.3-IRES-EGFP連接，獲得含有IGF2b基因的慢病毒載體。本發(fā)明的有益效果為無(wú)毒性且不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，安全性較好，不僅能感染分裂細(xì)胞，且能轉(zhuǎn)染終末分化細(xì)胞和非分裂細(xì)胞；是獲取轉(zhuǎn)基因鯉的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，可在短期內(nèi)確定具有目的基因的品系，縮短魚(yú)類(lèi)育種時(shí)間。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102250912SQ20111015536
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者徐跑, 董在杰, 袁新華 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心